Summary

إعادة بناء الورم الأرومي الشبكي البشري في المختبر

Published: October 11, 2022
doi:

Summary

وصفنا طريقة لتوليد الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) عن طريق إدخال طفرات RB1 ثنائية الأليل في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC). يمكن أيضا استزراع خطوط خلايا RB بنجاح باستخدام RB المعزول في طبق.

Abstract

RB البشري هو سرطان الأطفال ، وهو قاتل إذا لم يتم إعطاء أي علاج. نظرا لأن RB ينشأ من السلائف المخروطية ، وهو أمر نادر نسبيا في نماذج القوارض ، وفي الوقت نفسه فيما يتعلق بالاختلافات بين الأنواع بين البشر والقوارض ، فإن نموذج المرض المشتق من البشر أكثر فائدة للكشف عن آليات RB البشرية والبحث عن أهداف العلاج. هنا ، يصف البروتوكول توليد خطين hESC معدلين جينيا مع طفرة نقطة RB1 ثنائية الأليل (RB1 Mut / Mut) وطفرة خروج المغلوب RB1 (RB1/-) ، على التوالي. أثناء عملية تطور الشبكية ، لوحظ تكوين RB. يتم إنشاء خطوط خلايا RB أيضا عن طريق الفصل عن عضويات RB. إجمالا ، من خلال التمييز بين خطوط hESC المحررة جينيا في عضويات الشبكية باستخدام بروتوكول التمايز المشترك 2D و 3D ، نجحنا في إعادة بناء RB البشري في طبق وحددنا أصله المخروطي. ومن شأنه أن يوفر نموذجا مرضيا مفيدا لمراقبة نشأة الورم الأرومي الشبكي وانتشاره ونموه بالإضافة إلى تطوير عوامل علاجية جديدة.

Introduction

الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) هو ورم نادر ومميت مشتق من السلائف المخروطية الشبكية1،2،3 ، وهو النوع الأكثر شيوعا من الأورام الخبيثة داخل العين في مرحلة الطفولة4. التعطيل متماثل الزيجوت لجين RB1 هو الآفة الجينية البادئة في RB5. ومع ذلك ، فإن الفئران ذات طفرات RB1 تفشل في تشكيل ورم الشبكية2. على الرغم من أن أورام الفئران يمكن أن تتولد مع مزيج من طفرات Rb1 والتعديلات الجينية الأخرى ، إلا أنها لا تزال تفتقر إلى ميزات RB6 البشرية. بفضل تطور التمايز العضوي في شبكية العين ، يمكن الحصول على RB المشتق من hESC ، والذي يعرض أحرف RB1 البشرية.

تم إنشاء العديد من البروتوكولات للتمايز العضوي في شبكية العين في العقد الماضي ، بما في ذلك 2D7 و 3D8 ومزيج من 2D و 3D9. الطريقة المستخدمة هنا لتوليد RB البشري هي توحيد الثقافة الملتصقة والثقافة العائمة9. من خلال التمييز بين hESC المتحور RB1 إلى عضويات شبكية العين ، يتم اكتشاف تكوين RB في حوالي اليوم 45 ، ثم يتكاثر بسرعة في حوالي اليوم 60. في اليوم 90 ، يمكن عزل RBs وتوليد خط خلية RB ؛ علاوة على ذلك ، يحيط RB بجميع عضويات الشبكية تقريبا في اليوم 120.

RB المشتق من hESC هو نموذج مبتكر لاستكشاف أصل RB وتكوينه وعلاجاته. في هذا البروتوكول ، يتم وصف توليد hESC لتحرير الجينات ، وتمايز RB ، وتوصيف RB بالتفصيل.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية لمستشفى بكين تونغرن ، جامعة العاصمة الطبية. يتم الحصول على H9 hESCs من معهد أبحاث WiCell. 1. جيل من RB1 hESC المتحور ناقل استهداف CRISPR / Cas9 للضربة القاضية (KO) ل RB1. تصميم زوج من sgRNA. لاستئصال RB1 ، استهدف أو?…

Representative Results

يتم توضيح إجراء توليد RB في الشكل 1 ، الذي يجمع بين الثقافة الملتصقة والعائمة. كان من الممكن حصاد RB البشري من RB1-KO hESC ، والحصول على خط خلية RB عن طريق عزل المواد العضوية RB. هنا ، يوفر البروتوكول تفاصيل التمايز في مراحل مختلفة (الشكل 2). تتشكل ال…

Discussion

يحدث الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) بسبب تعطيل RB1 واختلال بروتين Rb. في هذا البروتوكول ، يعد RB1-KO hESC الخطوة المحورية لتوليد RB في طبق. بينما حتى مع RB1/- hESC ، من الممكن عدم وجود تكوين RB بسبب طرق تمايز الشبكيةالعضوية 10. في هذا البروتوكول ، يعد الانتقال من الثقافة ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر فريق 502 على كل المساعدة. يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (Z200014) والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0105300).

Materials

2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Anti-ARR3 Sigma HPA063129 Antibody
Anti-CRX (M02) Abnove ABN-H00001406-M02 Antibody
Anti-Ki67 Abcam  ab15580 Antibody
Anti-Syk (D3Z1E) Cell Signaling Technology 13198 Antibody
BbsI NEB R3539S Restriction enzymes
Dispase (1U/mL) Stemcell Technologies 7923
DMEM basic Gibco 10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX Gibco 10565-042
DMSO Sigma D2650
DPBS Gibco C141905005BT
EDTA Thermo 15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells Biological Industry 04-002-1A
Glutamine Gibco 35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) Gibco 11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) Sigma M7145
Neurobasal Medium Gibco 21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S Lonza V4XP-3032 Nucleofection kit
Pen Strep Gibco 15140-122
Puromycin Gene Operation ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium Nuwacell RP01001 ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix BD 356231 Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme Gibco 12563-011 TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit QIAGEN 75144
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74104
Supplement A Life Technologies 17502-048 N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B Life Technologies 17105-041 B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase Life Technologies EK0032
Taurine Sigma T-8691-25G
Y-27632 2HCl Selleck S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro Addgene 42230
Nucleofector 4D Lonza
RPMI Sigma R0883-500ML

References

  1. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  2. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
  3. Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
  4. Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
  5. Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
  6. Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
  7. Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
  8. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  9. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  10. Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
  11. Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
  12. Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
  13. Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, X., Jin, Z. Reconstruct Human Retinoblastoma In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e62629, doi:10.3791/62629 (2022).

View Video