Summary
Die Zellzyklusanalyse mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) und Phospho-Histon H3 (pH3) Markierung ist ein mehrstufiges Verfahren, das eine umfangreiche Optimierung erfordern kann. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das alle Schritte für dieses Verfahren einschließlich Bildanalyse und Quantifizierung beschreibt, um Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen zu unterscheiden.
Abstract
Die In-vivo-Analyse der Zellzyklusprogression wird routinemäßig in Studien an Genen durchgeführt, die mitose- und DNA-Replikation regulieren. 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) wurde verwendet, um die replikative / S-Phasenprogression zu untersuchen, während Antikörper gegen Phospho-Histon H3 verwendet wurden, um mitotische Kerne und Zellen zu markieren. Eine Kombination beider Markierungen würde die Klassifizierung der Phasen G0/G1 (Gap Phase), S (replikativ) und M (mitotisch) ermöglichen und als wichtiges Instrument zur Bewertung der Auswirkungen von mitotischen Gen-Knockdowns oder Nullmutanten auf den Zellzyklusverlauf dienen. Die Reagenzien, die zur Markierung von EdU-markierten Zellen verwendet werden, sind jedoch mit mehreren sekundären Antikörper-Fluoreszenz-Tags nicht kompatibel. Dies erschwert die Immunfärbung, bei der primäre und markierte sekundäre Antikörper verwendet werden, um pH3-positive mitotische Zellen zu markieren. Dieses Papier beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die duale Markierung von EdU und pH3 in Drosophila-Larven-Neuralstammzellen, einem System, das umfassend zur Untersuchung mitotischer Faktoren verwendet wird. Zusätzlich wird ein Protokoll für die Bildanalyse und Quantifizierung bereitgestellt, um markierte Zellen in 3 verschiedene Kategorien zuzuordnen, G0 / G1, S, S >G2 / M (Progression von S nach G2 / M) und M-Phasen.
Introduction
Der Zellteilungszyklus umfasst eine G1-Phase (erste Gap-Phase), eine replikative/S-Phase, eine G2-Phase (zweite Gap-Phase) und eine M-Phase (mitotic). Durch diese Phasen durchläuft die Zelle dramatische Veränderungen in der zellulären Transkription, Translation und Reorganisation der Zytoskelettmaschinerie1,2. Als Reaktion auf Entwicklungs- und Umwelteinflüsse können Zellen vorübergehend aufhören, sich zu teilen und ruhen (G0) oder sich differenzieren und dauerhaft aufhören, sich zu teilen3. Andere Szenarien, wie DNA-Schäden, können eine vorzeitige Differenzierung oder Apoptose verursachen3,4. Die Reaktion auf solche Hinweise wird durch Zellzyklus-Checkpoints vermittelt, die als Überwachungssystem fungieren, um die Integrität wesentlicher zellulärer Prozesse sicherzustellen, bevor sich die Zelle zur nächsten Phase des Teilungszyklusverpflichtet 5. Daher müssen Studien zu Genen, die die DNA-Replikation, Checkpoints und mitotische Maschinerie regulieren, mögliche Zellzyklus-Progressionsfehler analysieren, die in mutierten Zellen oder beim siRNA-Knockdown dieser Gene auftreten können. Darüber hinaus können solche Analysen verwendet werden, um die allgemeine Zellgesundheit sowie zelluläre Reaktionen auf eine medikamentöse Behandlung zu testen.
5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) ist ein Thymidin-Analogon, das während der Replikation in die DNA eingebaut wird6. Diese Methode wurde ausgiebig verwendet, um Zellen in der S-Phase zu identifizieren. Die Zellen werden dann jedoch harten DNA-Denaturierungsverfahren unterzogen, um den Nachweis von BrdU durch die Verwendung von Anti-BrdU-Antikörpern zu ermöglichen6. Diese harte Behandlung kann zelluläre Epitope schädigen und eine weitere Charakterisierung der Probe durch Immunfärbung verhindern. Der Einbau von EdU und der anschließende Nachweis durch eine kupferkatalysierte "Klickreaktion" mit kleinen, zelldurchlässigen, fluoreszierend markierten Azidfarbstoffen macht harte Denaturierungsverfahrenüberflüssig 7. Diese Methode erwies sich daher als praktischere Alternative zur BrdU-Gründung.
Darüber hinaus wurde pH3 als zuverlässiger Marker für Mitotik/M-Phasenzellen beschrieben8. Histon H3 ist ein DNA-assoziiertes Kern-Histonprotein, das in der späten G2-Phase bis zur frühen M-Phase phosphoryliert und gegen Ende der Anaphase8dephosphoryliert wird. Mehrere kommerzielle Antikörper können verwendet werden, um pH3 mit Standard-Immunfärbungsprotokollen nachzuweisen. Eine Doppelfärbung von EdU und pH3 würde daher den Nachweis von Zellen sowohl in der S-Phase als auch in der M-Phase ermöglichen. Darüber hinaus würden Zellen in der G1- und frühen G2-Phase für keinen der Marker positiv färben.
Drosophila neurale Stammzellen oder Neuroblasten (NBs) bieten ein gut charakterisiertes Stammzellmodell, bei dem sich Zellen asymmetrisch teilen, um eine identische selbsterneuernde NB und eine Ganglien-Mutterzelle (GMC) zu produzieren, die zur Differenzierung bestimmt ist9. Darüber hinaus machen mehrere genetische Werkzeuge und NB-spezifische Antikörper dieses System für die genetische Manipulation und Lebendzellbildgebung geeignet. Folglich haben mehrere Studien NBs verwendet, um Gene zu untersuchen, die asymmetrische Divisionen und die Bestimmung des Zellschicksals regulieren9. Verschiedene Populationen von NBs existieren im zentralen Gehirn (CB) und im Optikuslappen (OL) des Larvengehirns9; Für die aktuelle Studie wurden CB-NBs verwendet. Diese CB-NBs der Larven im dritten Stadium sind große Zellen, die sich auch für die Untersuchung von Faktoren eignen, die die mitotische Spindelmontage regulieren. Ein Protokoll zur Analyse von Zellzyklus-Progressionsfehlern wäre ein wichtiges Werkzeug in solchen Studien.
In früher veröffentlichten Protokollen wurden kommerzielle Kits wie das Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit verwendet, das mehrere Reaktionskomponenten und Azidfarbstoffe enthält, die mit einer Vielzahl von Alexa Fluor-Farbstoffen für die EdU-Einarbeitung und -Detektion gekennzeichnet sind10. Die mit solchen Kits gelieferten Reagenzien sind jedoch nicht mit einigen fluoreszierenden Tags kompatibel, die häufig mit sekundären Antikörpern verwendet werden. Dieses EdU-Nachweiskit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit im Lieferumfang von Alexa Fluor 647-konjugiertem Azidfarbstoff) wurde in Drosophila Larven-NPBs im dritten Stadium getestet, und die Co-Färbung wurde mit Antikörpern gegen pH3 und Miranda, einem Marker für NBs, versucht. Darüber hinaus wurden Alexa Fluor 568- oder Cy3-markierte sekundäre Antikörper zum Nachweis der Miranda-Markierung auf der Plasmamembran von NBs11verwendet. Die erwartete Signalintensität und das Färbemuster (unveröffentlichte Ergebnisse) wurden jedoch nicht mit diesen sekundären Antikörpern beobachtet, wenn nach dem EdU-Nachweis eine Immunfärbung durchgeführt wurde.
Für die EdU-Einarbeitung erforderte das von Daul und Kollegen beschriebene Protokoll die Fütterung der Larven mit Kankel-White-Medium gemischt mit EdU und Bromphenolblau (BPB)10. Die Larven ernährten sich von der EdU- und BPB-stacheligen Nahrung, die bei der Einnahme im Larvendarm an ihrer blauen Farbe zu erkennen war. Obwohl diese Methode für den EdU-Einbau in Mms19 Loss-of-Function (Mms19P) Larven im dritten Stadium verwendet wurde, haben sich die Mms19P-Larven offenbar nicht verfüttert, da im Larvendarm kaum eine blaue Farbe nachgewiesen wurde (unveröffentlichte Ergebnisse). Die Mms19P-Larven zeigen drastische Entwicklungsdeformitäten und verhaften schließlich im dritten Stadium des Stadiums. Dies kann das Fressverhalten der Larven im dritten Stadium irgendwie beeinflussen und das EdU-Fütterungsprotokoll für solche Fälle ungeeignet machen.
Nach dem Studium der verfügbaren Literatur und der umfangreichen Arbeit an der Standardisierung wesentlicher Schritte wurde ein alternativer Ansatz für die EdU/pH3-Doppelmarkierung in Drosophila-NBs vorgeschlagen, die keine Fütterung von EdU an Larven erfordert. Eine frühere Studie verwendete eine duale EdU / pH3-Färbung, um den Zellzyklus in NBs zu analysieren, präsentierte jedoch kein detailliertes Protokoll4. Dies stellt eine unnötige Hürde für Labore dar, die versuchen, diese Methode zu implementieren. Darüber hinaus kann die Bewertung der Kompatibilität verschiedener Reagenzien mit dem EdU-Kit und die Durchführung weiterer Optimierungen ein zeitaufwändiger Prozess sein. Dieses Papier stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, das den Einbau von EdU in sezierte Larvengehirne und die Immunfärbung mit Anti-pH3-Antikörpern abdeckt, gefolgt von konfokaler Mikroskopie und Bildanalyse, um NBs vier verschiedenen Kategorien zuzuordnen: G0 / G1-Phase, S-Phase, S>G2 / M (Progression von S zu G2 / M) und M-Phase. Die zu optimierenden Schritte werden beschrieben und Tipps für die Bildanalyse großer Datensätze gegeben. Zusätzlich wird die EdU/pH3-Anzeige in Wildtyp-NBs analysiert und mit Mms19 P-NBs verglichen, von denen kürzlich berichtet wurde, dass sie eine Zellzyklusverzögerung zeigen11.
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Protocol
1. Vorbereitung von Reagenzien und Beständen für den Click-it EdU Assay
HINWEIS: Weitere Informationen zum Kit und zu den mit dem Kit gelieferten Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle und in Tabelle 1.
- Bringen Sie die Durchstechflaschen auf Raumtemperatur, bevor Sie die Lösungen vorbereiten.
- 10 mM EdU (Komponente A) Stammlösung unter Zugabe von 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO, Komponente C) herstellen. Gut mischen und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine funktionierende Lösung von Alexa Fluor 647-Azid (Komponente B) vor, indem Sie 70 μL DMSO (Komponente C) hinzufügen. Gut mischen und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine 1x-Lösung von Click-iT EdU-Reaktionspuffer (Komponente D) vor, indem Sie 4 ml dieser Lösung mit 36 mL entionisiertem Wasser mischen. Die restliche Lösung wird bei 2-6 °C gelagert.
- Machen Sie einen 10-fachen Vorrat (200 mg/ml) des Click-iT EdU-Pufferadditivs (Komponente F) durch Zugabe von 2 mL entionisiertem Wasser. Gut mischen und bei -20 °C lagern.
- Hoechst 33342 (Komponente G) bei 2-6 °C lagern. DMSO (Komponente C) in einem Exsikkator bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Handschuhe sollten verwendet werden, um DMSO und Hoechst zu handhaben.
2. Dissektion des dritten Larvengehirns im Stadium und EdU-Einbau
HINWEIS: Das Protokoll für Gehirndissektionen wurde zuvor beschrieben12. Stellen Sie vor Beginn der Dissektion sicher, dass ausreichende Mengen der EdU- und PFA-Lösungen hergestellt und aufgetaut sind, wie in den Abschnitten 2.6 und 3.1 beschrieben.
- Man bereitet 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor, indem man 25,6 g Na2 HPO4.7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl und 2 gKH2PO4 zu 1 L entionisiertem Wasser hinzufügt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und bereiten Sie anschließend eine 1-fache Lösung in entionisiertem Wasser vor.
- Fügen Sie Schneiders Dissektionsmedium (SM) zu zwei aufeinanderfolgenden Vertiefungen einer Glas(3 oder 9) Depressionsglas-Spotplatte hinzu. Fügen Sie 1x PBS zur nächsten aufeinanderfolgenden Depression hinzu.
- Pflücken Sie mit einer Pinzette wandernde Larven im dritten Stadium und legen Sie sie auf ein mit PBS benetztes Gewebe, um Fliegenfutterrückstände zu entfernen. Platzieren Sie die Larve in der Vertiefung mit PBS und dann in der aufeinanderfolgenden Depression mit SM.
- Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette 3/4 des Unterkörpers der Larve.
- Greifen Sie vorsichtig die Larvenmaulhaken mit einer Pinzette und halten Sie die Nagelhaut am anderen Ende mit der anderen Pinzette.
- Drehen Sie den Larvenkopf von innen nach außen, indem Sie die Mundhaken nach innen drücken und gleichzeitig das Gewebe am anderen Ende abziehen.
- Beobachten Sie das Larvengehirn mit angeschlossenen imaginären Bandscheiben. Entfernen Sie andere Gewebe, die am Gehirn befestigt sind, und übertragen Sie das Gehirn auf die nächste aufeinanderfolgende Depression mit SM.
- Tauen Sie die 10 mM EdU-Lagerlösung auf. Bereiten Sie eine 100-μM-Lösung vor, indem Sie diese 10 mM-Menge in SM verdünnen.
- 100 μL dieser 100 μM EdU+SM Lösung in eine weitere Vertiefung auf der Pyrexplatte geben. Inkubieren Sie ~ 5-10 sezierte Gehirne in 100 μL 100 μM EdU + SM-Lösung für 2 h bei 25 ° C.
HINWEIS: Da sich NBs einmal in ~ 2 h teilen, zielt dieses Protokoll darauf ab, einen vollständigen Zellzyklus zu analysieren. Verwenden Sie nur intakte Gehirne für weitere Schritte. Verwerfen Sie Gehirne, die während der Dissektion beschädigt werden.
3. Fixierung und Immunfärbung
- 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in einem Abzug herstellen.
- 4 g Paraformaldehydpulver zu 80 ml 1x PBS in einem auf einem Magnetrührer platzierten Becher hinzufügen und auf 60 °C erhitzen. Um PFA aufzulösen, fügen Sie einige Tropfen von 1 N NaOH hinzu. Überprüfen Sie den pH-Wert und stellen Sie bei Bedarf mit einigen Tropfen von 1 M HCl auf 7,0 ein.
- Stellen Sie die Lautstärke mit 1x PBS auf 100 ml ein. Die PFA-Lösung aliquotieren und bei 2-6 °C bis zu 1 Monat lagern. Fügen Sie der PFA-Lösung 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel (siehe Materialtabelle)hinzu, um große Gewebe wie das Larvengehirn effizient zu fixieren.
- Nach dem Einbau von EdU werden die Gehirne auf 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 4% PFA übertragen. Bei Raumtemperatur auf einem Nutator 15 min inkubieren. Tippen Sie auf die Röhre auf der Laborbank, so dass sich das Gehirn am Boden der Röhre absetzt.
- Entfernen Sie die PFA und waschen Sie 3 mal mit PBS + 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel (PBST) bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass jede Wäsche mindestens 10 Minuten auf einem Nutator dauert. Nach der letzten Wäsche PBST entfernen, Blocklösung (PBST + 5% Rinderserumalbumin) hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Verdünnter Anti-Miranda-Antikörper (1:250) und Anti-pH3-Antikörper (1:200) in PBST (beide Antikörper im selben Röhrchen). Entfernen Sie den blockierenden Puffer und fügen Sie die primäre Antikörperlösung hinzu. Über Nacht bei 2-6 °C auf einem Nutator inkubieren.
HINWEIS: Miranda ist ein Membranprotein, das auf CB-NBs vorhanden ist. Es dient dazu, diese großen runden Zellen im CB-Bereich zu identifizieren13. - Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie sie 3 Mal mit PBST. Stellen Sie sicher, dass jede Wäsche 10 Minuten auf einem Nutator bei Raumtemperatur dauert.
- Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie 1:500 verdünntes Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen und Alexa Fluor 568 Anti-Ratte in PBST hinzufügen. Entfernen Sie das PBST und fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung zu den sezierten Gehirnen hinzu. Über Nacht bei 2-6 °C im Dunkeln auf einem Nutator inkubieren und 3 Mal mit PBST waschen (Schritt 3.5).
4. EdU-Erkennung, DNA-Färbung und Montage
- Um den EdU-Detektionscocktail vorzubereiten, mischen Sie die Komponenten (siehe Tabelle 2) in einem 1,5-ml-Röhrchen.
- Entfernen Sie nach der letzten Wäsche (Schritt 3.6) PBST und fügen Sie den EdU-Erkennungscocktail zu den sezierten Gehirnen hinzu. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 min auf einem Nutator inkubieren. 2 mal mit PBST für jeweils 10 min im Dunkeln waschen.
- Für die DNA-Färbung verdünnen Sie Hoechst 33342 (Komponente G) 1:2.000 in PBST, um eine 5 μg/ml-Lösung herzustellen.
- Entfernen Sie PBST nach der zweiten Wäsche (Schritt 4.2) und geben Sie 500 μL 5 μg/ml Hoechst-Lösung in die sezierten Gehirne. 10 Minuten im Dunkeln inkubieren. Hoechst entfernen und einmalig mit PBST für 10 Minuten waschen.
- Tippen Sie die Röhre auf die Laborbank und lassen Sie die Gehirne sich beruhigen. Entfernen Sie das PBST aus dem Röhrchen, aber lassen Sie nur 50-100 μL zurück.
- Schneiden Sie das Ende einer 200-μL-Mikropipettenspitze ab und übertragen Sie das Gehirn vorsichtig auf einen sauberen Glasobjektträger. Entfernen Sie überschüssiges PBST vom Objektträger, indem Sie es mit Filterpapierstreifen abtupfen. Achten Sie darauf, dass das Filterpapier nicht das Gehirn berührt.
- Geben Sie einen Tropfen wasserlösliches, nicht fluoreszierendes Montagemedium auf das Gehirn und richten Sie das Gehirn so aus, dass der ventrale Nervenstrang dem Objektträger zugewandt ist und die Lappen nach oben zeigen. Ordnen Sie die Gehirne in einer einzigen Datei an, so dass es einfacher ist, die Gehirne seriell abzubilden.
- Legen Sie vorsichtig einen Deckglas auf das Gehirn. Stellen Sie die Rutsche über Nacht bei 2-6 °C auf.
HINWEIS: Das Montagemedium härtet bei der Lagerung über Nacht aus, so dass der Deckglas nicht mit Nagellack versiegelt werden muss.
5. Bildgebung
HINWEIS: Einzelheiten zum Laser-Scanning-Mikroskop und zum Ölimmersionsobjektiv, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle.
- Wählen Sie in der Akquisitionssoftware das 63-fache Ziel aus.
- Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Deckglas direkt über den montierten Gehirnen, um das Gewebe durch das Okular leichter zu lokalisieren.
- Mit dem DAPI/Hoechst 33342-Kanal finden Sie das Gehirn durch das Okular und wechseln dann in den Erfassungsmodus in der Software.
- Richten Sie 4 Kanäle ein, um Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) und Alexa Fluor 647 (EdU) abzubilden. Verwenden Sie das Dye-Assistant-Tool, das die Anregungslaser und Emissionsfilter für die ausgewählten Farbstoffe automatisch einrichtet.
- Stellen Sie das Sichtfeld so ein, dass es den gesamten Gehirnlappen umfasst. Stellen Sie sich das gesamte Volumen des Gehirnlappens vor, indem Sie Z-Stacks im Abstand von 0,8 μm erfassen. Speichern Sie alle Bilder aus einer Imaging-Sitzung in einem *.lif-Bibliotheksformat.
6. Bildanalyse
HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Analyse der aufgenommenen Bilder und die Sortierung der Zellen in G0/G1-Phase, S>G2/M (Progression von S nach G2/M) und M-Phase mit der ImageJ-Software.
- Laden Sie Fidschi (Fidschi ist ImageJ) von der folgenden URL herunter: https://fiji.sc/. Öffnen Sie Fidschi, ziehen Sie die LIF-Dateien per Drag & Drop in Fidschi.
HINWEIS: Fiji ist eine Version von ImageJ, die mit mehreren Plugins vorinstalliertist 14. Wenn Sie .lif-Dateien nach Fidschi übertragen, wird das Bio-Formats-Plugin geöffnet, das zum Verarbeiten der .lif-Dateien benötigt wird. Das Bioformat-Plugin ist auch erforderlich, um Bilddateien zu öffnen, die von einigen anderen Mikroskopmarken generiert wurden, z. B. nd2-Dateien, die von einem Nikon-Mikroskop generiert wurden. Dieses Plugin ist mit Fidschi vorinstalliert. - Wählen Sie Datenbrowser auf der Registerkarte Stack-Anzeige und verwenden Sie den virtuellen Stack von der Registerkarte Speicherverwaltung im Bioformat-Plugin.
HINWEIS: Lif-Dateien mit Z-Stacks von 8-10 Gehirnen sind oft 300-400 Megabyte groß. Auf Computern mit wenig RAM kann das Öffnen einiger solcher Dateien den verfügbaren RAM auf ImageJ schnell erschöpfen und eine weitere Bildverarbeitung verhindern. Der virtuelle Stack ist "schreibgeschützt", benötigt keinen hohen RAM für die Verarbeitung und ist eine ideale Option, um große Datensätze auf Fidschi zu laden. - Beobachten Sie das mehrkanalige Bild, das in BildJ angezeigt wird. Ändern Sie die Farbe der Kanäle in der Menüleiste mit dem Bild- | Farb- | Kanälen. Beobachten Sie die Miranda-markierten NBs als große runde Zellen in der CB-Region.
- Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) mit dem Ellipsenwerkzeug über jede NB, um zu vermeiden, dass die NB zweimal gezählt wird.
- Wählen Sie in der Menüleiste ImageJdie Option |-Tools analysieren | ROI-Manager. Markieren Sie alle NBs im aktuellen Z-Abschnitt, und drücken Sie t, nachdem Sie jede Zelle markiert haben.
- Sobald alle NBs im aktuellen Z-Abschnitt markiert sind, ändern Sie die Kanäle in pH3 und EdU und zählen Sie manuell die Anzahl der EdU-positiven NBs, pH3-positiven NBs, NBs, die sowohl für EdU als auch für pH3 positiv färben, und NBs, die für beide Marker nicht färben.
- Suchen Sie in nachfolgenden Z-Abschnitten nach NBs, löschen Sie alte ROIs und fügen Sie neue ROIs hinzu, um NBs in verschiedenen Stacks zu zählen.
- Erstellen Sie eine Tabelle mit den folgenden Spalten: 1. EdU- pH3-: Dieser Abschnitt stellt die doppelt negativen Zellen dar, die sich in der G0/G1-Phase des Zellzyklus befinden; 2. EdU+: Die Zellen dieser Kategorie haben EdU eingebaut und durchlaufen eine DNA-Replikation (S-Phase); 3. EdU+ pH3+: Diese dual-positiven Zellen haben die S-Phase abgeschlossen und sind zur G2- oder M-Phase übergegangen; 4. pH3+: Diese NBs werden einer Mitose unterzogen.
- Berechnen Sie den Prozentsatz der NBs, die in allen der oben genannten 4 Kategorien für jeden Lappen vorhanden sind. Bereiten Sie ein Balkendiagramm mit der Tabellenkalkulationssoftware vor, die die gepoolten Daten für Prozentsätze von NBs in jeder Kategorie anzeigt.
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Representative Results
Das zweilappige Drosophila-Larvengehirn im dritten Stadium wurde als Modellsystem zur Untersuchung grundlegender Zellulärer und Entwicklungsprozesse verwendet9. Der Fokus der aktuellen Studie lag auf der Präsentation eines Protokolls zur Analyse der Zellzyklusprogression in EdU- und pH3-markierten NBs der CB-Region (Abbildung 1). Die CB-NBs werden in Typ I und Typ II unterteilt und weisen das charakteristische asymmetrische Teilungsmuster9 auf. Jede Typ-I-NB-Division erzeugt eine NB, die zur Selbsterneuerung fähig ist, und eine weitere GMC, die zur Differenzierung bestimmt ist9. Im Gegensatz dazu erzeugen Typ-II-NBs transitverstärkende, unreife neuronale Vorläuferzellen (INPs), die sich selbst erneuern und 2 GMCs erzeugen9. Obwohl in der OL-Region eine ausgeprägte NB-Population existiert, konzentrierte sich diese Studie auf die CB-NBs, die groß und leicht mit NB-spezifischen Markern identifizierbar sind.
Für diese Studie wurde Miranda verwendet, um CB-NBs zu identifizieren und zu analysieren (Abbildung 2). Obwohl Miranda auch andere Zellpopulationen in der OL färbt, können CB-NBs aufgrund ihrer Größe und CB-Lage mit Miranda identifiziert werden13. Andere spezifischere Marker können auch verwendet werden, um CB-NBs zu kennzeichnen, wie Deadpan, ein Transkriptionsfaktor, der die NB-Selbsterneuerung reguliert. Da jedoch sowohl pH3 als auch EdU das Chromatin markieren, wurde der Membranmarker Miranda verwendet, um die Visualisierung und Analyse von NBs zu erleichtern, die mit pH3 und EdU markiert sind. Der Einbau von EdU, der anschließende Nachweis und die weitere Charakterisierung durch Immunostaining und Bildanalyse ist ein komplexes Verfahren. Es ist wichtig, jeden Schritt zu standardisieren, um optimale Färbe- und Bildgebungsbedingungen zu bestimmen. Obwohl einige veröffentlichte Berichte EdU / pH3-Kennzeichnungsstrategien darstellen, gehen diese Berichte nicht auf Optimierungs- und Bildanalyseschritte ein. Der in Abbildung 1 dargestellte Workflow fasst die Schritte von der EdU-Einbindung bis zur Bildanalyse zusammen.
Wir haben kürzlich das Mms19-Gen charakterisiert, das von NBs für die normale mitotische Progression benötigt wird11. Durch Live-Cell-Imaging-Analysen wurde gezeigt, dass NBs ohne funktionelle Mms19 doppelt so lange brauchen wie Wildtyp-NBs, um die Mitose zu beenden. Dies spiegelte sich deutlich in der EdU/pH3-Analyse wider, bei der ein signifikant höherer Anteil von Mms19 P-NBs in der M-Phase im Vergleich zu Wildtyp-NBs gefunden wurde ( Abbildung3A). Es wurde gezeigt, dass die Expression des Mms19::eGFP-Fusionsproteins im Mms19P-Hintergrund phänotypische Defekterettet 11,15. Dies korrelierte gut mit den Ergebnissen der Zellzyklusprogressionsanalyse, bei der der Anteil der Zellen in der M-Phase auf Wildtyp-Niveau auf mms19::eGFP-Expression im Mms19P-Hintergrund gerettet wurde (Abbildung 3A,B).
Abbildung 1:Ein vereinfachter Workflow für EdU/pH3 Dual-Labeling. Dritte Larvengehirne im Stadium wurden seziert und mit 100 μM EdU für 2 h inkubiert. Anschließend wurde das Hirngewebe mit PFA fixiert und mit Antikörpern gegen Miranda und pH3 immungefärbt. Bilder der gefärbten Gehirne wurden auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und mit ImageJ/Fiji weiterverarbeitet, um Zellen verschiedenen Zellzyklusphasen zuzuordnen. Abkürzungen: EdU = mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin; pH3 = Phospho-Histon H3; PFA = Paraformaldehyd; SM = Schneiders Seziermedium; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PBST = PBS + 0,3% nichtionisches Detergens; BSA = Rinderserumalbumin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zuordnung von Zellen zu G1/G0; S; Phasen S>G2/M und M. Zellen durchlaufen die Phasen G1, S, G2 und M, um einen vollständigen Zellzyklus abzuschließen. CB-NBs aus wandernden Larvenhirnen im dritten Stadium wurden mit Miranda (rot), EdU (grau), pH3 (grün) und DNA mit Hoechst 33342 (blau) markiert. Markierte NBs wurden in BildJ analysiert und 4 verschiedenen Phasen zugeordnet, je nachdem, ob sie positiv für(A) weder EdU noch pH3 (G1/G0), (B) nur EdU (S-Phase), (C) sowohl EdU als auch pH3 (S>G2 / M) und (D) nur pH3 (M-Phase) gefärbt haben. Beispiele für einzelne NBs nur aus Wildtypgehirnen sind hier gezeigt. Maßstabsbalken = 5 μm. Abkürzungen: CB = Zentralhirn; NBs = Neuroblasten; EdU = mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin; pH3 = Phospho-Histon H3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Einfluss von Mms19P auf die Phasenverteilung des NB-Zellzyklus. (A) Bei der Analyse von Wildtyp-NBs (w;+;+) wurde festgestellt, dass sich ~25% NBs in der M-Phase befanden. Bei mms19P NBs stieg dieser Anteil jedoch auf fast 40%. Mms19::eGFP-Expression im Mms19P-Hintergrund ist dafür bekannt, Mms19 P-Phänotypen zu retten, und der Anteil der M-Phasen-NBs in diesem Hintergrund war vergleichbar mit Wildtyp. (B) Prozentsätze von NBs in 4 verschiedenen Kategorien, die den Zellzyklusphasen G1/G0, S, S>G2/M und M entsprechen, wurden zwischen Wildtypen verglichen; Mms19P und Mms19::eGFP, Mms19P Genotypen. Der Anteil der M-Phase- und G1/G0-Phasen unterscheidet sich bei Mms19 P-NBs erheblich im Vergleich zu Wildtyp-NBs. Im Gegensatz dazu ist die Zellzyklusverteilung von NBs in Mms19::eGFP, Mms19P Gehirnen vergleichbar mit der im Wildtyp gefundenen. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Kruskal-Wallis-Test berechnet und mehrere Spalten mit Dunns Post-Test verglichen; (P<0.001). Diese Zahl wurde von 11geändert. Abkürzungen: NBs = Neuroblasten; eGFP = verbessertes grün fluoreszierendes Protein; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz | Betrag/Volumen |
| EdU (Komponente A) | 5 mg |
| Alexa Fluor 647 – Azid (Komponente B) | 1 Durchstechflasche |
| Dimethylsulfoxid (DMSO, Komponente C) | 4 ml |
| Click-iT EdU Reaktionspuffer (Komponente D) | 4 ml (10-fache Lösung) |
| Kupfersulfat(CuSO4,Komponente E) | 100 mM; 1 Durchstechflasche |
| Click-iT EdU Pufferadditiv (Komponente F) | 400 mg |
| Hoechst 33342 (Bauteil G) | 10 mg/ml in Wasser, 35 μL |
Tabelle 1: Komponenten des EdU-Kits. Komponenten, die mit dem Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit und den entsprechenden Mengen/Volumina geliefert werden. Abkürzung: EdU = mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin.
| Reaktionskomponenten | Volumen (ml) |
| 1x Click-iT Reaktionspuffer (vorbereitet in Schritt 1.4) | 430 |
| CuSO4 (Komponente E) | 20 |
| Alexa Fluor 647 – Azid (Komponente B, hergestellt in Schritt 1.3) | 1.2 |
| Reaktionspufferadditiv (Komponente F, hergestellt in Schritt 1.5) | 50 |
| Gesamtvolumen | ~ 500 |
Tabelle 2: Zubereitung des EdU-Nachweiscocktails. Der EdU-Detektionscocktail wurde durch Mischen der angegebenen Volumina der Kit-Komponenten (in Abschnitt 2 vorbereitet) hergestellt. Abkürzung: EdU = mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin.
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Discussion
Der EdU-Einbau und seine anschließende "Klick"-Reaktion mit zellpermeablem Azid stellen praktische Vorteile dieser Technik gegenüber der zuvor verwendeten BrdU-Methode dar7. Diese Reaktion wird jedoch durch Cu(I)-Ionen katalysiert, und mehrere Farbstoffe können in Gegenwart dieses Kupferkatalysators instabil sein, wie es vom Hersteller des Click-it EdU-Kits eindeutig empfohlen wird. Wenn nach der Ausführung des EdU-Nachweisschritts Immunfärbungsexperimente durchgeführt wurden, wurde die erwartete Signalintensität mit den Rotkanalfarbstoffen Alexa Fluor 568 und Cy3 nicht beobachtet. Das Protokoll funktionierte jedoch, wenn Immunfärbungsreaktionen vor dem EdU-Nachweisschritt abgeschlossen waren. Mit diesem Protokoll wurden vier Kanäle verwendet, um Hoechst, pH3, Miranda und EdU zu visualisieren.
Ein weiterer optimierter Schritt in diesem Protokoll war die Aufnahme von EdU durch sezierte Gehirne im Gegensatz zur Fütterung von EdU-Stachelfliegenfutter an Larven. Da der vollständige Drosophila NB-Zellzyklus ungefähr 2-2,5 h16dauert, ermöglicht die EdU-Aufnahme durch das Gehirn für 2,5 h wie in diesem Protokoll die Verfolgung eines vollständigen Zellzyklus von NBs. Zellen, die weder für EdU noch für pH3 positiv färben, sind ruhende Zellen. Im Falle einer dritten Larve im Stadium, in der sich die NBs aktiv teilen, würden sich diese ruhenden Zellen höchstwahrscheinlich in der G1-Phase des Zellzyklus befinden. Vom spätem embryonalen bis zum frühen zweiten Stadium des Stadiums werden die NBs jedoch vorübergehend ruhend17. In diesen frühen Entwicklungsstadien würde eine doppelt negative Färbung höchstwahrscheinlich eine G0/ Ruhephase darstellen.
NBs, die einer DNA-Replikation unterzogen werden, sollten sich positiv auf EdU färben, während Zellen, die von der S-Phase (EdU-Inkorporation) zur späten G2- oder M-Phase fortgeschritten sind, sowohl für EdU als auch für pH3 positiv färben sollten. Die Charakterisierung der G2-Phase wäre mit diesem Protokoll jedoch schwierig, da frühe G2-Zellen nicht positiv auf EdU oder pH3 färben. Zellen, die EdU eingebaut haben und zu einem frühen G2 fortgeschritten sind, würden sich jedoch auch positiv für EdU färben und könnten die Analyse der G2-Phase erschweren. Mehrere Medikamente, die die DNA-Replikation hemmen, verursachen einen Zellzyklusstillstand in der S-Phase18,19,20. Dieses Protokoll könnte ein praktisches Werkzeug sein, um die Wirkung solcher medikamentösen Behandlungen zu analysieren und zu identifizieren, da S-Phasen-blockierte Zellen nicht zur M-Phase fortschreiten würden und der Anteil der EdU, pH3-Doppel-positiven Zellen in diesem Fall verringert oder sogar fehlen würde.
In einer kürzlich veröffentlichten Studie haben wir die Wirkung des Mms19-Gens auf die mitotische Progression in NBs11untersucht. Durch Live-Cell-Imaging zeigten wir eine dramatische Verzögerung von Mms19 P-NBs in der M-Phasenprogression. Während Wildtyp-NBs die M-Phase in ~10 min abschließen, brauchten Mms19 P-NBs etwa doppelt so lange, um die M-Phase11zu beenden. Dementsprechend spiegelte dieses EdU/pH3-Dual-Labeling-Protokoll auch eine mitotische Verzögerung wider, da wir fast 1,5-mal so viele NBs beobachteten, die sich in Mms19P-Gehirnen positiv auf pH3 färbten als in Wildtyp-Gehirnen. Die Daten aus diesem EdU-Protokoll sind somit vergleichbar mit den direkten Live-Cell-Imaging-Ergebnissen. Da solche direkten, lebenden Zellansätze zeitaufwendig sind und einer umfassenden Optimierung bedürfen, könnte dieses Protokoll verwendet werden, um ein schnelles anfängliches Screening solcher Zellzyklusmutanten durchzuführen, um Defekte in bestimmten Stadien zu verstehen. Sobald eine Phase von Interesse identifiziert ist, könnte dies von direkten Zellvisualisierungsassays gefolgt werden.
Die Dauer der Zellzyklusphasen kann zwischen verschiedenen Zelltypen und Entwicklungsstadien erheblich variieren. Zum Beispiel führt bei der Entwicklung von Drosophila-Embryonen die Herunterregulierung von mitotischen Kinasen zu einer verlängerten Dauer der S-Phase, während in Zellen, die für die Differenzierung bestimmt sind, wie Frettchen (Mustela putorius furo) Gehirn-Neuralvorläufer, die S-Phasendauer deutlich kurz ist21,22. Die EdU-Pulsmarkierungszeit sollte daher in Abhängigkeit von der Länge der S- und G-Phasen im jeweiligen Zelltyp optimiert werden. Die Dauer des EdU-Pulses würde auch von den experimentellen Zielen abhängen, z.B. reicht ein kurzer Puls aus, um den Anteil der Zellen zu messen, die sich derzeit in der S-Phase befinden, während ein längerer Puls die Analyse des Fortschritts von Zellen durch die S-Phase ermöglicht.
Eine umfassende Optimierung des EdU-Pulses kann auch eine Abschätzung der S-Phase ermöglichen, wie Pereira und Kollegen elegant demonstrierthaben 23. Diese Forscher demonstrierten eine neuartige, auf Durchflusszytometrie basierende Methode, bei der HCT116-Zellen für inkrementelle Zeiträume mit EdU pulsmarkiert wurden. Die Autoren zeigten, dass die maximale Fluoreszenzintensität von EdU erreicht wird, wenn die Pulszeit der Länge der S-Phase23entspricht. Darüber hinaus ermöglichte die Analyse des zeitlichen Verlaufs von EdU-markierten Zellen auch die Quantifizierung der G1- und G2/M-Phasen. Obwohl das aktuelle Protokoll für EdU/pH3 Dual-Labeling die Analyse von S- und M-Phasendefekten ermöglicht, ist es mit diesem Protokoll nicht möglich, die genaue Dauer von Phasen zu messen. Das von Pereira und Kollegen beschriebene Protokoll könnte eine geeignete Alternative für Assays sein, die die Bestimmung von Zellzyklusphasenlängen erfordern. Die Anpassung dieses Protokolls mit einer zusätzlichen pH3-Markierung kann auch zu einer höheren Empfindlichkeit beim Nachweis von M-Phasen-Zellen führen.
Neben dem EdU/pH3-Ansatz wurde die fluorescent ubiquitin-based cell cycle indicator (FUCCI) Methode auch zur Untersuchung der Zellzyklusprogression in Säugetierzellen sowie in Drosophila-Geweben eingesetzt24,25. Dieses System verwendet zwei fluoreszenzmarkierte Proteine, Geminin und Cdt1, die Motive für die spezifische Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau durch APC/C bzw. SCFSkp2enthalten. Da APC/C erst ab dem Ende der Mitose durch G1 aktiv ist und SCFSkp2 in den Phasen S und G2 aktiv ist, ermöglicht der zellzyklusspezifische Abbau von fluoreszierend markiertem Geminin und Cdt1 die Bestimmung der Zellzyklusphase24. Eine leicht modifizierte "Fly-FUCCI"-Methode für Drosophila-Gewebe beruht stattdessen auf fluoreszierend markiertem Cyclin B und E2F1, die durch APC/C (während der Mitose) bzw. CRL4Cdt2 (während des Beginns der S-Phase) abgebaut werden25. Eine frühere Studie, die die vorzeitige Differenzierung von Drosophila-Larven-NBs als Reaktion auf Aneuploidie charakterisierte, analysierte Zellzyklusdefekte sowohl mit Fly-FUCCI- als auch mit EdU /pH3-Methoden4. Aneuploidie induziert eine vorzeitige Differenzierung von NBs, und daher verlässt ein hoher Anteil von NBs den Zellzyklus.
Dies spiegelte sich sowohl in fly-FUCCI als auch in den EdU/pH3-Daten genau wider4. Daten aus der EdU/pH3-Methode sind daher auch mit anderen Zellzyklus-Tracking-Methoden wie dem Fly-FUCCI vergleichbar. Fly-FUCCI ist ein leistungsfähiges Werkzeug, und alle Fliegenbestände mit allgegenwärtig angetriebenen fluoreszierenden Markern oder Markern, die mit gewebespezifischen Promotoren verschmolzen sind, sind in Lagerzentren erhältlich. Die Verwendung dieser Konstrukte zur Analyse von Zellzyklusdefekten in Nullmutanten oder mit siRNA-Knockdown würde jedoch eine genetische Rekombination beinhalten, um einen Fliegenbestand zu erzeugen, der die FUCCI-Elemente, gewebespezifische Treiber, eine spezifische Mutation oder eine siRNA von Interesse trägt. Dieser Prozess würde das eigentliche Experiment um mehrere Wochen verzögern, während die EdU / pH3-Methode leicht auf Fliegenlinien mit einem genetischen Nullhintergrund angewendet werden kann. Alternativ kann für siRNA-Knockdowns eine einstufige Kreuzung zwischen einem Treiberbestand und einem siRNA-Bestand für die EdU/pH3-Analyse verwendet werden.
Ein Nachteil dieses Ansatzes ist die Bildgebungs- und Bildanalyse-Pipeline, die die manuelle Quantifizierung einer großen Anzahl von Zellen aus mehreren Gehirnproben beinhaltet. Kürzlich wurde ein Durchflusszytometrie-Ansatz als Hochdurchsatz-Alternative zu einem herkömmlichen mikroskopiebasierten Assay für die Zellzyklusanalyse vorgestellt26. Die schnelle Analyse von Tausenden von Zellen gleichzeitig mit diesem Ansatz ist vorteilhaft, und die Fähigkeit, mehrere Marker zu erkennen, ermöglicht die Quantifizierung spezifischer Zelltypen. Obwohl dieses Protokoll mit kultivierten Zelllinien leicht verwendbar ist, kann es schwierig sein, es auf große Gewebeproben wie das Drosophila-Larvengehirn anzuwenden. Es wurden jedoch einige Protokolle veröffentlicht, die die Dissoziation des Hirngewebes und die Analyse isolierter Larven-NBs durch Durchflusszytometriebeschreiben 27,28. Weitere innovative Ansätze in dieser Richtung könnten neue Möglichkeiten für die Hochdurchsatz-Zellzyklusanalyse in Drosophila-Geweben bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Schweizerischen Nationalfonds (Projektstipendium 31003A_173188; www.snf.ch) und der Universität Bern (www.unibe.ch) an die BS unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
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