إعادة بناء الورم الأرومي الشبكي البشري في المختبر
Summary
وصفنا طريقة لتوليد الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) عن طريق إدخال طفرات RB1 ثنائية الأليل في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC). يمكن أيضا استزراع خطوط خلايا RB بنجاح باستخدام RB المعزول في طبق.
Abstract
RB البشري هو سرطان الأطفال ، وهو قاتل إذا لم يتم إعطاء أي علاج. نظرا لأن RB ينشأ من السلائف المخروطية ، وهو أمر نادر نسبيا في نماذج القوارض ، وفي الوقت نفسه فيما يتعلق بالاختلافات بين الأنواع بين البشر والقوارض ، فإن نموذج المرض المشتق من البشر أكثر فائدة للكشف عن آليات RB البشرية والبحث عن أهداف العلاج. هنا ، يصف البروتوكول توليد خطين hESC معدلين جينيا مع طفرة نقطة RB1 ثنائية الأليل (RB1 Mut / Mut) وطفرة خروج المغلوب RB1 (RB1–/-) ، على التوالي. أثناء عملية تطور الشبكية ، لوحظ تكوين RB. يتم إنشاء خطوط خلايا RB أيضا عن طريق الفصل عن عضويات RB. إجمالا ، من خلال التمييز بين خطوط hESC المحررة جينيا في عضويات الشبكية باستخدام بروتوكول التمايز المشترك 2D و 3D ، نجحنا في إعادة بناء RB البشري في طبق وحددنا أصله المخروطي. ومن شأنه أن يوفر نموذجا مرضيا مفيدا لمراقبة نشأة الورم الأرومي الشبكي وانتشاره ونموه بالإضافة إلى تطوير عوامل علاجية جديدة.
Introduction
الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) هو ورم نادر ومميت مشتق من السلائف المخروطية الشبكية1،2،3 ، وهو النوع الأكثر شيوعا من الأورام الخبيثة داخل العين في مرحلة الطفولة4. التعطيل متماثل الزيجوت لجين RB1 هو الآفة الجينية البادئة في RB5. ومع ذلك ، فإن الفئران ذات طفرات RB1 تفشل في تشكيل ورم الشبكية2. على الرغم من أن أورام الفئران يمكن أن تتولد مع مزيج من طفرات Rb1 والتعديلات الجينية الأخرى ، إلا أنها لا تزال تفتقر إلى ميزات RB6 البشرية. بفضل تطور التمايز العضوي في شبكية العين ، يمكن الحصول على RB المشتق من hESC ، والذي يعرض أحرف RB1 البشرية.
تم إنشاء العديد من البروتوكولات للتمايز العضوي في شبكية العين في العقد الماضي ، بما في ذلك 2D7 و 3D8 ومزيج من 2D و 3D9. الطريقة المستخدمة هنا لتوليد RB البشري هي توحيد الثقافة الملتصقة والثقافة العائمة9. من خلال التمييز بين hESC المتحور RB1 إلى عضويات شبكية العين ، يتم اكتشاف تكوين RB في حوالي اليوم 45 ، ثم يتكاثر بسرعة في حوالي اليوم 60. في اليوم 90 ، يمكن عزل RBs وتوليد خط خلية RB ؛ علاوة على ذلك ، يحيط RB بجميع عضويات الشبكية تقريبا في اليوم 120.
RB المشتق من hESC هو نموذج مبتكر لاستكشاف أصل RB وتكوينه وعلاجاته. في هذا البروتوكول ، يتم وصف توليد hESC لتحرير الجينات ، وتمايز RB ، وتوصيف RB بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحدث الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) بسبب تعطيل RB1 واختلال بروتين Rb. في هذا البروتوكول ، يعد RB1-KO hESC الخطوة المحورية لتوليد RB في طبق. بينما حتى مع RB1–/- hESC ، من الممكن عدم وجود تكوين RB بسبب طرق تمايز الشبكيةالعضوية 10. في هذا البروتوكول ، يعد الانتقال من الثقافة ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فريق 502 على كل المساعدة. يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (Z200014) والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
