Summary
Vi beskriver her etableringen og anvendelsen av en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referert til som αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) musereporterlinje for hjerteprogrammeringsvurdering. Neonatal hjertefibroblaster (NCFer) isolert fra musestammen omdannes til induserte kardiomyocytter (iCMer), noe som muliggjør praktisk og effektiv evaluering av omprogrammeringseffektivitet og funksjonell modning av iCMer via kalsium (Ca2 +) flux.
Abstract
Cardiac reprogramming har blitt en potensielt lovende terapi for å reparere et skadet hjerte. Ved å introdusere flere transkripsjonsfaktorer, inkludert Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kan fibroblaster omprogrammeres til induserte kardiomyocytter (iCMer). Disse iCM-ene, når de genereres in situ i et infarkt hjerte, integreres elektrisk og mekanisk med det omkringliggende myokardiet, noe som fører til en reduksjon i arrstørrelse og en forbedring i hjertefunksjonen. På grunn av den relativt lave omprogrammeringseffektiviteten, renheten og kvaliteten på iCM-ene, er karakterisering av iCMer fortsatt en utfordring. De for tiden brukte metodene på dette feltet, inkludert strømningscytometri, immunocytokjemi og qPCR, fokuserer hovedsakelig på hjertespesifikk gen- og proteinuttrykk, men ikke på funksjonell modning av iCMer. Utløst av virkningspotensialer fører åpningen av spenningsportede kalsiumkanaler i kardiomyocytter til en rask tilstrømning av kalsium inn i cellen. Derfor er kvantifisering av kalsiumtilstrømning en lovende metode for å evaluere kardiomyocyttfunksjon. Her introduserer protokollen en metode for å evaluere iCM-funksjonen ved kalsium (Ca2 +) flux. En αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme ble etablert ved å krysse Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referert til som Myh6-Cre nedenfor) med Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referert til som Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) mus. Neonatal hjertefibroblaster (NCFer) fra P0-P2 neonatale mus ble isolert og dyrket in vitro, og en polycistronic konstruksjon av MGT ble introdusert til NCFer, noe som førte til omprogrammering til iCMer. Fordi bare omprogrammerte iCMer vil uttrykke GCaMP3-reporter, kan den funksjonelle modningen av iCMer vurderes visuelt av Ca2 + flux med fluorescensmikroskopi. Sammenlignet med ikke-omprogrammerte NCFer viste NCF-iCMer betydelig kalsium forbigående fluks og spontan sammentrekning, lik CMs. Denne protokollen beskriver i detalj musestamme etableringen, isolasjon og utvalg av neonatal mus hjerter, NCF isolasjon, produksjon av retrovirus for hjerte omprogrammering, iCM induksjon, evaluering av iCM Ca2 + flux ved hjelp av vår reporter linje, og relatert statistisk analyse og datapresentasjon. Det forventes at metodene beskrevet her vil gi en verdifull plattform for å vurdere funksjonell modning av iCMer for hjerteprogrammeringsstudier.
Introduction
Hjerteinfarkt (MI) er en alvorlig sykdom over hele verden. Kardiovaskulære sykdommer (CVD) er den ledende dødsårsaken over hele verden og står for omtrent 18,6 millioner dødsfall i 20191,2. Den totale dødeligheten av CVD-er har gått ned i løpet av det siste halve århundret. Imidlertid har denne trenden blitt bremset eller til og med reversert i noen uutviklede land1, som krever mer effektive behandlinger av CVD-er. Som en av de dødelige manifestasjonene av CVD står MI for omtrent halvparten av alle dødsfall som tilskrives CVDer i USA2. Under iskemi, med blokkering av koronararterier og begrenset tilførsel av både næringsstoffer og oksygen, lider myokardiet alvorlige metabolske endringer, svekker systolisk funksjon av kardiomyocytter (CMs), og fører til CM-død3. Tallrike tilnærminger i kardiovaskulær forskning har blitt utforsket for å reparere hjerteskade og gjenopprette funksjonen til det skadede hjertet4. Direkte hjerte omprogrammering har dukket opp som en lovende strategi for å reparere det skadede hjertet og gjenopprette sin funksjon5,6. Ved å introdusere Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kan fibroblaster omprogrammeres til iCMs in vitro og in vivo, og disse iCM-ene kan redusere arrområdet og forbedre hjertefunksjonen7,8.
Selv om hjerteprogrammering er en lovende strategi for MI-behandling, er det fortsatt en rekke utfordringer. For det første er ikke alltid omprogrammeringseffektiviteten, renheten og kvaliteten så høy som forventet. MGT-induksjon kan bare oppnå 8,4 % (cTnT+) eller 24,7 % (αMHC-GFP+) av de totale CF-ene som skal omprogrammeres til iCMer in vitro7, eller opptil 35 % in vivo8, som begrenser bruken. Selv med flere faktorer indusert i systemet, for eksempel Hand29 eller Akt1/PKB10, er omprogrammeringseffektiviteten fortsatt knapt tilfredsstillende å bruke i en klinisk setting. Dermed er det behov for flere studier fokusert på å forbedre omprogrammeringseffektiviteten på dette feltet. For det andre er de elektriske integritets- og sammentrekningsegenskapene til iCMer viktige for effektiv forbedring av hjertefunksjonen, men disse er utfordrende å evaluere. For tiden er mye brukte evalueringsmetoder i feltet, inkludert strømningscytometri, immunocytokjemi og qPCR for noen viktige CMs-generuttrykk, alle fokusert på likheten til iCMer og CMs, men ikke direkte relatert til de funksjonelle egenskapene til iCMer. Videre har disse metodene relativt kompliserte prosedyrer og er tidkrevende. Mens omprogrammeringsstudier vanligvis innebærer en screening av potensielle omprogrammeringsfaktorer som fremmer iCMs modning11, krever hjerteprogrammering en rask og praktisk metode basert på iCMs-funksjon.
CMs åpner de spenningsporterte kalsiumionkanalene på cytomembranen under hver sammentrekningssyklus, noe som fører til en forbigående tilstrømning av kalsiumion (Ca2+) fra intercellulærvæsken til cytoplasma for å delta i myofilamentkontraksjonen. En slik Ca2+ tilstrømning og outflux syklus er den grunnleggende egenskapen til myokardkontraksjon og utgjør den normale funksjonen til CMs12. Dermed kan en metode som oppdager Ca2 + tilstrømning være en potensiell måte å måle funksjonen til CMs og CM-lignende celler, inkludert iCMer. Videre, for iCMer, gir en slik metode en annen måte å evaluere omprogrammeringseffektivitet på.
Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) er utviklet og mye brukt til å indikere celleaktiviteter, spesielt virkningspotensialer. Vanligvis består GECIer av et Ca2+ bindingsdomene som calmodulin, og et fluorescerende domene som GFP, og GCaMP3 er et med høy affinitet og fluorescensintensitet. Fluorescensdomenet til GCaMP3 aktiveres når den lokale kalsiumkonsentrasjonen endres13. I dette dokumentet beskrives en musestamme som spesifikt uttrykker en GCaMP3-reporter i Myh6+-celler. Ved å introdusere MGT til de isolerte NCF-ene fra nyfødte av denne stammen, kan omprogrammeringen overvåkes av fluorescens, som vellykket omprogrammerte iCMer vil vise. En slik musestamme og metode vil gi en verdifull plattform for å undersøke hjerteprogrammering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer og praksiser som involverer dyr ble godkjent av Institutional Animal Care &Use Committee ved University of Michigan. Alle eksperimentelle prosedyrer og praksiser som involverer cellekultur må utføres BSL2 biologisk sikkerhetsskap under sterile forhold. For prosedyrer og praksis som involverer virus, ble retningslinjen for riktig avhending av transfekterte celler, pipettespisser og rør for å unngå risiko for miljø- og helsefarer fulgt.
1. Etablering av en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (referert til som Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) musestamme (figur 1)
- Forbered Tg(Myh6-cre)1Jmk/J musestamme (Jackson lab lager 009074, referert til som Myh6-Cre) og Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J musestamme (Jackson lab lager 014538, referert til som Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), henholdsvis.
- Ras hver belastning opp til 8 uker gammel for å få voksne Myh6-Cre og Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mus, henholdsvis.
- Crossbreed den voksne Myh6-Cre og Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mus.
MERK: Sett opp Myh6-Cre mann / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 hunn eller omvendt. Det er ingen signifikant forskjell mellom deres etterkommere. Vanligvis vil de kvinnelige musene føde 8-10 valper 19-21 dager etter kryssavlingen.
2. Isolasjon og utvalg av neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mus hjerter.
- Få P0-P2 valper. Forsikre deg om at 8-10 valper er til stede for å isolere 10 millioner NCFer med denne protokollen.
- Dypt bedøvet valpene av hypotermi. Legg valpene i en latekshanske og senk opp til halsen i knust is og vann (2 °C – 3 °C).
- Desinfiser valpene kort med 75% etanol.
- Ofre valpene ved halshugging med steril saks.
- Lag et horisontalt snitt nær hjertet, klem hjertet, og isoler det ved å skille ved roten av aorta med saks.
- Vær oppmerksom på at hjertet slår under et fluorescensmikroskop. Sørg for at hjertene med Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotype viser Ca2+ flux indikert av GCaMP3 med hjerteslag. De andre genotypene viser ikke fluorescens (figur 2, video 1 og video 2).
3. Isolering av neonatale hjertefibroblaster (NCF-er)
MERK: For denne delen ble protokollen fra Dr. Li Qians Lab14 vedtatt med mindre optimaliseringer når det gjelder denne studien.
- Etter isolering av αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 hjerter, kutt dem i fire stykker som er løst forbundet. Vask dem i iskald DPBS i en 6 cm plate grundig flere ganger for å begrense blodcelleforurensningen i de isolerte cellene.
- Overfør hjertene til et 15 ml konisk rør.
- Fordøye hjertene med 8 ml varm 0,25% Trypsin-EDTA ved 37 °C i 10 minutter.
- Kast trypsin supernatanten og tilsett 5 ml varm type II kollagen (0,5 mg/ml) i HBSS.
- Virvel blandingen grundig, og inkuber ved 37 °C i 5 minutter.
- Etter inkubasjonen, virvel grundig og la det ufordøyde vevet slå seg ned av tyngdekraften.
- Samle supernatanten i et 15 ml konisk rør med 5 ml kaldt fibroblast (FB) medium (IMDM med 20% FBS og 1% penicillin /streptomycin).
- Gjenta trinn 3.4-3.7 for det ufordøyde vevet 4-5 ganger.
- Samle alle supernatant sammen og filtrer supernatanten med en 40 μm sil.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
- Resuspend cellene i 10 ml magnetisk aktivert celle sortering buffer (MACS buffer; 1x PBS med 2 mM EDTA og 0,5% BSA).
- Bestem det levedyktige cellenummeret ved hjelp av trypan blå flekker.
- Ta 10 μL celler ut fra 10 ml celleoppheng i trinn 3.11.
- Bland med 10 μL 0,4% trypan blå oppløsning og inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Tilsett blandingen til et hemocytometer og bestem det levedyktige cellenummeret. De døde cellene er farget i blått, mens de levedyktige cellene er unstained.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
- Resuspend cellene med 10 μL av Thy1.2 mikrober i 90 μL kjølt MACS buffer for mindre enn 10 millioner levedyktige celler. Tilsett flere perler proporsjonalt hvis det er mer enn 10 millioner levedyktige celler. Pipette blandingen godt og inkuber ved 4 °C i 30-60 min.
- Tilsett 10 ml MACS-buffer og bland godt.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min, kast supernatanten.
- Gjenta trinn 3.15-3.16 én gang.
- Resuspend cellene og perlene med 2 ml MACS-buffer.
- Sett opp en MACS-separator i panseret. Sett inn en LS-kolonne i skilletegnet, og likevekt kolonnen med 3 ml MACS-buffer.
- Når LS-kolonnen er likevektet, sender du cellene gjennom kolonnen.
- Vask LS-kolonnen med 2 ml MACS-buffer tre ganger.
- Ta kolonnen av separatoren, elute den med 2 ml MACS-buffer tre ganger, og samle deretter elutionen til et 50 ml rør.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min og kast supernatanten.
- Resuspend cellene med 5 ml FB media.
- Bestem cellenummeret med et hemocytometer.
- Fortynn cellene med FB-medier og frø cellene til retter eller tallerkener etter ønske. Forsikre deg om at cellefrøtettheten er rundt 2-2,5 x 104 celler / cm2 (optimaliser tettheten basert på individuelle eksperimenter). Påse at de vedlagte fibroblaster har en oval til rund form den andre dagen etter sådd (figur 3).
4. Produksjon av retrovirus koding polycistronic MGT vektor for hjerte omprogrammering
- Oppretthold Plat-E med Plat-E kulturmedier (DMEM supplert med 10% FBS, 1 μg/ml puromycin og 10 μg/ml blasticidin) ved 37 °C med 5 % CO2.
- På dag 1 deler du Plat-E til en 6-brønnsplate med ca. 4-5 x 105 celler/brønntetthet.
- På dag 2 når Plat-E vanligvis 80% samløp. Transfekt cellene med følgende prosedyrer. Juster volumet og mengden av hvert element som er til stede her, basert på hver brønn i en 6-brønns plate.
- Fortynn 2 μg pMX-puro-MGT polycistronic retrovirusuttrykk plasmidvektor (Addgene 111809) til 500 ng/μL med TE-buffer.
- Forbered transfeksjonsblandingen ved å blande 10 μL lipofektamin med 150 μL redusert serummedium. Forsiktig pipette for å blande godt og inkubere ved romtemperatur i 5 min. Vær forsiktig så du unngår bobler ved pipettering.
- I mellomtiden, lag en plasmidblanding ved å blande plasmidet med 150 μL redusert serummedium. Forsiktig pipette for å blande godt og inkubere ved romtemperatur i 5 min. Vær forsiktig så du unngår bobler ved pipettering.
- Bland forsiktig de to blandingene og inkuber ved romtemperatur i 5 min. Løsningen kan virke overskyet.
- Tilsett blandingen dråpe for dråpe til cellene som skal transfekteres.
- Inkuber cellene ved 37 °C over natten.
- På dag 3, endre mediet til et friskt komplett cellekulturmedium som mangler puromycin og blasticidin.
- På dag 4, 48 timer etter transfeksjonen, samle supernatanten som inneholder retrovirus og lagre det i 4 °C.
- På dag 5, 72 timer etter transfeksjonen, samle supernatanten som inneholder retrovirus.
- Filtrer både 48 h og 72 h supernatant med et 0,45 μm filter, utfell over natten ved 4 °C ved å tilsette 1/5 volum 40 % poly (etylenglykol) (PEG) oppløsning for å lage en endelig konsentrasjon på 8 % PEG.
- Sentrifuge ved 4000 x g i 30 min for å utfelle viruset.
MERK: PEG8000-virus danner liten hvit nedbør. - Resuspend viruset med iCM medium som inneholder 8 μg / ml polybrene etter ønske. Bruk retroviruset umiddelbart.
5. Omprogrammering av NCFer til iCMer med MGT-koding av retrovirusinfeksjon
- Vokse eller passere NCFer før virusinfeksjon.
MERK: Vanligvis kan NCF passeres to ganger. - På dag 0 frø NCF til tettheten rundt 1-2 x 104 celler / cm2 i FB medium.
- På dag 1 erstatter du kulturmediet med et virusholdig medium for hver enkelt så vel som ønsket. Bruk viruset fra en brønn Plat-E i en 6-brønns plate for å infisere to brønner i en 24-brønns plate. Titer viruset for å bestemme den optimale viruskonsentrasjonen.
MERK: Virus som inneholder andre omprogrammeringsfaktorer av interesse kan innføres sammen med MGT retrovirus. - Inkuber ved 37 °C over natten.
- På dag 2, 24 timer etter virusinfeksjonen, erstatt det virusholdige mediet til et vanlig iCM-medium.
- For å overvåke GCaMP3-uttrykket, skriv det under et invertert fluorescensmikroskop. Under 10x ved GFP-kanalen, observere den milde basale GCaMP3 fluorescensen til en del av celler så tidlig som dag 5.
- Skift ut mediet hver 2-3. Utfør om nødvendig et positivt utvalg for MGT retrovirus infiserte celler ved å tilsette 2 μg/ml puromycin til kulturmediet i 3 dager og opprettholde det ved 1 μg/ml.
MERK: Introduser kjemikalier av interesse (f.eks. IGF-1, MM589, A83-01 og PTC-209, referert til som IMAP som vi tidligere rapporterte15) sammen med middels endring. - Etter 14 dagers infeksjon, erstatt mediet med B27 medium for å ytterligere indusere iCM modning.
6. Evaluering av iCM funksjonell modning og omprogrammering effektivitet av Ca2 + flux
MERK: Tilsett 1 μM isoproterenol i cellene som skal evalueres før vurdering, om nødvendig.
- Vurder Ca2+ flux med et invertert fluorescensmikroskop ved romtemperatur.
- I GFP-kanalen må du observere GCaMP3+-cellene under 10x målsetting. Forsikre deg om at den viser spontan celleslag i den lyse feltkanalen.
- Velg tilfeldig tre felt under 20x og registrer Ca2+ fluxen til iCMene i 3 minutter for hvert felt.
MERK: Her ble Ca2+ flux synkronisert med spontan celleslag (figur 4, figur 5 og video 3, video 4, video 5, video 6, video 7, video 8). - Kvantifiser cellene manuelt med Ca2+ flux.
7. Statistisk analyse og datapresentasjon
- Analyser forskjellene mellom gruppenes enveisvariasjonsanalyse (ANOVA) og utfør student-Newman-Keuls flere sammenligningstester.
MERK: Resultatene er som gjennomsnittlige ± S.E med p < 0,05 betraktet som statistisk signifikant. Hvert eksperiment ble utført minst tre ganger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle arbeidsflyten for å generere Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme og genstrukturen til de transgene musene er vist i figur 1. Mens musestammen er etablert, ble valpenes hjerter isolert og observert under et omvendt fluorescensmikroskop for å bekrefte genotypen. Hjerter med riktig genotype viser Ca2+ flux synkronisert med slag, visualisert som GCaMP3 fluorescens, mens ingen fluorescens ble observert i kontrollhjerter (figur 2, video 1 og video 2). Isolerte NCFer festes til brønnen innen 2 timer og viser en oval til rund form 1 dag etter sådd (figur 3). Den funksjonelle modenheten og omprogrammeringseffektiviteten til iCMer ble evaluert av Ca2+ flux 14 dager etter MGT-introduksjon. De omprogrammerte cellene kan vurderes under et fluorescensmikroskop for å måle Ca2+ fluxen. GCaMP3+-celler finnes i både IMAP- og MGT-grupper, mens IMAP-gruppen viser betydelig flere GCaMP3+-celler og celler med Ca2+-oscillasjonsmønstre nærmere vanlige CMer (Videoer 3-8). Som vist i figur 4A, vil en representativ celle i IMAP-gruppen med Ca2+ oscillasjon vise GCaMP3 fluorescensendring mellom maksimum (mellompanel) og minimum (høyre panel), og Ca2 + oscillasjon av slike celler endres periodisk (figur 4B). Etter innføringen av IMAP var antallet slagklynger betydelig høyere enn i kontrollgruppen, ettersom antallet GCaMP3+-celler med Ca2+ flux per høyeffektsfelt (HPF, 20x objektiv) ble økt i IMAP-middels behandlet gruppe (figur 5).
Figur 1: Generere Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme. Illustrasjon av Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestammegenerering og genstrukturen til de transgene musene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ca2+ flux i det bankende hjertet. GCaMP3 fluorescens ble synkronisert med hjerteslag i Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 hjerter (øvre panel), mens ingen fluorescens ble observert i kontrollhjerter (nedre panel). Skalastang = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Isolerte NCFer festet til en 6-brønnsplate. (A) NCFer under laveffektsfelt (LPF, 10x mål, skalastang = 100 μm). (B) NCF-er under høyeffektsfelt (20x mål, skalastang = 50 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ca2+ flux av omprogrammerte celler. (A) IMAP-behandlede NCFer omprogrammert til iCMer under GFP-kanal ved høyeffektsfelt (20x mål). Ca2+ flux av iCMer ble visualisert som GCaMP3 fluorescens, der celler med Ca2 + flux viser gjentatt blinking mellom grunnleggende fluorescens (Ca2 + min, midtpanel) og lys fluorescens (Ca2 + maks, høyre panel) synkronisert med slag. (B) Ca2+ sporkurve for Ca2+ oscillasjon+ celler i IMAP-gruppe. Skalastang = 50 μm. F/F0: relativ fluorescensintensitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 figur 5: Evaluering av Ca2+ flux under IMAP-medium. Antall GCaMP3+-celler med Ca2+- fluks per HPF 2, 3, 4 uker etter MGT-induksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Et bankende hjerte isolert fra valper med αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotype under skanning objektiv linse (4x objektiv) i GFP-kanalen. Hjertet er GCaMP3+ og blinker mellom grunnleggende fluorescens (Ca2+ min) og lys fluorescens (Ca2 + maks) synkronisert med slag. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Et bankende hjerte isolert fra valper med kontrollgenotype under skanning objektiv linse i GFP-kanalen. Hjertet er GCaMP3- og viser ikke fluorescens som blinker synkronisert med juling. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: iCMer i IMAP-gruppe under LPF i BF-kanalen (Bright Field). En celle med betydelig slag i midten av feltet kan ses. Både Video 3 og Video 4 fokuserer på samme felt. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 4: iCMer i IMAP-gruppe under LPF i GFP-kanalen. Flere celler med blinkende fluorescens, inkludert bankcellen sett i BF-kanalen, kan observeres. Både Video 3 og Video 4 fokuserer på samme felt. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 5: iCMer i IMAP-gruppe under HPF i BF-kanalen. Senter for feltet video 3 og video 4 ble observert under HPF. En celle med betydelig slag i midten av feltet kan observeres. Både Video 5 og Video 6 fokuserer på samme felt. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 6: iCMer i IMAP-gruppe under HPF i GFP-kanalen. Midtpunktet i feltet video 3 og video 4 ble observert under HPF. Flere celler med blinkende fluorescens, inkludert bankcellen sett i BF-kanalen, kan observeres. Både Video 5 og Video 6 fokuserer på samme felt. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 7: iCMer i MGT-gruppen under HPF i BF-kanalen. I motsetning til signifikante slagceller observert i IMAP-gruppen, er det noen få bankende celler under BF-kanalen i MGT-gruppen, som har lavere omprogrammeringseffektivitet. Både Video 7 og Video 8 fokuserer på samme felt. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 8: iCMer i MGT-gruppen under HPF i GFP-kanalen. Flere celler med mild blinkende fluorescens kan observeres. Både Video 7 og Video 8 fokuserer på samme felt. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evaluering av iCMs-funksjonen er nødvendig for hjerte-omprogrammeringsfeltet. I dette manuskriptet beskriver protokollen en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J musestamme som er etablert, hvordan du bruker NCF-ene isolert fra neonatale mus i denne belastningen for omprogrammering til iCMer, og evalueringen av iCMer-funksjonen av Ca2+ flux. Dette er en de novo-metode for å evaluere iCMs funksjonelle modning.
Flere kritiske trinn er viktige for vellykket omprogrammering og evaluering med denne metoden. For det første bør NCF-er være nytilberedt og sunne etter isolasjon. En rask prosedyre for hjerteisolasjon og kutting er viktig. Viktigst av alt er det viktig å følge inkubasjonstiden for å unngå over fordøyelse og reduksjon i celle levedyktighet og tilstand. For det andre, blant alle prosedyrer, introduserer virusinfeksjonseffektivitet ofte høy variasjon i resultatene. Virusinfeksjonseffektivitet påvirkes i stor grad av to faktorer. På den ene siden bør virustitren være konstant blant forskjellige forsøk, noe som krever konsistens i transfected plasmider mengde og lignende Plat-E celletilstand og tetthet. Forskere som følger denne protokollen, bør vurdere optimal såingstetthet og tid før disse prosedyrene. Viruset bør brukes umiddelbart for å unngå titerdemping på grunn av virusets følsomhet for fryse-tine sykluser. I tillegg er det viktig å holde NCF-er i en sunn tilstand og egnet tetthet på infeksjonstidspunktet. Forskeren skal være kjent med vekstegenskapene til NCF-er. Selv om variasjonen i omprogrammeringseffektiviteten bør begrenses, kan hyppig overvåking være nyttig. Denne protokollen kan enkelt endres for å infisere NCFer samtidig med forskjellige virus eller behandle dem med kjemikalier av interesse. Dermed er det anvendelig som en universell metode for hjerteprogrammeringsforskning. I tillegg til punkter som er nevnt her, inkluderer vanlige problemer med denne metoden lav fluorescens observert etter omprogrammeringen. Dette kan skyldes flere årsaker. For det første kan infeksjonen ikke være så effektiv som ønsket, noe som fører til lav omprogrammeringseffektivitet og begrenser antall iCMer. For det andre kan eksponeringstilstanden måtte justeres optimalt for observasjon av GCaMP3 fluorescens av iCMer. Bruk av neonatale kardiomyocytter isolert fra de samme valpene som positiv kontroll vil bidra til å identifisere den potensielle årsaken.
Ca2 + flux har blitt mye brukt til å vurdere celleaktiviteter, inkludert i nevronceller16, brystkjertel17, fettvev18, etc. I denne studien ble Ca2+ flux brukt til å vurdere funksjonell modning av iCMer. Tidligere har det blitt rapportert at Ca2 + flux kan måles ved spesifikke kjemikalier kalt små molekyl kalsiumfølsomme fargestoffer som kan brukes til å evaluere funksjonen til omprogrammerte celler19. En slik metode har imidlertid flere begrensninger: kjemikaliet introdusert til cellene kan ha potensiell toksisitet og påvirke cellulære prosesser, noe som gjør resultatene mindre pålitelige enn de som er oppnådd med metoden som presenteres her. Dessuten er fargingsprosessen komplisert og tidkrevende, samtidig som den forhindrer ytterligere evalueringer av disse cellene. Metoden som presenteres her, derimot, overvinner disse begrensningene. GCaMP3 er ikke-invasiv for cellene, noe som minimerer påvirkningen på celleaktiviteter og muliggjør videre evaluering av cellene. Siden fluorescensen til iCMer bare avhenger av deres identitet, det vil si Myh6-uttrykk og lokal Ca2+ konsentrasjonsendring, blir Ca2 + flux-fluorescensen av celler synlig så lenge NCF-er omprogrammeres, noe som muliggjør hyppig overvåking av omprogrammeringsprosessen uten en tidkrevende strategi. Mens Ca2+ flux enkelt kan overvåkes og registreres under et invertert fluorescensmikroskop, kan gjentatt juling og relatert elektronisk aktivitet over cellemembranen, det vil si Ca2 + flux, bli ytterligere temporally kvantifisert20. Som vist i figur 4B, kan slik kvantifisering gi mer informasjon om modenheten til iCMer og illustrere mer detaljerte strukturer av Ca2 + fluxendring under hjerteprogrammering.
Denne metoden har flere fordeler. For det første observeres Ca2+ flux utelukkende i iCMer. Fordi Myh6 er veldig spesifikk for CMs, men ikke CFer, vil bare de omprogrammerte cellene uttrykke GCaMP3-reporteren og bli fluorescerende. For det andre gir Ca2+ flux en måte å evaluere funksjonell modning av iCMer i tillegg til metoden for å overvåke uttrykket av CM-spesifikke gener. På grunn av den relativt lange eksperimentelle prosedyren og variasjonen knyttet til dette, er funksjonen til iCMer ikke alltid akseptabel for videre studier og potensiell klinisk bruk. Mens det CM-spesifikke genuttrykket bare avslører en del av egenskapene til den omprogrammerte cellen, gir Ca2 + flux et annet aspekt av hjerteprogrammeringsfeltet for å evaluere den omprogrammerte cellekvaliteten og effektiviteten. Videre er funksjonell modning mer relatert til hjertefunksjon, noe som kan være en bedre indikator for å evaluere effektivitet. Mye brukte metoder i dette feltet inkluderer strømningscytometri, en teknikk som nødvendiggjør trypsin fordøyelse av alle cellegruppene. Mens fordøyelsen kan påvirke cellefunksjoner og egenskaper, introduserer det variasjon i systemet, reduserer potensialet for å reprodusere resultatene som observeres og evaluerer disse cellene ytterligere. Sammenlignet med disse metodene har den transgene musestammen som vises her begrenset den potensielle innflytelsen fra kjemikalier eller eksperimentelle prosedyrer som trengs for evalueringen. Med disse fordelene forenkler denne musestammen evalueringsprosedyrene som trengs for hjerteprogrammering og forbedrer reproduserbarheten av resultatene på dette feltet.
Det er imidlertid noen begrensninger i denne studien. For det første er musestammen tidkrevende. Henvendelser om musestammen fra kolleger på dette feltet er velkomne for å forkorte tiden som trengs for belastningsetablissementet. For det andre innebærer hjerteprogrammering til iCMer med denne protokollen flere faktorer og trinn, noe som introduserer relativt høy variasjon i systemet. Ferdigheter på dette feltet vil bidra til å løse dette problemet. Til slutt, fordi GCaMP3 bare blir fluorescerende under Ca2 + flux-tilstand, kan ikke den nåværende evalueringsmetoden direkte brukes til FACS som hjerteprogrammering med Myh6-GFP-stamme7. Men mens den nåværende belastningen har flere og forskjellige applikasjoner sammenlignet med Myh6-GFP-belastning, kan en slik ulempe overvinnes.
Totalt sett, som protokollen har beskrevet ovenfor, gir Myh6-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme og etter evaluering av iCMs modning en strategi for å overvåke hele prosessen med hjerteprogrammering. Denne GCaMP3-medierte Ca2+ fluksmålingsstrategien kan utføres i levende celler uten å skade cellens levedyktighet. Fordi GCaMP3 fluorescens er drevet av myokard-spesifikt genuttrykk, kan de oppkjøpte GCaMP3 fluorescerende dataene kvantifiseres ytterligere for å avsløre omprogrammeringseffektiviteten og iCMs-aktiviteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi setter pris på Leo Gnatovskiys innsats for å redigere den engelske teksten til dette manuskriptet. Figur 1 ble opprettet med BioRender.com. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) i USA (1R01HL109054) stipend til Dr. Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G.
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
