Summary
وصفنا طريقة لتوليد الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) عن طريق إدخال طفرات RB1 ثنائية الأليل في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC). يمكن أيضا استزراع خطوط خلايا RB بنجاح باستخدام RB المعزول في طبق.
Abstract
RB البشري هو سرطان الأطفال ، وهو قاتل إذا لم يتم إعطاء أي علاج. نظرا لأن RB ينشأ من السلائف المخروطية ، وهو أمر نادر نسبيا في نماذج القوارض ، وفي الوقت نفسه فيما يتعلق بالاختلافات بين الأنواع بين البشر والقوارض ، فإن نموذج المرض المشتق من البشر أكثر فائدة للكشف عن آليات RB البشرية والبحث عن أهداف العلاج. هنا ، يصف البروتوكول توليد خطين hESC معدلين جينيا مع طفرة نقطة RB1 ثنائية الأليل (RB1 Mut / Mut) وطفرة خروج المغلوب RB1 (RB1-/-) ، على التوالي. أثناء عملية تطور الشبكية ، لوحظ تكوين RB. يتم إنشاء خطوط خلايا RB أيضا عن طريق الفصل عن عضويات RB. إجمالا ، من خلال التمييز بين خطوط hESC المحررة جينيا في عضويات الشبكية باستخدام بروتوكول التمايز المشترك 2D و 3D ، نجحنا في إعادة بناء RB البشري في طبق وحددنا أصله المخروطي. ومن شأنه أن يوفر نموذجا مرضيا مفيدا لمراقبة نشأة الورم الأرومي الشبكي وانتشاره ونموه بالإضافة إلى تطوير عوامل علاجية جديدة.
Introduction
الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) هو ورم نادر ومميت مشتق من السلائف المخروطية الشبكية1،2،3 ، وهو النوع الأكثر شيوعا من الأورام الخبيثة داخل العين في مرحلة الطفولة4. التعطيل متماثل الزيجوت لجين RB1 هو الآفة الجينية البادئة في RB5. ومع ذلك ، فإن الفئران ذات طفرات RB1 تفشل في تشكيل ورم الشبكية2. على الرغم من أن أورام الفئران يمكن أن تتولد مع مزيج من طفرات Rb1 والتعديلات الجينية الأخرى ، إلا أنها لا تزال تفتقر إلى ميزات RB6 البشرية. بفضل تطور التمايز العضوي في شبكية العين ، يمكن الحصول على RB المشتق من hESC ، والذي يعرض أحرف RB1 البشرية.
تم إنشاء العديد من البروتوكولات للتمايز العضوي في شبكية العين في العقد الماضي ، بما في ذلك 2D7 و 3D8 ومزيج من 2D و 3D9. الطريقة المستخدمة هنا لتوليد RB البشري هي توحيد الثقافة الملتصقة والثقافة العائمة9. من خلال التمييز بين hESC المتحور RB1 إلى عضويات شبكية العين ، يتم اكتشاف تكوين RB في حوالي اليوم 45 ، ثم يتكاثر بسرعة في حوالي اليوم 60. في اليوم 90 ، يمكن عزل RBs وتوليد خط خلية RB ؛ علاوة على ذلك ، يحيط RB بجميع عضويات الشبكية تقريبا في اليوم 120.
RB المشتق من hESC هو نموذج مبتكر لاستكشاف أصل RB وتكوينه وعلاجاته. في هذا البروتوكول ، يتم وصف توليد hESC لتحرير الجينات ، وتمايز RB ، وتوصيف RB بالتفصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية لمستشفى بكين تونغرن ، جامعة العاصمة الطبية. يتم الحصول على H9 hESCs من معهد أبحاث WiCell.
1. جيل من RB1 hESC المتحور
- ناقل استهداف CRISPR / Cas9 للضربة القاضية (KO) ل RB1.
- تصميم زوج من sgRNA. لاستئصال RB1 ، استهدف أول إكسون من هذا الجين. تسلسل التمهيدي الأمامي هو CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG ، وتسلسل التمهيدي العكسي هو AAACCCGAAAAAACGGCCCCCCCCGC.
ملاحظة: بالنسبة لطفرة RB1 المحددة ، يلزم أيضا قالب تم إصلاحه. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام خط خلية RB1-KO كمثال. - اهضم 1 ميكروغرام من pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro مع إنزيمات تقييد BbsI (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- تنقية البلازميدات المهضومة باستخدام مجموعة تنقية وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
ملاحظة: يمكن تنظيف التفاعلات الأنزيمية مباشرة بدون هلام الأغاروز باستخدام مجموعة التنقية (انظر جدول المواد). - الفسفرة والتلدين لكل زوج من oligos باستخدام T4 polynucleotide kinase (PNK) (جدول المواد) مع تفاعل يتكون من 1 ميكرولتر من oligo1 (100 μM) ، 1 ميكرولتر من oligo2 (100 μM) ، 1 ميكرولتر من 10x T4 Ligation Buffer ، 6.5 ميكرولتر من ddH2O ، و 0.5 ميكرولتر من T4 PNK.
ملاحظة: البادئات الأمامية والخلفية في الخطوة 1.1.1 هي زوج من oligos. فسفرة وتليين oligos في دراجة حرارية باستخدام المعلمات التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ انحدر إلى 25 درجة مئوية عند 5 درجات مئوية في الدقيقة. - قم بتخفيف oligos المفسفرة والملدنة 200 مرة بإضافة 1 ميكرولتر من كاشف oligo إلى 199 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز في درجة حرارة الغرفة (RT).
- قم بإعداد تفاعل الربط واحتضانه في RT لمدة 10 دقائق عن طريق خلط ما يلي: 50 نانوغرام من البلازميد المهضوم Bbs1 من الخطوة 1.1.3 ، 1 ميكرولتر من oligo duplex من الخطوة 1.1.5 ، 5 ميكرولتر من محلول الربط 2x ، 1 ميكرولتر من ligase ، وأعلى ما يصل إلى 10 ميكرولتر باستخدام الماء الخالي من النيوكلياز.
- تحويل خليط الربط وتسلسل المستعمرات الموجبة للخطوة التالية.
ملاحظة: استخدم U6 التمهيدي للأمام أو للخلف للتسلسل.- قم بإذابة الخلايا المختصة على الجليد.
- خذ 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
- أضف 1 ميكرولتر من خليط الربط من الخطوة 1.1.6 إلى الخلايا المختصة.
- امزج بلطف عن طريق سحب الأنبوب لأعلى ولأسفل ثلاث مرات.
ملاحظة: لا دوامة. - ضع الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة.
- صدمة الحرارة الخليط عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية.
- أضف 950 ميكرولتر من مرق لوريا بيرتاني (LB) بدرجة حرارة الغرفة بدون مضاد حيوي إلى الأنبوب.
- ضع الأنبوب في شاكر عند 300 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- قم بتسخين ألواح LB (الببتون ، الببتون من الكازين ، كلوريد الصوديوم ، أجار أجار ، والأمبيسلين) إلى 37 درجة مئوية مقدما.
- انشر 50-100 ميكرولتر من الخلايا وخليط الربط على الألواح في RT.
- احتضان الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
- التقط 12 مستعمرة من اللوحة وانقلها إلى وسط LB مع الأمبيسلين. ضع الوسط على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة.
- استخدم 1 ميكرولتر من محلول البكتيريا (من الخطوة 1.1.7.12) كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل وحدد المستعمرات الإيجابية.
- تسلسل المستعمرات الموجبة بواسطة البادئات U6 ، استخدم المستعمرة مع تسلسل sgRNA المصمم في الخطوة التالية.
- استخرج البلازميد باستخدام مجموعة ميدي (انظر جدول المواد).
ملاحظة: جودة وكمية البلازميد باستخدام مجموعة صغيرة ليست كافية لتجربة nucleofection التالية. مجموعة ميدي أو ماكسي أكثر ملاءمة من المجموعة الصغيرة.
- تصميم زوج من sgRNA. لاستئصال RB1 ، استهدف أول إكسون من هذا الجين. تسلسل التمهيدي الأمامي هو CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG ، وتسلسل التمهيدي العكسي هو AAACCCGAAAAAACGGCCCCCCCCGC.
- ثقافة HESC والنواة.
ملاحظة: قم بتسخين جميع الكواشف إلى RT.- قم بإذابة 1 × 106 خلايا H9 في صفيحة 6 آبار مغلفة مسبقا مع 10 ميكرومتر Y-27632 (مثبط ROCK) و 2 مل من وسط استزراع ncEpic-hiPSC / hESC الجديد.
ملاحظة: قم بتغطية اللوحة المكونة من 6 آبار بمصفوفة غشاء الطابق السفلي المخفض بعامل نمو بنسبة 1٪ لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. - في اليوم التالي ، قم بإزالة المادة الطافية ، وشطف الخلايا بمحلول ملحي 1x Dulbecco المخزن بالفوسفات (DPBS) ، ثم أضف 2 مل من وسط استزراع ncEpic-hiPSC / hESC الجديد.
- قم بتغيير الوسط كل يوم باستخدام 2 مل من وسط زراعة ncEpic-hiPSC / hESC الجديد في الأيام 3-5 التالية حتى تنمو الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء.
- المرور مرة أو مرتين لضبط حالة hESC.
ملاحظة: أسهل طريقة لتحديد حالة hESC هي التشكل. - استزرع خلايا H9 غير المتمايزة في صفيحة ذات 6 آبار حتى تصل إلى 80٪ من التقاء.
- قم بتغيير الوسط 2 ساعة قبل النواة باستخدام 2 مل من وسط استزراع ncEpic-hiPSC / hESC الطازج الممزوج ب 10 ميكرومتر من Y-27632 وطلاء بئر واحد من لوحة من 12 بئرا باستخدام مصفوفة الغشاء القاعدي المختزل بعامل نمو 1٪.
- نضح الوسط وشطف مع 1 مل من DPBS prewarmed.
- قم بإزالة DPBS واحتضان 1 مل من إنزيم تفكك الخلايا (انظر جدول المواد) لمدة 3.5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- أضف 1 مل من وسط ثقافة ncEpic-hiPSC / hESC الجديد إلى الخلايا والماصة مرتين لجعل خلايا H9 في تعليق خلية واحدة.
- أخرج 100 ميكرولتر من الخليط لعد الخلايا وانقل الباقي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 2 مل أخرى من وسط ثقافة ncEpic-hiPSC / hESC بالداخل.
- جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حوالي 2 × 106 خلايا في حجم تفاعل 100 ميكرولتر. وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، قم بتحسين حجم الخلايا والبلازميدات والنواة وظروف التفاعل. انظر جدول المواد لنظام nucleofection المستخدم في هذا البروتوكول.
ملاحظة: بشكل عام ، لا يسمح بالفقاعات أثناء النواة. - بعد النقل ، انقل الخلايا إلى لوحة 12 بئرا المطلية مسبقا ، واستكملها ب 1.5 مل من وسط ثقافة ncEpic-hiPSC / hESC و 10 ميكرومتر من Y-27632 ، ثم استزراع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
- تغيير الوسيط يوميا. بعد 48 ساعة ، أضف 2 ميكروغرام / مل من البوروميسين لاختيار الخلية حوالي أسبوع واحد.
ملاحظة: تموت العديد من الخلايا خلال أول 3 أيام. قد تتكاثر الخلايا المتبقية وتتولد في مستعمرات في الأسبوع التالي بعد اختيار البوروميسين. في أسبوع الاختيار ، تأكد من أن الوسيط يحتوي دائما على 2 ميكروغرام / مل من البوروميسين. - اختر المستعمرات يدويا تحت المجهر.
ملاحظة: مورفولوجيا المستعمرة هي نفسها مستعمرة hES. قطع المستعمرات إلى قطع (2-6 قطع لكل مستعمرة) بطرف ماصة أبيض / عادي 10 ميكرولتر في الوسط ونقل مستعمرة واحدة إلى بئر واحد مطلي مسبقا من لوحة 12 بئر. - أولا ، حدد طفرات RB1 والمواقف غير المستهدفة (الجدول 1) ، ثم تعدد القدرات لتوصيف خط خلية RB1 بالضربة القاضية H9.
ملاحظة: الكشف عن طفرات RB1 والمواقف خارج الهدف باستخدام تسلسل PCR و sanger. تحديد علامات تعدد القدرات بواسطة RT-PCR والتألق المناعي.
- قم بإذابة 1 × 106 خلايا H9 في صفيحة 6 آبار مغلفة مسبقا مع 10 ميكرومتر Y-27632 (مثبط ROCK) و 2 مل من وسط استزراع ncEpic-hiPSC / hESC الجديد.
2. توليد الورم الأرومي الشبكي البشري
- صيانة RB1-KO hESC.
- استزراع خلايا H9 المحررة جينيا في عامل النمو يقلل من مصفوفة الغشاء القاعدي المطلي بلوحة 6 آبار مع 2 مل من وسط ثقافة ncEpic-hiPSC / hESC وتغيير الوسيط كل يوم.
- المرور باستخدام مخزن EDTA المؤقت لمدة 3.5 دقيقة عند 37 درجة مئوية أو 5 دقائق عند RT.
ملاحظة: المخزن المؤقت EDTA هو خليط من 1x DPBS و 5 mM EDTA و 0.9 مجم / مل من كلوريد الصوديوم.
- تمايز خلايا الشبكية.
ملاحظة: تحضير الوسيط I قبل التمايز. لتحضير الوسط الأول ، امزج 24.5 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / خليط المغذيات F-12 (F12) - الجلوتامين (1x) ، 24.5 مل من الوسط القاعدي العصبي ، 250 ميكرولتر من الملحق A 100x ، 500 ميكرولتر من الملحق B 50x ، 0.1 mM ß-mercaptoethanol ، و 250 ميكرولتر من 100x L-glutamine. سخن جميع الخلطات إلى RT قبل الاستخدام.- قم بتنمية RB1-KO hESC إلى التقاء 80٪ في بئر واحد من لوحة 6 آبار.
- قم بإزالة الوسط وشطف الخلايا ب 1 مل من 1x DPBS.
- ارفع مستعمرات الخلايا باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تحقق من مستعمرات الخلايا تحت المجهر. عادة ، يستغرق الأمر 5 دقائق حتى تتدحرج حافة المستعمرات. - قم بشفط المخزن المؤقت المتناثر وشطف الخلايا برفق مرة واحدة باستخدام 1 مل من 1x DPBS.
- أضف 1 مل من Medium I إلى البئر.
- قطع المستعمرات إلى قطع (6-9 قطع لكل مستعمرة) مع 10 ميكرولتر أبيض / طرف ماصة عادي في الوسط.
ملاحظة: بشكل عام ، تنفصل حوالي 60٪ -70٪ من الخلايا عن البئر. استخدم مكشطة الخلايا لكشط الخلايا المتبقية في الوسط. - احصد جميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنبوب سعة 15 مل عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
- اترك حوالي 50 ميكرولتر من المادة الطافية لتفريق الخلايا في الوسط ، ثم امزج الخلايا مع 250 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي المختزلة بعامل النمو عن طريق التحريض اللطيف.
ملاحظة: حافظ على مصفوفة الغشاء القاعدي لعامل النمو المختزل إما عند 4 درجات مئوية أو على الجليد قبل الاستخدام. إذا تم اقتباسه وتخزينه في -20 درجة مئوية ، ضعه عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام. - احتفظ بأنبوب 15 مل مع الخلايا المعلقة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: تأكد من أن الخلايا وعامل النمو المختزل مصفوفة الغشاء القاعدي تشكل مادة هلامية صلبة. - أضف 1 مل من Medium I إلى أنبوب 15 مل ، ثم اسكب الجل المتصلب برفق مرتين إلى ثلاث مرات لتفريق الكتلة باستخدام ماصة سعة 1 مل.
- أضف 9 مل من المتوسط I وانقل معلق الخلية إلى طبق زراعة الخلايا 10 سم.
- انقل الطبق إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 وحدد اليوم على أنه اليوم 0.
- افحص الخلايا باستخدام المجهر في اليوم 1.
ملاحظة: يمكن ملاحظة الآلاف من الخراجات المجوفة في الطبق. في المتوسط ، لوحظت 3 إلى 4 أكياس في قطعة واحدة من الجل. - تغيير الوسيط في اليوم 5. اجمع المادة الطافية في أنبوب سعة 15 مل ، وانتظر حتى تستقر الخراجات في القاع ، ثم قم بإزالة الوسط واستبدله ب Medium I جديد.
ملاحظة: إذا أصبح الوسيط أصفر في اليوم 4 ، فقم بتغيير الوسيط في اليوم 4 ، وإلا في اليوم 5. أضف 10 مل من Medium I الطازج إلى الطبق الأصلي. المئات من الخراجات قد تعلقت بالفعل بسطح الثقافة. احتفظ بها هناك. - تفريق الخراجات في الأنبوب إلى طبقين 10 سم.
ملاحظة: تأكد من وجود 300 كيس على الأقل في الطبق. إذا لم تكن الخراجات متقاربة ، فلا تفصل الخراجات إلى أطباق أخرى ؛ أعدهم إلى الطبق الأصلي 10 سم. - في اليوم 7 ، تلتصق معظم الخراجات (فوق 95٪) بالطبق ، وتنتشر ، وتشكل مستعمرات ملتصقة.
ملاحظة: في وقت مبكر من اليوم 3 ، يمكن ملاحظة المستعمرات الملتصقة. - في اليوم 10 ، قم بتغيير الوسيط باستخدام Medium الطازج I. تأكد من أن جميع الخراجات متصلة بالطبق.
- قم بإعداد Medium II قبل الخطوة التالية عن طريق خلط ما يلي: 36 مل من DMEM ، 12 مل من F12 ، 2٪ من الملحق B (v / v) ، 0.1 mM MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA).
- تأكد من انتشار الخلايا في اليوم 13-17. قم بتنفيذ الخطوة التالية في اليوم 15 عندما تنتشر الخلايا ولكن لا تتفاعل مع المستعمرات المجاورة.
- شطف الخلايا مرة واحدة مع 1 مل من DPBS وإضافة 1 مل من محلول dispase لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: في غضون 5 دقائق ، ترتفع حافة الخلايا. - قم بإزالة المخزن المؤقت dispase وشطف الثقافات برفق باستخدام 1 مل من 1x DPBS.
- أضف 10 مل من Medium II إلى كل طبق 10 سم وثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
- تنفصل الثقافات الملتصقة تلقائيا بعد 24 ساعة وتتجمع في عضويات شبكية العين.
ملاحظة: العديد من الخلايا التي لا تشكل المواد العضوية سوف تموت في الأيام 2 التالية. - بعد ثلاثة أيام من الانفصال ، اجمع الخلايا من طبق زراعة الخلايا واترك الكائنات العضوية تستقر في أنبوب سعة 15 مل.
- قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب وانقل المواد العضوية إلى طبق جديد غير ملتصق (طبق بتري) مع 10 مل من Medium II للأيام الأربعة التالية.
- تحضير Medium III عن طريق خلط DMEM: F12 بنسبة 3: 1 (v / v) ، 2٪ مكمل B (v / v) ، 0.1 mM MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 8٪ مصل بقري جنيني (FBS) (v / v) ، 100 ميكرومتر من التورين ، و 2 ملي مول جلوتامين.
- بعد أسبوع من الانفصال ، قم بتغيير الوسيط إلى المتوسط الثالث.
- من هذا اليوم فصاعدا ، قم بزراعة المواد العضوية في Medium III وقم بتحديث الوسط مرتين في الأسبوع.
- إنشاء خط خلية RB.
ملاحظة: يتم تسخين جميع الكواشف مسبقا في RT.- في اليوم 90 ، تشمل RBs (80٪ -90٪) عضويات الشبكية. لذلك ، اختر عضويات RB لمدة 90 يوما لتوليد خط خلية RB.
- قم بإعداد وسيط 1640 عن طريق خلط وسيط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) -1640 مع 10٪ FBS.
- قطع RB إلى قطع (20-25 قطعة لكل RB) بسكين المجهرية تحت المجهر في وسط RPMI-1640.
- قم بإزالة وسط RPMI-1640 وعالج القطع بنسبة 0.25٪ تربسين / EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- أضف وسيط RPMI-1640 لإنهاء التفاعل وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
- إزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1640 المتوسطة في طبق غير ملتصقة.
- خط خلية RB هو ثقافة عائمة. تغيير الوسط مرتين في الأسبوع وتمرير خلايا RB في غضون 2 أسابيع.
ملاحظة: معدل انتشار خلايا RB الأولية بطيء جدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم توضيح إجراء توليد RB في الشكل 1 ، الذي يجمع بين الثقافة الملتصقة والعائمة. كان من الممكن حصاد RB البشري من RB1-KO hESC ، والحصول على خط خلية RB عن طريق عزل المواد العضوية RB.
هنا ، يوفر البروتوكول تفاصيل التمايز في مراحل مختلفة (الشكل 2). تتشكل الكرات المجوفة في أول 3 أيام والتي تلتصق بسطح الاستزراع ثم تتوسع (الشكل 2A-E). من اليوم 15 فصاعدا ، ترتفع الخلايا وتكون الثقافة معلقة (الشكل 2F). في اليوم التالي للانفصال ، تتشكل عضويات شبكية العين ، وتكون الحافات الساطعة مرئية (الشكل 2G ، الأسهم السوداء). علاوة على ذلك ، من المحتمل أن تموت تلك الخلايا خارج الكائنات العضوية في الأسبوع التالي (الشكل 2G ، الأسهم البرتقالية). في اليوم 27 ، تكون بنية الحويصلة البصرية واضحة وحوالي 90٪ من الكائنات العضوية تعرض هذا الهيكل (الشكل 2H) ؛ يمكن التخلص من المواد العضوية بدون هذا الهيكل. يحدث الكشف الأول عن RB في اليوم 45 ، ثم يصبح واضحا في اليوم 50 (الشكل 2I). عندما ينمو إلى اليوم 90 ، يتم طي هياكل الحويصلة البصرية بشكل أساسي بواسطة RB (الشكل 2J). وفي الوقت نفسه ، يمكن عزل RB كخط خلية RB لمزيد من الثقافة (الشكل 2K). أكثر من 80٪ من عضويات الشبكية سيتم تغليفها بالكامل بواسطة RB في اليوم 105 (الشكل 2L). تظهر بشكل كبير تعبيرا عن Ki67 (علامة الانتشار) و SYK (علامة الجين الورمي) مقارنة بعضويات الشبكية المشتقة من H9 ، مما يشير إلى تكوين الورم في عضويات RB (الشكل 2M ، N). بالإضافة إلى ذلك ، يوضح التعبير العالي ل ARR3 (صانع السلائف المخروطية) و CRX (علامة سلائف المستقبلات الضوئية) في المواد العضوية RB أنها تنشأ من خلايا السلائف المخروطية (الشكل 2O ، P).
يخضع إجراء توليد RB بشكل أساسي لثلاث مراحل مع تغييرات مورفولوجية قبل تكوين RB ؛ هنا ، تقدم الدراسة النتائج الأدنى والمتفوقة في تلك المراحل (الشكل 3). من السهل تمييز hESC المتمايز وغير المتمايز (الشكل 3 أ ، ب) عن التشكل ، ويتم اختيار hESC غير المتمايز لتشكيل RB. في اليوم 5 ، يجب أن تولد كرة مجوفة (الشكل 3D) بدلا من الكرة الصلبة (الشكل 3C). يتم اشتقاق RB من عضويات الشبكية ، والتي تعرض بنية الحويصلة البصرية (الشكل 3F). لا يوجد RB من شأنه أن يولد في الكائنات العضوية السفلية (الشكل 3E).
الشكل 1: عرض تخطيطي لتمايز المواد العضوية RB. اليوم 0-اليوم 15 ، الخلايا هي ثقافة 2D في الوسط الأول ، وبعد اليوم 15 ، تكون الخلايا ثقافة معلقة. يتم تشكيل RB في حوالي اليوم 45. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: توليد RB وتوصيفه. (أ-ج) إجراء المرحلة المبكرة ، يتم رفع hESC لتشكيل الخراجات. تظهر الأسهم السوداء في (B) الحواف الملفوفة ل hESC بعد المعالجة المتقطعة. (د، ه) تلتصق التكيسات بالصفائح (د) ثم تتمدد (ه). (و) ترتفع الخلايا الملتصقة لتكوين العضويات الشبكية. تشير الأسهم السوداء إلى الحواف المدرفلة بعد المعالجة المتقطعة. (ز، ح) في الأيام الأولى من عضويات الشبكية بدون RB. (ط، ي) عضويات شبكية العين مع RB في اليوم 50 (I) واليوم 90 (J) ، الدوائر الخضراء تدل على أجزاء RB. (ك) خط خلايا RB المعزول من عضويات شبكية لمدة 90 يوما. (L) المواد العضوية RB في اليوم 105. (م-ف) صور التألق المناعي لعلامات الجين الورمي (M ، N) وعلامات المستقبلات الضوئية (O ، P). في A-L ، قضبان المقياس = 200 ميكرومتر ؛ في M-P ، أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة النتائج السلبية والإيجابية. الصور الأدنى والأعلى للتمايز في اليوم 0 (أ ، ب) ، اليوم 5 (ج ، د) ، واليوم 30 (ه ، و). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحدث الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) بسبب تعطيل RB1 واختلال بروتين Rb. في هذا البروتوكول ، يعد RB1-KO hESC الخطوة المحورية لتوليد RB في طبق. بينما حتى مع RB1-/- hESC ، من الممكن عدم وجود تكوين RB بسبب طرق تمايز الشبكيةالعضوية 10. في هذا البروتوكول ، يعد الانتقال من الثقافة الملتصقة إلى الثقافة العائمة أمرا ضروريا في عملية التمايز. كثافة الخراجات ، وأنواع الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، ومعدل الانتشار هي جميع المتغيرات التي من شأنها أن تؤثر على توقيت الانفصال. من المستحسن فصل الخلايا عندما يتم توسيعها ولكن لا تتفاعل معها المستعمرات المجاورة9. إذا كانت المستعمرات متجاورة ، فسيؤدي ذلك إلى عضويات شبكية متجاورة ومن ثم تقليل كفاءة التمايز.
باتباع الخطوات بشكل حاسم ، لن يكون من الصعب حصاد RB. ومع ذلك ، يمكن لهذه الطريقة فقط نمذجة RB مع التعطيل الثنائي ل RB1. بالنسبة لمرضى RB الموروثين ، الذين لديهم طفرة RB1 متغايرة الزيجوت ، فإنه غير قادر على تقليد عملية تكوين الورم مع طفرة RB1 غير المتجانسة 11. ومع ذلك ، فإنه لا يزال نموذج RB الأمثل لأنه الأقرب حاليا إلى تكوين الورم RB الفعلي في المرضى1. تشترك في نفس الأصل مع RBالأساسي 3،12 وتتغلب على اختلاف الأنواع في نماذج الفئران أو البيئة ثنائية الأبعاد المبسطة لخطوط الخلايا السرطانية الخالدة3،12،13.
يتم إنشاء RB البشري في طبق مشتق من ESC البشري باستخدام الطريقة الموصوفة ، ويظهر تشابها كبيرا مع RB الأساسي البشري. لذلك ، سيوفر منصة مثالية لتوضيح علم الأمراض الجزيئي ل RB البشري وفحص العوامل الدوائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفون ليسوا على علم بأي انتماءات أو عضويات أو تمويل أو حيازات مالية قد تؤثر على موضوعية هذه الدراسة.
Acknowledgments
نشكر فريق 502 على كل المساعدة. يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (Z200014) والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E.
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
