5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin/Phospho-Histon H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Zusammenfassung

Die Zellzyklusanalyse mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) und Phospho-Histon H3 (pH3) Markierung ist ein mehrstufiges Verfahren, das eine umfangreiche Optimierung erfordern kann. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das alle Schritte für dieses Verfahren einschließlich Bildanalyse und Quantifizierung beschreibt, um Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen zu unterscheiden.

Zusammenfassung

Die In-vivo-Analyse der Zellzyklusprogression wird routinemäßig in Studien an Genen durchgeführt, die mitose- und DNA-Replikation regulieren. 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) wurde verwendet, um die replikative / S-Phasenprogression zu untersuchen, während Antikörper gegen Phospho-Histon H3 verwendet wurden, um mitotische Kerne und Zellen zu markieren. Eine Kombination beider Markierungen würde die Klassifizierung der Phasen G0/G1 (Gap Phase), S (replikativ) und M (mitotisch) ermöglichen und als wichtiges Instrument zur Bewertung der Auswirkungen von mitotischen Gen-Knockdowns oder Nullmutanten auf den Zellzyklusverlauf dienen. Die Reagenzien, die zur Markierung von EdU-markierten Zellen verwendet werden, sind jedoch mit mehreren sekundären Antikörper-Fluoreszenz-Tags nicht kompatibel. Dies erschwert die Immunfärbung, bei der primäre und markierte sekundäre Antikörper verwendet werden, um pH3-positive mitotische Zellen zu markieren. Dieses Papier beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die duale Markierung von EdU und pH3 in Drosophila-Larven-Neuralstammzellen, einem System, das umfassend zur Untersuchung mitotischer Faktoren verwendet wird. Zusätzlich wird ein Protokoll für die Bildanalyse und Quantifizierung bereitgestellt, um markierte Zellen in 3 verschiedene Kategorien zuzuordnen, G0 / G1, S, S >G2 / M (Progression von S nach G2 / M) und M-Phasen.

Einleitung

Der Zellteilungszyklus umfasst eine G1-Phase (erste Gap-Phase), eine replikative/S-Phase, eine G2-Phase (zweite Gap-Phase) und eine M-Phase (mitotic). Durch diese Phasen durchläuft die Zelle dramatische Veränderungen in der zellulären Transkription, Translation und Reorganisation der Zytoskelettmaschinerie^1,2. Als Reaktion auf Entwicklungs- und Umwelteinflüsse können Zellen vorübergehend aufhören, sich zu teilen und ruhen (G0) oder sich differenzieren und dauerhaft aufhören, sich zu teilen³. Andere Szenarien, wie DNA-Schäden, können eine vorzeitige Differenzierung oder Apoptose verursac....

Protokoll

1. Vorbereitung von Reagenzien und Beständen für den Click-it EdU Assay

HINWEIS: Weitere Informationen zum Kit und zu den mit dem Kit gelieferten Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle und in Tabelle 1.

1. Bringen Sie die Durchstechflaschen auf Raumtemperatur, bevor Sie die Lösungen vorbereiten.
2. 10 mM EdU (Komponente A) Stammlösung unter Zugabe von 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO, Komponente C) herstellen. Gut mischen und bei -20 °C lagern.
3. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung von Alexa Fluor 647-Azid (Komponente B) vor, indem Sie 70 μL DMSO (Komponente C) hinzufügen. Gut mi....

Ergebnisse

Das zweilappige Drosophila-Larvengehirn im dritten Stadium wurde als Modellsystem zur Untersuchung grundlegender Zellulärer und Entwicklungsprozesse verwendet⁹. Der Fokus der aktuellen Studie lag auf der Präsentation eines Protokolls zur Analyse der Zellzyklusprogression in EdU- und pH3-markierten NBs der CB-Region (Abbildung 1). Die CB-NBs werden in Typ I und Typ II unterteilt und weisen das charakteristische asymmetrische Teilungsmuster^{9 a.......}

Diskussion

Der EdU-Einbau und seine anschließende "Klick"-Reaktion mit zellpermeablem Azid stellen praktische Vorteile dieser Technik gegenüber der zuvor verwendeten BrdU-Methode dar⁷. Diese Reaktion wird jedoch durch Cu(I)-Ionen katalysiert, und mehrere Farbstoffe können in Gegenwart dieses Kupferkatalysators instabil sein, wie es vom Hersteller des Click-it EdU-Kits eindeutig empfohlen wird. Wenn nach der Ausführung des EdU-Nachweisschritts Immunfärbungsexperimente durchgeführt wurden, wurde die erwartete .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-Element-Insertion im dritten Exon von Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Erzeugt im eigenen Haus		eGFP-markiertes Mms19-Protein, exprimiert in Mms19p Hintergrund
w1118	Bloomington stock center	#3605	Wildtyp-Stamm (w;+;+)
Primärantikörper			Verdünnung
Ratte anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Kaninchen anti-pH3	Zellsignalisierung	9701	1/200
Sekundäre Antikörper
Ziege Anti-Ratte Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Ziege Anti-Ratte Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagenz/Kit
Aqua Poly/Mount Montagemedium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU Einbausatz, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider' s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Rinderserumalbumin (BSA)-Fraktion V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	nichtionisches Detergens
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph Pad Software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft Office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit 63-facher Ölimmersion, 1,4 NA Plan-Apochromat-Objektiv
Materials
Aqua Poly/Mount Eindeckmedium			wasserlösliches, nicht fluoreszierendes Eindeckmedium
Pyrex 3 oder 9 Unterdruck Glasspotplatte Whatman Filterpapier