Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

לכידה בסיוע שרפים בשילוב עם תיוג תג מסת טנדם איזוברי לכימות מרובב של חמצון חלבון תיול

Published: June 21, 2021 doi: 10.3791/62671
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Integrative Omics, Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Bioproducts Sciences and Engineering Laboratory, Department of Biological Systems Engineering, Washington State University

Summary

לחמצון חלבון תיול יש השלכות משמעותיות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים רגילים. אנו מתארים את הפרטים של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור, המשתמשת בלכידה בסיוע שרף, תיוג איזוברי וספקטרומטריית מסה, ומאפשרת זיהוי וכימות ספציפיים לאתר של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך של חלבונים.

Abstract

שינויים חמצוניים הפיכים בתיולים חלבוניים התגלו לאחרונה כמתווכים חשובים של תפקוד התאים. להלן נתאר את ההליך המפורט של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור המשתמשת בלכידה בסיוע שרף (RAC) בשילוב עם תיוג איזוברי של תג מסה טנדם (TMT) וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם (LC-MS/MS) כדי לאפשר כימות סטוכיומטרי מרובב של תיולים חלבוניים מחומצנים ברמת הפרוטאום. המידע הכמותי הספציפי לאתר על שאריות ציסטאין מחומצן מספק תובנה נוספת לגבי ההשפעות הפונקציונליות של שינויים כאלה.

זרימת העבודה ניתנת להתאמה על פני סוגי דגימות רבים, כולל תאים בתרבית (למשל, יונקים, פרוקריוטים) ורקמות שלמות (למשל, לב, ריאות, שרירים), אשר בתחילה שוכבים/הומוגניים ועם תיולים חופשיים להיות alkylated כדי למנוע חמצון מלאכותי. לאחר מכן, תיול החלבון המחומצן מצטמצם ונלכד על ידי שרף זיקה לתיול, אשר מייעל ומפשט את שלבי זרימת העבודה בכך שהוא מאפשר לבצע את הליכי העיכול, הסימון והשטיפה ללא העברה נוספת של חלבונים/פפטידים. לבסוף, הפפטידים המסומנים עוברים אלוט וניתוח על ידי LC-MS/MS כדי לחשוף שינויים סטויכיומטריים מקיפים הקשורים לחמצון תיול על פני הפרוטאום כולו. שיטה זו משפרת מאוד את ההבנה של התפקיד של ויסות תלוי חמצון-חיזור במצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים הקשורים לחמצון חלבון תיול.

Introduction

בתנאים הומאוסטטיים, תאים מייצרים חמצן, חנקן או מיני גופרית תגובתיים המסייעים להקל על תהליכים, כגון חילוף חומרים ואיתות 1,2,3, המגיעים הן לפרוקריוטים והן לאאוקריוטים. רמות פיזיולוגיות של מינים תגובתיים אלה נחוצות לתפקוד תקין של התאים, הידוע גם בשם 'eustress'1,4. לעומת זאת, עלייה במחמצנים שמובילה לחוסר איזון בין מחמצנים לנוגדי חמצון עלולה לגרום לעקה חמצונית, או 'מצוקה'1, שמובילה לפגיעה בתאים. מחמצנים מתמרים אותות למסלולים ביולוגיים על ידי שינוי ביומולקולות שונות, כולל חלבונים, דנ"א, רנ"א ושומנים. בפרט, שאריות ציסטאין של חלבונים הן אתרים תגובתיים מאוד המועדים לחמצון עקב קבוצת התיול על ציסטאין, שהוא תגובתי כלפי סוגים שונים של מחמצנים5. זה יוצר מגוון רחב של שינויים פוסט-טרנסלציוניים הפיכים מבוססי חמצון-חיזור (PTMs) עבור ציסטאין, כולל ניטרוזילציה (SNO), גלוטתיוניל (SSG), סולפנילציה (SOH), פרסולפידציה (SSH), פוליסולפידציה (SSnH), אצילציה ודיסולפידים. צורות בלתי הפיכות של חמצון ציסטאין כוללות סולפינילציה (SO2H) וסולפונילציה (SO3H).

שינויים חמצוניים הפיכים של שאריות ציסטאין עשויים לשמש כמגנים ולמנוע חמצון בלתי הפיך נוסף או לשמש כמולקולות איתות למסלולים תאיים במורד הזרם 6,7. ההפיכות של חלק מה-PTMs של חמצון-חיזור מחדש של תיול מאפשרת לאתרי ציסטאין לתפקד כ"מתגי חמצון-חיזור"8,9, כאשר שינויים במצב חמצון-חיזור של אתרים אלה משנים את תפקוד החלבון כדי לווסת את תפקידם בתהליכים חולפים. ההשפעות המווסתות של PTMs10 של חמצון-חיזור נצפו בהיבטים רבים של תפקוד חלבונים11, כולל קטליזה12, אינטראקציות חלבון-חלבון 13, שינוי קונפורמציה 14, תיאום יוני מתכת 15, או קשירת מעכבים פרמקולוגית 16. בנוסף, PTMs של חמצון-חיזור מעורבים באתרי ציסטאין של חלבונים המווסתים מסלולים כגון שעתוק17, תרגום 18 או חילוף חומרים19. בהתחשב בהשפעה שיש ל-PTMs של חמצון-חיזור על תפקוד חלבונים ותהליכים ביולוגיים, חשוב לכמת את מידת החמצון שעובר אתר ציסטאין בתגובה להפרעה במצב חמצון-חיזור.

הזיהוי של אתרי ציסטאין עם מצבי חמצון-חיזור משתנים מתמקד בהשוואה של מצב החמצון ברמה הספציפית לאתר בין תנאים נורמליים לתנאים מופרעים. מדידות שינוי קיפול משמשות לעתים קרובות כדי לקבוע אילו אתרים משתנים באופן משמעותי מכיוון שזה עוזר למשתמשים לפרש אילו אתרי ציסטאין עשויים להיות משמעותיים מבחינה פיזיולוגית למחקר. לחלופין, מדידות סטויכיומטריות של חמצון תיול הפיך על פני סוג דגימה מסוים נותנות תמונה כללית של המצב הפיזיולוגי ביחס לחמצון התאים, מדידה חשובה שלעתים קרובות מתעלמים ממנה ולא מנצלים אותה. סטויכיומטריה של שינוי מבוססת על כימות אחוז התיול המהונדס כיחס לסך החלבון תיול (שונה ולא שונה)20,21. כתוצאה מכך, מדידות סטויכיומטריות מציעות מדידה מדויקת יותר מאשר שינוי קיפול, במיוחד בעת שימוש בספקטרומטריית מסות. ניתן לברר ביתר קלות את משמעות העלייה בחמצון על ידי שימוש בסטויכיומטריה כדי לקבוע את תפוסת ה- PTM של אתר ציסטאין מסוים. לדוגמה, עלייה של פי 3 בחמצון תיול יכולה לנבוע ממעבר של 1% ל-3% או מגודל של 30% עד 90%. עלייה של פי 3 בחמצון עבור אתר שנמצא בתפוסה של 1% בלבד עשויה להיות בעלת השפעה מועטה על תפקוד החלבון; עם זאת, עלייה של פי 3 עבור אתר עם תפוסה של 30% במצב מנוחה עשויה להיות מושפעת באופן משמעותי יותר. מדידות סטויכיומטריות, כאשר הן מבוצעות בין סך כל התיולים המחומצנים לבין שינויים חמצוניים ספציפיים, כולל חלבון גלוטתיוניל (SSG) וניטרוסילציה (SNO), יכולות לחשוף יחסים ומידע כמותי ביחס לסוגי שינויים ספציפיים.

מאחר שחמצון תיול הפיך הוא בדרך כלל שינוי פוסט-טרנסלציוני בעל שפע נמוך, פותחו גישות רבות להעשרת חלבונים המכילים שינויים אלה מתוך דגימות ביולוגיות. גישה מוקדמת שהומצאה על ידי ג'פרי ואחרים, שנקראה טכניקת מתג הביוטין (BST)22, כוללת שלבים מרובים שבהם תיולים ללא שינוי נחסמים באמצעות אלקילציה, תיולים שעברו שינוי הפיך מצטמצמים לתיולים חופשיים מתהווים, תיולים חופשיים מתהווים מסומנים בביוטין, והחלבונים המסומנים מועשרים על ידי משיכה של זיקה לסטרפטאווידין. טכניקה זו שימשה לפרופיל SNO ו- SSG במחקרים רבים וניתן להתאים אותה כדי לחקור צורות אחרות של חמצון תיול הפיך23,24. בעוד ש-BST נוצל כדי לחקור צורות שונות של חמצון תיול הפיך, אחד החששות בגישה זו הוא שההעשרה מושפעת מהקשירה הלא ספציפית של חלבונים לא ביוטינילטים לסטרפטאבידין. גישה חלופית שפותחה במעבדה שלנו, שנקראת לכידה בסיוע שרף (RAC)25,26 (איור 1), עוקפת את הנושא של העשרת קבוצות תיול באמצעות מערכת ביוטין-סטרפטאווידין.

בעקבות הפחתה של תיולים מחומצנים באופן הפיך, חלבונים עם תיולים חופשיים מתהווים מועשרים על ידי שרף זיקה תיול, אשר לוכד באופן קוולנטי קבוצות תיול חופשי, ומאפשר העשרה ספציפית יותר של חלבונים המכילים ציסטאין מאשר BST. צימוד RAC עם כוח הריבוב של ההתקדמות האחרונה בתיוג איזוברי וספקטרומטריית מסות יוצר זרימת עבודה חזקה ורגישה להעשרה, זיהוי וכימות של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך ברמה הרחבה של פרוטאום. ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסות אפשרה פרופיל עמוק הרבה יותר של פרוטאום החיזור של תיול, מה שהגביר את ההבנה של הסיבה והתוצאה של חמצון תיול חלבון27. המידע המתקבל מנתונים כמותיים ספציפיים לאתר מאפשר מחקרים נוספים על ההשפעות המכניסטיות וההשפעות במורד הזרם של שינויים חמצוניים הפיכים28. שימוש בתהליך עבודה זה סיפק תובנה לגבי ההשפעות הפיזיולוגיות של חמצון ציסטאין הפיך ביחס לאירועים פיזיולוגיים נורמליים כגון הזדקנות, שבהם רמות ה- SSG היו שונות ביחס לגיל. השפעות ההזדקנות על SSG התהפכו חלקית באמצעות SS-31 (אלמיפרטיד), פפטיד חדש המשפר את תפקוד המיטוכונדריה ומפחית את רמות ה-SSG בעכברים מבוגרים, מה שגורם להם להיות בעלי פרופיל SSG דומה יותר לעכברים צעירים29.

הודגם כי תנאים פתופיזיולוגיים המיוחסים לחשיפה לננו-חלקיקים מערבים SSG במודל מקרופאגים של עכברים. באמצעות RAC בשילוב עם ספקטרומטריית מסות, החוקרים הראו כי רמות SSG היו בקורלציה ישירה למידת העקה החמצונית ולפגיעה בתפקוד הפאגוציטי של מקרופאגים. הנתונים גם חשפו הבדלים ספציפיים למסלול בתגובה לננו-חומרים מהונדסים שונים הגורמים לדרגות שונות של עקה חמצונית30. השיטה הוכיחה את תועלתה גם במינים פרוקריוטים, שם היא יושמה כדי לחקור את ההשפעות של מחזורים יומיים בציאנובקטריה פוטוסינתטית ביחס לחמצון תיול. נצפו שינויים נרחבים בחמצון תיול במספר תהליכים ביולוגיים מרכזיים, כולל הובלת אלקטרונים, קיבוע פחמן וגליקוליזה. יתר על כן, באמצעות אימות אורתוגונלי, מספר אתרים פונקציונליים מרכזיים אושרו לשינוי, מה שמרמז על תפקידים רגולטוריים של שינויים חמצוניים אלה6.

במאמר זה נתאר את הפרטים של זרימת עבודה מתוקננת (איור 1), המדגימה את התועלת של גישת RAC להעשרת סך כל תיולי ציסטאין מחומצנים של חלבונים ואת התיוג והכימות הסטויכיומטרי שלהם לאחר מכן. תהליך עבודה זה יושם במחקרים של מצב חמצון-חיזור בסוגי דגימות שונים, כולל תרביות תאים27,30 ורקמות שלמות (למשל, שרירי שלד, לב, ריאות)29,31,32,33. למרות שאינו כלול כאן, פרוטוקול RAC מותאם בקלות גם לחקירה של צורות ספציפיות של שינויי חמצון-חיזור הפיכים, כולל SSG, SNO ו-S-acylation, כפי שצוין קודם לכן25,29,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול הנוגעים לדגימות/רקמות של בעלי חיים או בני אדם אושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבני אדם ובבעלי חיים ופעלו על פיה.

1. הומוגניזציה/תזה לדוגמה

  1. דגימות רקמה קפואות
    1. טחינה של רקמה קפואה (~ 30 מ"ג) על מיקרוסקופ זכוכית להחליק על קרח יבש באמצעות סכין גילוח ומלקחיים מראש. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה של 5 מ"ל המכיל 700 μL של חיץ A (ראו טבלה 1) ודוגרים על קרח למשך 30 דקות, מוגנים מפני אור.
    2. לשבש את הרקמה במשך 30 שניות או עד הומוגניות לחלוטין עם הומוגנייזר רקמה ידנית. מניחים את הדגימות על קרח ומניחים לקצף לשקוע עוד 10 דקות.
      הערה: יריעת אפייה מאלומיניום המונחת על קרח יבש מספקת משטח עבודה יציב ופלטפורמה לעיבוד/הטחינה הראשונית של הרקמה.
  2. לחלופין, השתמש בתרביות תאים דביקות במנות תרבית 100 מ"מ כחומר המוצא.
    1. שמור את התאים על קרח והשתמש פיפטה סרולוגית כדי לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח המכיל 100 mM NEM.
    2. Lyse את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של הומוגניזציה קרה / חיץ lysis וגירוד נמרץ עם מגרד תאים קשיח. העבר את הליזאט לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל באמצעות מיקרופיפט.
      הערה: ניתן לשנות את קנה המידה של מאגר השטיפה ומאגר התסיסה בהתאם לכלי תרבות בגדלים שונים. בדרך כלל, 2-5 מיליון תאים נדרשים; עם זאת, זה משתנה בהתאם ליעילות התזה ולתפוקת החלבון עבור סוגי תאים ספציפיים. ניתן להכין מאגר הומוגניזציה ללא NEM לדגימות המנותחות עבור סך כל התיולים.
  3. העבר את ההומוגנט המתקבל (שלב 1.1.2 או 1.2.2) לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל באמצעות מיקרופיפט, וצנטריפוגה במהירות מלאה (≥16,000 × גרם) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. מעבירים את הסופר-נאטנט (~700 μL או ~1 מ"ל לתרבית תאים) באמצעות מיקרופיפט לצינור מיקרוצנטריפוגה חרוטי של 5 מ"ל ודוגרים במשך 30 דקות ב-55 מעלות צלזיוס בחושך עם רעידות ב-850 סל"ד.
  5. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, להוסיף 4 מ"ל של אצטון קר כקרח לדגימות ולדגירה ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה עבור משקעים של חלבון והסרת עודף N-ethylmaleimide.

2. לכידה בסיוע שרף

  1. יש לשטוף את כדורי החלבון המואצים פעמיים באצטון על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, תוך נטרול האצטון, הסרת כל האצטון שנותר באמצעות מיקרופיפטה והוספת 3 מ"ל של אצטון טרי וקר כקרח באמצעות פיפטה סרולוגית מזכוכית. הפוך מספר פעמים כדי לערבב. לאחר השטיפה השנייה, אפשרו לכופתיות להתייבש באוויר במשך 1-2 דקות, היזהרו שלא להתייבש יתר על המידה מכיוון שחידוש עלול להיות קשה.
  2. באמצעות מיקרו-פיפטה, הוסיפו 1 מ"ל של חיץ B (ראו טבלה 1) והסגירו את החלבון באמצעות סוניקציה חוזרת במשך 15-30 שניות בכל פעם באמצעות סוניק אמבטיה עם תפוקה של 250 W ומערבולת קצרה. יש למדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביסיצ'ונינית (BCA) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  3. כדי לתקנן את ריכוזי החלבון על פני דגימות לעיבוד נוסף ולהבטיח הסרה מלאה של NEM, העבר 500 מיקרוגרם חלבון למסנן צנטריפוגלי של 0.5 מ"ל 10 kDa באמצעות מיקרופיפטה והתאם לנפח סופי של 500 μL עם חיץ resuspension.
  4. צנטריפוגה ב-14,000 × גרם בטמפרטורת החדר עד שהנפח במסנן הצנטריפוגלי קטן מ-100 μL. אסוף את הדגימות על ידי היפוך המסנן בצינור איסוף. צנטריפוגה בנפח 1,000 × גרם למשך 2 דקות והתכווננה לנפח סופי של 500 μL באמצעות מאגר C (ראה טבלה 1).
  5. הפחת את תיול החלבון על ידי הוספת 20 μL של 500 mM dithiothreitol (DTT) באמצעות מיקרופיפט לריכוז סופי של 20 mM ודגירה של הדגימות במשך 30 דקות ב 37 °C תוך ניעור ב 850 סל"ד.
  6. לאחר ההפחתה, העבירו את הדגימות באמצעות מיקרופיפט ל-0.5 מ"ל 10 kDa מסננים צנטריפוגליים וצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-14,000 × גרם בטמפרטורת החדר או עד שהנפח במסנן הצנטריפוגלי קטן מ-100 μL. הוסף חיץ D (ראה טבלה 1) כדי להגדיל את הנפח במסנן הצנטריפוגלי ל-500 μL.
    1. חזור על הצנטריפוגה והוסף 500 μL בשלב 2.6 שלוש פעמים, ולאחר הצנטריפוגה הרביעית, אסוף את הדגימות על ידי היפוך המסנן בצינור איסוף וצנטריפוגה ב 1,000 × גרם למשך 2 דקות.
  7. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  8. במהלך חילופי חיץ אלה, הכינו את שרף התיול-זיקה על ידי שקילת כמות השרף המתאימה (30 מ"ג/דגימה) באמצעות מיקרו-איזון והעברתו לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית, מוסיפים מים לריכוז סופי של שרף 30 מ"ג/מ"ל ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם תסיסה להידרציה נכונה של השרף.
    הערה: שרף הזיקה לתיול שהוזכר לעיל הופסק על ידי היצרן. תחליף אפשרי לשרף זיקה תיול זה זמין מסחרית. עם זאת, לתחליף זה יש כמעט פי 5 פחות יכולת כריכה (ראו מידע משלים). לחלופין, ניתן לסנתז את שרף הזיקה לתיול באמצעות אתילאמין הידרוכלוריד 2-(pyridyldithio) ושרף המופעל על-ידי N-הידרוקסיסוקינימיד (ראו מידע משלים).
    1. לאחר הידרציה של שרף, מניחים את עמודי הספין על סעפת ואקום ומעבירים 500 μL של שרף slurry באמצעות micropipette לכל עמודה. החל ואקום להסרת מים; חזור על שלב זה פעם אחת כדי לקבל סך של 30 מ"ג שרף לכל עמודה. לחלופין, צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 2 דקות במקום להשתמש בסעפת הוואקום לשם כך ובכל שלבי שטיפת השרף וההמלטה.
      הערה: חיתוך הקצה של קצה פיפטה 1000 μL כדי להגדיל את גודל הבור מסייע בהעברת השרף. חשוב לטרפד בין פיפטינג כדי להבטיח שהשרף יישאר תלוי וכמויות הומוגניות ושוות של שרף מועברות לכל עמודה.
    2. לשטוף את שרף על ידי הוספת 500 μL של מים ultrapure עם micropipette והחלת ואקום להסרת המים; חזור על כך 5 פעמים. לאחר מכן, יש לשטוף את השרף 5 פעמים עם 500 μL של חיץ E (ראה טבלה 1).
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בצנטריפוגה בגודל 1,000 x גרם למשך 2 דקות במקום סעפת ואקום לכל שלבי השטיפה הבאים. כל שלבי ההדחה המתמשכים מבוצעים בנפח של 500 μL. בעת הוספת מאגרי שטיפה לעמוד, יש להוסיף בזהירות עם מספיק כוח כדי להשהות את השרף במלואו תוך הימנעות מהתזת ואובדן שרף; זה מאפשר שטיפה מלאה ויעילה של שרף.
  9. באמצעות מיקרופיפט, העבר 150 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה מופחתת לצינור חדש והתאם לנפח סופי של 120 מיקרוגרם של מאגר C (ראה טבלה 1). מעבירים את תמיסת החלבון באמצעות מיקרופיפטה לעמוד ספין מחובר המכיל את השרף, מניחים את הפקק על העמודה, ודוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-850 סל"ד.
  10. לשטוף את שרף חמש פעמים עם 25 mM HEPES, pH 7.0; 8 M אוריאה; ואחריו חמש פעמים עם 2 M NaCl; ואחריו חמש פעמים עם 80% אצטוניטריל (ACN) עם 0.1% חומצה טריפלואורואצטית (TFA); ולבסוף חמש פעמים עם 25 mM HEPES, pH 7.7, כמתואר בשלב 2.8.2 ולהחליף את התקע.
    הערה: ניתן לפרט כאן דגימות לניתוח ברמת החלבון (לדוגמה, אלקטרופורזה של ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), כתם מערבי) כמתואר בשלב 4.1.

3. עיכול טריפטי על שרף ותיוג TMT

  1. הכן מספיק תמיסת טריפסין מותאמת ברמת ריצוף עבור 6-8 מיקרוגרם לדגימה על ידי הפיכתה בריכוז של 0.5 מיקרוגרם/מיקרוL במאגר C (ראה טבלה 1) כך שהנפח הסופי יאפשר לפחות 120 μL לדגימה. באמצעות מיקרופיפט, הוסף 120 μL של תמיסת טריפסין זו לדגימות ודגרה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 850 סל"ד.
    הערה: כדי להגביר את יעילות העיכול, ניתן לכלול שלב עיכול נוסף למחרת על ידי הסרת תמיסת הטריפסין והחלפתה בתמיסה טרייה, ולהמשיך את העיכול במשך שעתיים.
  2. לשטוף את שרף חמש פעמים עם 25 mM HEPES, pH 7.0; ואחריו חמש פעמים 2 M NaCl; ואחריו חמש פעמים עם 80% ACN עם 0.1% TFA; ואחריו שלוש פעמים עם 25 mM HEPES, pH 7.7. לבסוף, לשטוף את השרף פעמיים עם 50 mM טריאתיל אמוניום ביקרבונט בופר (TEAB) ולהחליף את התקע.
  3. הכינו ריאגנטים לתיוג TMT בכך שתאפשרו להם להתחמם לטמפרטורת החדר לפני שתסתחררו לזמן קצר באמצעות צנטריפוגה במשקל 16,000 × גרם. הוסף 150 μL של ACN נטול מים לכל בקבוקון של מגיב תיוג TMT באמצעות מיקרופיפט. דגירה של הבקבוקונים בטמפרטורת החדר על תרמומיקסר שנקבע ל-850 סל"ד למשך 5 דקות כדי לבודד את המגיב לחלוטין. מערבלים לזמן קצר ומסתובבים ב-16,000 × גרם כדי לאסוף את המגב.
  4. באמצעות מיקרופיפט, הוסיפו 40 μL של 100 mM TEAB לשרף השטוף, ולאחר מכן הוסיפו 70 μL של מגיב TMT מומס ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-850 סל"ד. אחסן את כל מגיבי TMT שנותרו בטמפרטורה של -80 °C.
    הערה: שימו לב לתוויות TMT הנפרדות המוקצות לכל דגימה ביולוגית (איור 1).
  5. שטפו את השרף חמש פעמים עם 80% ACN עם 0.1% TFA, שלוש פעמים עם חיץ אמוניום ביקרבונט של 100 mM (ABC), pH 8.0, ופעמיים במים כפי שתואר קודם לכן והחליפו את התקע.

4. אלוטיון פפטידי

  1. שדרגו את הפפטידים המסומנים על ידי הוספת 100 μL של 20 mM DTT ב-100 mM ABC, pH 8.0, לכל עמודה באמצעות מיקרופיפטה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על תרמומיקסר שנקבע ל-850 סל"ד.
    הערה: לאחר הוספת DTT, השרף יתגבש. ניתן לשבש את השרף בעזרת קצה פיפטה כדי לשבור גושים ולהבטיח את החמקמקות המלאה של הפפטידים.
  2. לאחר דגירה זו, הניחו את העמודה על סעפת ואקום המיועדת למיצוי פאזה מוצקה (SPE), מרחו ואקום, והכניסו את הדגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה של 5 מ"ל. חזור על שלב זה פעם אחת.
  3. לבסוף, הוסיפו 100 μL של 80% ACN עם 0.1% TFA, דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והתחמקו לאותו צינור צנטריפוגה של 5 מ"ל. לאסוף את כל השברים באותו צינור microcentrifuge 5 מ"ל.
    הערה: כדי למנוע אובדן דגימה, יש להשתמש בצינורות קשירה נמוכים לצורך חילוט, ויש לשמור נפחים בנפח של 4.0 מ"ל או מתחת לצינור יחיד של 5 מ"ל.
  4. מניחים את הדגימות המלוטשות ברכז ואקום עד לייבוש. יש לאחסן את הפפטידים היבשים בטמפרטורה של -80°C ולהשהות אותם מאוחר יותר.
    הערה: דגימות עשויות גם להיות eluted בנפרד, ו aliquot עשוי להיות מוסר ומנותח על ידי SDS-PAGE לניתוח ברמת הפפטיד לפני שילוב הדגימות.

5. אלקילציה פפטידית והתפלה/ניקוי

  1. השהה את הפפטידים המיובשים על ידי הוספת נפח קטן של 100 mM ABC buffer, pH 8.0 (לא יותר מ 500 μL), באמצעות micropipette. השתמש סוניקציה חוזרת במשך 15-30 שניות בכל פעם באמצעות סוניק אמבטיה עם פלט של 250 W ומערבולת כדי solubilize ולהעביר צינור 2 מ"ל.
    הערה: הנפח של 100 mM ABC, pH 8.0 שיש להוסיף מבוסס על אמצעי האחסון הדרוש כדי להשעות מחדש את ה- DTT בעוצמה של 150 mM. המשתמשים יצטרכו לקבוע את כמות ה- DTT הקיימת במדגם שלהם בהתבסס על מה שנוסף במקור בשלב 4.1.
  2. הוסף מספיק תמיסת מלאי מרוכזת (600 mM) של יודואצטמיד (IAA) מומס ב- ABC באמצעות מיקרופיפט כדי להשיג יחס טוחנות של 1:4 של DTT:IAA ודגירה של הדגימות ב- RT למשך שעה אחת עם רעידות ב- 850 סל"ד.
  3. יש לחמצן את הדגימות ל-pH < 3 על ידי הוספת TFA מרוכז (10%) באמצעות מיקרופיפט ולבצע התפלת דגימות באמצעות ניקוי בפאזה הפוכה בהתאם להוראות היצרן.
  4. הניחו את הפפטידים הנקיים ברכז ואקום עד לייבוש. יש לאחסן את הפפטידים היבשים בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח נוסף.

6. ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם

  1. השהה את הפפטידים המיובשים על ידי סוניקציה חוזרת במשך 15-30 שניות בכל פעם באמצעות סוניק אמבטיה עם תפוקה של 250 W ומערבולת ב 20-40 μL של מים המכילים 3% ACN. קבע את ריכוז הפפטידים על ידי ביצוע בדיקת BCA בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. הפרד את הדגימות על-ידי LC בפאזה הפוכה ו-MS/MS כפי שתואר קודםלכן 6 והקלט את ספקטרום MS1 בטווח m/z של 400-2000. ודא שדיסוציאציה התנגשותית באנרגיה גבוהה (HCD) מנוצלת כדי לקבל מידע על עוצמת היונים המדווחים לניתוח של פפטידים המסומנים באופן איזוברי. עיין בסעיפי השיטות של דוחות קודמים לקבלת פרטים נוספים אודות תנאי הפעלת מכשירים 27,30 וניתוח נתוני MS27,31.
    הערה: ניתן להשתמש במערכות או בהגדרות LC-MS/MS שונות כדי לנתח את דגימות הפפטידים. הכיסוי והרגישות של זיהוי פפטידים יהיו תלויים במערכת ובהגדרות המסוימות שבהן נעשה שימוש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השלמת הפרוטוקול תביא להעשרה ספציפית ביותר של פפטידים המכילים ציסטאין שחומצנו בעבר, לעתים קרובות עם ספציפיותשל >95% 27,35,36. עם זאת, מספר שלבים מרכזיים בפרוטוקול דורשים תשומת לב מיוחדת, למשל, חסימה ראשונית של תיולים חופשיים לפני ליזיס דגימה / הומוגניזציה, האוסרת על חמצון מלאכותי והעשרה לא ספציפית של תיולים מחומצנים באופן מלאכותי25. ניתן לנתח דגימות במספר שלבים של הפרוטוקול ובשיטות שונות, כולל ניתוח SDS-PAGE של חלבונים ופפטידים. SDS-PAGE מאפשר ניתוח איכותי של דגימות שבהן דגימות סה"כ-תיול מאפשרות השוואה בין מדדי יחס בין דגימות לקביעת רמות שונות של חמצון כתוצאה מטיפולים/גירויים (איור 2A). כדי לחקור עוד יותר את רמות החמצון של חלבונים בודדים, ג'לים מסוג SDS-PAGE עשויים להיות נתונים לכתםמערבי 36 (איור 2B). זה מאפשר לנתח את מערכת המודל בפירוט רב יותר, לייצר נתונים תומכים והשערות נוספות על רשתות ומסלולים ביולוגיים. ניתן להשתמש בשיטות/נתונים תומכים אלה גם כבקרת איכות כדי לאשר את התגובות הצפויות לפני ניתוח מעמיק נוסף כגון LC-MS/MS. ניתן להשתמש בעוצמות יונים של פפטידים המכילים ציסטאין שנותחו על-ידי LC-MS/MS כדי לכמת סטויכיומטריה של חמצון תיול ברמות אתר Cys בודדות (איור 2C,D).

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה של עיבוד לדוגמה. תהליך עיבוד הדגימה ניתן להתאמה לחקר חמצון תיול בסוגי דגימות שונים ובמערכות ביולוגיות שונות. תהליך העבודה מאפשר חקירה של חמצון הן ברמות החלבון והן ברמות הפפטידים (למשל, SDS-PAGE, כתם מערבי) וכן כיסוי עמוק לזיהוי כמותי וספציפי לאתר של אתרי ציסטאין בודדים באמצעות HPLC בשילוב עם ספקטרומטריית מסה. ניתן להשלים את עיבוד הדגימות תוך שלושה ימים בלבד, כולל השלמת מספר שלבים קריטיים ליצירת נתונים איכותיים ועקביים. ריבוי דגימות באמצעות תיוג TMT מאפשר עיבוד של מספר דגימות במקביל בו זמנית. ערכת הסימון המייצגת של 10-plex TMT ממחישה כיצד ניתן לארגן דגימות בהתחשב בהצלבה הפוטנציאלית מערוץ ה- total-thiol. עם הזיהומים האיזוטופיים של ריאגנטים TMT, עוצמת האות של ערוץ אחד בעוצמה גבוהה (כגון טוטאל-תיול) יכולה לתרום לערוץ אחר עם עוצמת אות נמוכה ולהשפיע על כימות שלו37. בסכימה, ערוץ סה"כ-תיול מרוכז (שילוב של דגימות בקרה וניסוי) צפוי להכיל רמות גבוהות של Cys-פפטידים ומסומן ב-131N, שיהיה לו אות בערוץ 130N. לפיכך, ערוץ 130N אינו משמש בניסוי. כמות crosstalk ערוץ שנוצר על ידי תוויות TMT ניתן למצוא בתעודות הניתוח של היצרן עבור אצווה מתאימה של מגיב. נתון זה הותאם מתוך Guo et al., פרוטוקולי טבע, 201425. קיצורים: NEM = N-ethylmaleimide; DTT = dithiothreitol; SDS-PAGE = נתרן דודצילסולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה; SPE = מיצוי שלב מוצק; LC-MS/MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם; TMT = תג מסה טנדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח פפטידים מהעשרת RAC. (A) ניתוח SDS-PAGE של פפטידים מחומצנים מתאי RAW 264.7 שטופלו במחמצן הכימי, דיאמיד, במשך 30 דקות בריכוזים הולכים וגדלים (0.1 ו-0.5 מ"מ) וסך כל הפפטידים תיולים. תת-דמות זו ותת-איור D מותאמים מתוך Guo et al., Nature Protocols, 2014 25. פפטידים הודגמו על ידי כתמי כסף. (B) תאי RAW 264.7 טופלו במחמצנים אקסוגניים (מי חמצן ודימיד) בריכוזים הולכים וגדלים. החלבון המועשר ב-SSG שנוצר הופרדו על ידי SDS-PAGE ולאחר מכן נחקרו על ידי כתם מערבי עבור חלבונים בודדים (GAPDH, TXN, PRDX3 ו-ANXA1). תת-דמות זו מותאמת מתוך Su et al., ביולוגיה ורפואה של רדיקלים חופשיים, 201436. (C) נתוני ספקטרום MS/MS מייצגים של פפטיד המכיל ציסטאין הנצפים בתוכנת Xcalibur. תמונת MS/MS המשובצת מציגה את עוצמות יוני הכתב המתאימות עבור אותו פפטיד בכל ערוץ TMT. בניסוי זה, דגימת התיול הכוללת הוקצתה לתווית TMT 131N, בעלת העוצמה הגבוהה ביותר מכל הערוצים ששימשו בניסוי. (D) סטויכיומטריה של פפטידים מחומצנים בעלי תווית iTRAQ, מועשרים ומחומצנים כפי שנמדדו על-ידי LC-MS/MS. תעלת התיול הכוללת שימשה כהפניה לחישוב הסטויכיומטריה של החמצון בהתבסס על היחס בין עוצמת היונים המדווחים של כל דגימה בהשוואה לזו של תעלת התיול הכוללת. קיצורים: RAC = לכידה בסיוע שרף; SDS-PAGE = נתרן דודצילסולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה; Ctrl = שליטה; GAPDH = גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז; TXN = תיאורדוקסין; PRDX3 = רדוקטאז חמצן תלוי תיאורדוקסין; ANXA1 = נספח A1; LC-MS/MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם; MS/MS = ספקטרומטריית מסת טנדם; TMT = תג מסה טנדם; iTRAQ = תג איזוברי עבור כמות יחסית ומוחלטת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שם המאגר תכלית תוכן
מאגר א' ליזה/הומוגניזציה 250 mM 2-(N-מורפולינו)חומצה אתנוסולפונית (MES), pH 6.0; 1% נתרן דודצילסולפט (SDS); 1% טריטון X-100; ו-100 mM N-אתיל-מאלימיד (NEM)
מאגר ב' ההשעיה מחדש בעקבות משקעי חלבון והחלפת חיץ ראשונה 250 mM 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), pH 7.0; 8 M אוריאה; 0.1% SDS
מאגר C הפחתה/ העשרה/ עיכול חלבונים המכילים ציסטאין 25 mM HEPES, pH 7.7; 1 M אוריאה; 0.1% SDS
מאגר D החלפת חיץ שנייה לאחר הפחתה 25 mM HEPES, pH 7.0, 8 M אוריאה; 0.1% SDS
מאגר E שטיפת השרף לאחר הידרציה 25 מ"מ HEPES, pH 7.7

טבלה 1.  רשימת מאגרים

מידע משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לכידה בסיוע שרף שימשה במגוון סוגי דגימות ומערכות ביולוגיות לחקר שינויים חמצוניים של שאריות ציסטאין25,29,30. שיטה זו מאפשרת הערכה של דגימות ברמות וקריאות מרובות, כולל חלבונים ופפטידים באמצעות SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים, כמו גם אתרי ציסטאין בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה. ללא קשר לסוג הדגימה או לנקודת הקצה הסופית, השיטה מאפשרת בסופו של דבר העשרה יעילה וספציפית ביותר של חלבונים ופפטידים המכילים ציסטאין38. באמצעות RAC, זיהינו שינויים במצב החמצון של עד כמה אלפי אתרי ציסטאין במערכות מודל שונות בעקבות הפרעה.

בעכברים שהיו נתונים להתכווצויות שרירים קטלניות, זוהו 2,200 אתרי S-גלוטתיונילציה, כאשר יותר ממחציתם שינו באופן משמעותי את רמות S-גלוטתיוניל 32. RAC שימש גם לפרופיל חמצון תיול הפיך של >2,100 אתרים בציאנובקטריה בעקבות חשיפה למעכב פוטוסינתזה או תנאי אור שונים6. לאחרונה, ביצענו פרופיל של חמצון תיול הפיך כולל ו-S-גלוטתיונילציה של >4,000 אתרי ציסטאין בתאי מקרופאג' RAW 264.7 בתנאי מנוחה27. באופן דומה, Behring et al. כימתו את החמצון של ~4,200 אתרי ציסטאין בתאי A431 בעקבות גירוי גורם גדילה אפידרמלי39. מחקרים אלה מדגימים את החוסן של RAC כדי לזהות אתרי ציסטאין רבים (לפחות כמה אלפים) שעוברים חמצון תיול הפיך. בנוסף, פיצול הדגימות יכול לשפר את הכיסוי של פפטידים שהתאוששו מניסוי.

מחוץ לבקרות ניסיוניות, שבהן ניתן להשתמש בדגימות בקרה חיוביות או שליליות כדי לאשר את התגובות הביולוגיות של מערכת המודל, ניתן לבצע העשרת טוטל-תיול במקביל לחמצון של תיולים. דגימת סה"כ-תיול זו מספקת הן השוואות סטויכיומטריות והן קו בסיס שממנו ניתן להשוות דגימות ניסיוניות או מטופלות. בקצרה, דגימת סה"כ-תיול זו מספקת מדידה של המספר הכולל של תיול ציסטאין עבור אתר Cys נתון בדגימה נתונה. תפיסה זו אומצה גם על ידי שיטת OxiTMT, המייצרת דגימות המכילות תיולים מופחתים לחלוטין המייצגים "תוכן ציסטאין כולל" להשוואה מול ציסטאין מחומצן40.

בניגוד ל- OxiTMT, RAC אינו מוגבל על ידי מספר ה- plex של iodoTMT ולכן יכול לשלב יותר ערוצי תיול כוללים כדי לייצג טוב יותר את תכולת התיול של סוגי דגימות מרובים המשמשים במחקר. בנוסף, ייתכן שיהיה צורך בהכנת דגימה גלובלית (שאינה כפופה להעשרה) במקביל לתהליך העבודה של פרוטאומיקה של חמצון-חיזור תיול כדי לבדוק אם שפע החלבונים משתנה בסוגי דגימות שונים. מכיוון שהשיטה ניתנת להתאמה לסוגים מרובים של שינויי חמצון-חיזור, יש לשקול בקרות מתאימות לשינוי הספציפי של העניין. לדוגמה, אור אולטרה סגול וכספית כלוריד יעילים שניהם בבקעת SNO מחלבונים, ויוצרים בקרה שלילית יעילה למדידת SNO 7,25. בקרה יעילה לחקר חלבונים שעברו עיבוד SSG היא השמטת האנזים גלוטרדוקסין מקוקטייל ההפחתה במהלך שלב ההפחתה. בשל הספציפיות הגבוהה יחסית של גלוטרדוקסין, השמטתו מבטלת את הפחתת החלבונים המעובדים SSG ומונעת מהם לעבור חילופי דיסולפידים ובסופו של דבר להעשיר בניתוח הסופי36.

ישנם מספר שלבים בזרימת העבודה עבור RAC שהם בסיסיים ליצירת נתונים איכותיים הניתנים לשחזור. אחד הצעדים המכריעים הראשונים, והחשוב ביותר, הוא אלקילציה/חסימה של תיולים חופשיים באמצעות חומר האלקילציה החדיר לממברנה, N-ethylmaleimide (NEM), המגיב במהירות על פני טווח pH רחב 41,42. שלב זה אוסר על חימצון של תיולים מתהווים במהלך עיבוד הדגימה, ומפחית את ההעשרה הלא ספציפית של תיולים מחומצנים באופן מלאכותי אלה במהלך העשרת חילופי דיסולפידים. אלקילציה לא מספקת תגרום לעלייה ברקע ובאיתות חיובי כוזב, כפי שזוהה בדו"ח קודם6.

עם זאת, בגלל התגובתיות הגבוהה שלו ויכולתו לחסום תיולים חופשיים, יש לנקוט משנה זהירות גם כדי להבטיח את הסרתו המלאה מדגימות לפני ההעשרה, כאשר כל NEM שנותר יכול להיקשר ולהפריע לצימוד שרף, ובסופו של דבר לגרום לאובדן האות עקב ירידה בקשירת החלבון. זה נעשה על ידי ביצוע משקעי אצטון וכמה סבבים של חילופי חיץ באמצעות מסנני חיתוך משקל מולקולרי. ניטור ושמירה על pH תקין לאורך כל הפרוטוקול הוא גם חיוני. pH של 6.0 נשמר כדי למתן את הדשדוש הדיסולפידי ואת היווצרותם של דיסולפידים מעורבים לפני העשרה. צעדים אחרים שבהם יש לנקוט משנה זהירות כוללים את צעדי ההעשרה וההעשרה, כאשר ערכי pH של 7.7 ו-8.0 נדרשים לצורך העשרה והרחבה נאותה, בהתאמה. ערכי pH שגויים במהלך שלבים אלה יגרמו לירידה או אובדן של האות.

נכון להיום, ישנן שיטות רבות המבוססות על כימיה מלבד RAC הנמצאות בשימוש נרחב לחקר חמצון ציסטאין תיול, כולל השיטה הנפוצה ביותר, טכניקת מתג ביוטין43,44. דבר אחד המשותף לכל השיטות הללו, כולל RAC, הוא שהן מבוססות על שיטות עקיפות לזיהוי ציסטיינים מחומצנים. הם מסתמכים על מתווכים שעברו שינוי כימי של התיול המחומצן המקורי לצורך זיהוי. עם זאת, תכונה מרכזית המבדילה את RAC משיטות אחרות היא היכולת לאסוף נתונים כמותיים מרובים על אתרי ציסטאין ספציפיים של תיולים מחומצנים.

השיטה מבוצעת עם חלבונים/פפטידים הקשורים באופן קוולנטי לשרף, מה שמאפשר לבצע שלבי המשך (למשל, הפחתה, תיוג, שטיפה, עיכול) ללא טיפול נוסף. על-ידי ביצוע LC-MS/MS על דגימות מרובות, נוצרים מערכי נתונים המאפשרים תגליות כלל-פרוטאומיות. ההשפעות של טיפול או גירויים ספציפיים על פני מספר קבוצות מדגם נצפות ברמה הגלובלית, מה שמאפשר גילוי של מנגנונים ומסלולים חדשים. זרימת העבודה הבסיסית ניתנת להתאמה רבה לצרכים ולתחומי העניין הספציפיים של משתמשי הקצה. אימות אורתוגונלי של ממצאים שנצפו בנתוני ספקטרומטריית מסות נותר אתגר. מוטגנזה מכוונת אתר של אתר מסוים ושימוש במבחנים החוקרים את ההשפעות הנובעות מכך היא גישה נפוצה אך עתירת עבודה.

כדי לסנן אתרים מועמדים שעשויים להיות משמעותיים מבחינה ביולוגית, ניתן להשתמש במחקרים ביואינפורמטיים כדי ללמוד יותר על המאפיינים של אתר עם רמת חמצון גבוהה, כגון קרבתו של אתר לאתר פעיל או למבנה משני27. סימולציות של דינמיקה מולקולרית עשויות להתגלות כבעלות ערך רב במחקרים עתידיים, שכן הן יכולות למדל את ההשפעות של שינויים בחמצון-חיזור על מבנה החלבון ולספק תובנה לגבי האופן שבו תפקודו של חלבון עשוי להיות מושפעב-13,45. על ידי יישום אסטרטגיה איתנה זו, אנו מקווים שהקהילה המדעית תרוויח מהתאמת שיטה זו למערכת המודלים הייחודית שלהם ותרחיב את הידע הנוכחי על ביולוגיה של חמצון-חיזור על פני מודלים ומערכות ביולוגיות רבות ושונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים, כספי או אחר.

Acknowledgments

חלקים מהעבודה נתמכו על ידי מענקי NIH R01 DK122160, R01 HL139335 ו- U24 DK112349

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride Med Chem Express HY-101794 Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes Eppendorf 22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes Eppendorf 30108310
5.0 mL round bottom tubes Falcon 352054
Acetone Fisher Scientific A949-1
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Activated Thiol–Sepharose 4B Sigma Aldrich T8512 Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter Millipore Sigma UFC5010BK
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 09830
Bicinchonicic acid (BCA) Thermo Scientific 23227 Protein Assay Reagent
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5415R
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific 20291
EDTA Sigma Aldrich E5134
HEPES buffer Sigma Aldrich H4034
Homogenizer BioSpec Products 985370
Iodoacetimide (IAA) Sigma Aldrich I1149
N-ethylmaleimide Sigma Aldrich 4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow Cytiva 17-0906-01 Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich L6026
Sonicator Branson 1510R-MT
Spin columns Thermo Scientific 69705
Strata C18-E reverse phase columns Phenomenex 8B-S001-DAK Peptide desalting
Thermomixer Eppendorf 5355
Thiopropyl Sepharose 6B GE Healthcare 17-0420-01 Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex) Thermo Scientific A44522 Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) Sigma Aldrich T7408
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich T6508
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Trypsin Promega V5820
Urea Sigma Aldrich U5378
Vacufuge Plus speedvac Eppendorf 22820001 vacuum concentrator
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  2. Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
  3. Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824 (2021).
  4. Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867 (2021).
  5. Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
  6. Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
  7. Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051 (2020).
  8. Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167 (2017).
  9. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  10. Go, Y. M., Jones, D. P. The redox proteome. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).
  11. Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
  12. Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997 (2015).
  13. Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486 (2019).
  14. Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -P., Dietz, K. -J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515 (2020).
  15. Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
  16. Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173 (2014).
  17. Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
  18. Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324 (2018).
  19. Gao, X. -H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
  20. Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
  21. Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
  22. Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
  23. Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
  24. Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
  25. Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  26. Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
  27. Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649 (2020).
  28. Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
  29. Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
  30. Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
  31. Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758 (2020).
  32. Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
  33. Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513 (2020).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
  36. Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
  37. Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354 (2020).
  38. Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
  39. Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315 (2020).
  40. Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
  41. Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
  42. Hsu, M. -F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
  43. Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
  44. Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
  45. Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).

Tags

ביוכימיה גיליון 172 RAC TMT פרוטאומיקה של חמצון-חיזור תיול ציסטאין סטויכיומטריה PTM שינויי חמצון-חיזור
לכידה בסיוע שרפים בשילוב עם תיוג תג מסת טנדם איזוברי לכימות מרובב של חמצון חלבון תיול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaffrey, M. J., Day, N. J., Li, X.,… More

Gaffrey, M. J., Day, N. J., Li, X., Qian, W. J. Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation. J. Vis. Exp. (172), e62671, doi:10.3791/62671 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter