Summary
यह लेख प्राथमिक और अमर सेल लाइन पर यूवी विकिरण और रासायनिक विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं का वर्णन करता है।
Abstract
यह लेख प्राथमिक (पीएचसीईसी) और अमर (आईएचसीईसी) मानव कॉर्नियल उपकला कोशिका संस्कृतियों पर पराबैंगनी (यूवी) विकिरण और ओकुलर विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता को मापने के तरीकों का वर्णन करता है। कोशिकाओं को यूवी विकिरण और बेंजालकोनियम क्लोराइड (बीएके), हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ2),और सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) की विषाक्त खुराक के संपर्क में लाया गया था। चयापचय गतिविधि को चयापचय परख का उपयोग करके मापा गया था। भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई को मल्टी-प्लेक्स इंटरल्यूकिन (आईएल)-13, आईएल -6, आईएल -8, और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ -α) परख का उपयोग करके मापा गया था, और फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया था।
सेल चयापचय गतिविधि और साइटोकिन रिलीज पर यूवी के हानिकारक प्रभाव आईएचसीईसी के लिए यूवी एक्सपोजर के 5 मिनट और पीएचसीईसी के लिए 20 मिनट पर हुए। आईएचसीईसी और पीएचसीईसी की चयापचय गतिविधि में समान प्रतिशत गिरावट बीएके, एच 2 ओ2, या एसडीएस के संपर्क में आने के बाद हुई, और आईएल -6 और आईएल -8 के लिए साइटोकिन रिलीज में सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तन हुए। फ्लोरोसेंटली सना हुआ आईएचसीईसी और पीएचईसी बीएके-उजागर कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी ने 0.005% बीएके एक्सपोजर पर कोशिका मृत्यु दिखाई, हालांकि पीएचईसी की तुलना में आईएचसीईसी में एथिडियम धुंधलाहोने की डिग्री अधिक थी। माइक्रोस्कोपी, चयापचय गतिविधि के आकलन और साइटोकिन उत्पादन का उपयोग करके विषाक्त प्रभावों का आकलन करने के कई तरीकों का उपयोग करते हुए, यूवी विकिरण और रासायनिक विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता को प्राथमिक और अमर सेल लाइनों दोनों के लिए निर्धारित किया जा सकता है।
Introduction
इन विट्रो टॉक्सिकोलॉजी अध्ययन रसायनों और अन्य एजेंटों के विषाक्त प्रभावों की भविष्यवाणी करने के लिए किया जाता है जो कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकते हैं। कॉर्निया के लिए विषाक्तता के आकलन में, मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं (एचसीईसी) का उपयोग इन प्रभावों के मूल्यांकन के लिए मॉडल में किया गया है 1,2,3,4। ये मॉडल आमतौर पर शारीरिक प्रभावों का मूल्यांकन करते हैं जैसे कि सेल की चयापचय गतिविधि, सेल प्रसार, और अन्य सेल कार्यों जैसे कि भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन और रिलीज। इन विष विज्ञान अध्ययनों के लिए, एचसीईसी 2,3 पर रसायनों और यूवी विकिरण के हानिकारक प्रभावों का आकलन करने के लिए विभिन्न स्रोतों से कोशिकाओं का चयन किया गया है। पीएचईसी लाइनें उन कंपनियों से उपलब्ध हैं जो वयस्कों के दाता ऊतकों से इन कोशिकाओं को प्रदान करती हैं। प्राथमिक कोशिकाओं को डिस्पेस के साथ इलाज किया जा सकता है और धीरे से कल्चर5 के लिए कॉर्निया से स्क्रैप किया जा सकता है। कोशिकाओं को तब वायरस और संदूषण के लिए परीक्षण किया जाता है और फिर 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड में क्रायोसंरक्षित भेज दिया जाता है।
प्राथमिक सेल लाइनों का लाभ यह है कि कोशिकाएं आनुवंशिक रूप से दाता की कोशिकाओं के समान होती हैं। यह आदर्श है, क्योंकि एक इन विट्रो मॉडल को जितना संभव हो सके विवो ऊतक की नकल करनी चाहिए। प्राथमिक सेल लाइनों का नुकसान यह है कि उनके पास सीमित संख्या में कोशिका विभाजन या मार्ग6 हैं। उपलब्ध कोशिकाओं की सीमित संख्या उन प्रयोगों की संख्या को प्रतिबंधित करती है जिन्हें एकल प्राथमिक संस्कृति के साथ आयोजित किया जा सकता है, जिससे प्रयोगों की लागत बढ़ जाती है।
अमर सेल लाइनों का उपयोग सेल कल्चर विषाक्तता मॉडल में भी किया गया है। हालांकि, विवो ऊतक से प्राप्त प्राथमिक सेल लाइन के विपरीत, अमर सेल लाइन को आनुवंशिक रूप से बदल दिया गया है। अमर कोशिकाओं को प्राथमिक कोशिकाओं 6,7,8 के डीएनए में वायरस के जीन को शामिल करके बनाया जाता है। सफल वायरल जीन निगमन वाली कोशिकाओं को अमर सेल लाइन के लिए चुना जाता है। अमरीकरण का लाभ यह है कि यह अनिश्चित तेजी से प्रसार की अनुमति देता है, एक ही सेल लाइन का उपयोग करके कई प्रयोगों को करने के लिए असीमित संख्या में कोशिकाओं को प्रदान करता है। यह प्रयोगों के बीच स्थिरता की अनुमति देता है और लागत को कम करता है।
कोशिका प्रसार को सीमित करने वाले जीन में परिवर्तन के अलावा, महत्वपूर्ण कार्यक्षमता के जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तनभी हो सकता है। इसलिए, अमर कोशिकाओं का उपयोग करने का नुकसान यह है कि वे अब विभिन्न बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के संदर्भ में विवो कोशिकाओं में मूल का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकतेहैं। तुलना में प्राथमिक और अमर मानव कॉर्नियल केराटोसाइट्स11, साथ ही अमर एचसीईसी और खरगोश कॉर्नियल उपकला प्राथमिक कोशिकाओं12 पर रसायनों के विषाक्त प्रभावों को देखना शामिल है। प्राथमिक मानव केराटोसाइट्स और अमर केराटोसाइट्स पर विषाक्त पदार्थों के प्रभावों के बीच तुलना ने कोईमहत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। इस लेख में विस्तृत तरीकों का उपयोग करते हुए, पीएचईसी और आईएचसीईसी पर यूवी विकिरण और ओकुलर विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता का आकलन करने के लिए इन परखों की प्रभावशीलता निर्धारित की जाएगी।
आमतौर पर इन विट्रो परख में उपयोग किए जाने वाले तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों का चयन किया गया था: बीएके, एच 2 ओ2, और एसडीएस। बीएके आमतौर पर नेत्र समाधान 13,14 में उपयोग किया जाने वाला एक धनिक संरक्षक है,एच 2 ओ2 का उपयोग आमतौर पर संपर्क लेंस 15 को कीटाणुरहित करने के लिए किया जाता है, और एसडीएस एक आयनिक सर्फेक्टेंट है जो डिटर्जेंट और शैंपू 14 में पाया जाता है। ओकुलर विषाक्त पदार्थों के समान, यूवी विकिरण भी एचसीईसी3 को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अलावा, यूवी के लिए ओवरएक्सपोजर एक ओकुलर स्थिति पैदा कर सकता है जिसे फोटोकेराटाइटिस के रूप में जाना जाता है जो फाड़ने, प्रकाश संवेदनशीलता औरकिरकिरापन की भावना के लक्षणों की विशेषता है।
प्राथमिक सेल संस्कृतियों की एक असीमित संख्या है जिसका उपयोग किया जा सकता है और विभिन्न अमर सेल लाइनें विकसित की गई हैं। इसलिए, इन प्रकार की कोशिकाओं को शामिल करने वाले मॉडलों के बीच समानता और अंतर निर्धारित करने के लिए प्राथमिक एचसीईसी की तुलना एक अमर एचसीईसी लाइन से करने के लिए एक जांच की गई थी।
इस जांच ने यूवी और विषाक्त पदार्थों के लिए सेल शारीरिक प्रतिक्रिया पर पीएचईसी और आईएचसीईसी के बीच संभावित अंतर का आकलन करने के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया। सेल चयापचय गतिविधि और दो सेल लाइनों के लिए भड़काऊ साइटोकिन रिलीज पर यूवी विकिरण और रसायनों के प्रभावों का भी मूल्यांकन किया गया था। दो सेल लाइनों के बीच अंतर निर्धारित करने का महत्व मूल्यांकन के लिए इन सेल लाइनों के इष्टतम उपयोग को समझना है: 1) कोशिकाओं पर यूवी विकिरण का प्रभाव, 2) कोशिकाओं पर विषाक्त पदार्थों का प्रभाव, और 3) भविष्य के अध्ययनों के लिए चयापचय, सेल व्यवहार्यता और सेल साइटोकिन रिलीज में परिणामी परिवर्तन।
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Protocol
1. पीएचईसी और आईएचसीईसी की संस्कृति
- निम्नलिखित पूरक के साथ मानव ओकुलर एपिथेलियल माध्यम (एचओईएम) में पीएचईसी और आईएचसीईसी विकसित करें: 6 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 0.002% सेल मीडिया पूरक ओ (सामग्री की तालिका), 1.0 μM एपिनेफ्रीन, 0.4% सेल मीडिया पूरक पी (सामग्री की तालिका), 5 μg / mL rh इंसुलिन, 5 μg / mL एपो-ट्रांसफरिन, और 100 ng / mL हाइड्रोकार्टिसोन हेमिसुसिनेट कोलेजन -1 लेपित कल्चर फ्लास्क में 18मिलीलीटर
- कोशिकाओं के ~ 80% संगम तक बढ़ने के बाद माध्यम को हटाकर हर 2-3 दिनों में फ्लास्क में माध्यम बदलें। फिनोल लाल के बिना पृथक्करण समाधान जोड़ें और फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं पूरी तरह से अलग न हो जाएं। सीरम के साथ डीएमईएम / एफ 12 के साथ पृथक्करण समाधान को बेअसर करें और फिर कोशिकाओं को 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला माध्यम को हटा दें और एचओईएम माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
2. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल आकार का निर्धारण
- पीएचसीईसी और आईएचसीईसी दोनों को कोलेजन-लेपित पेट्री व्यंजनों पर ग्लास-बॉटम कवरलिप्स के साथ 1 × 105 की एकाग्रता पर 1 एमएल एचओईएम के साथ बीज दें। 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पीएचईसी और आईएचसीईसी, 24 घंटे के लिए संस्कृतियों का एक सेट और 48 घंटे के लिए संस्कृतियों का दूसरा सेट विकसित करें।
- इनक्यूबेशन अवधि के बाद, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कैल्सीन (4 μM), एथिडियम होमोडीमर -1 (8 μM), और एनेक्सिन V (500 μL बफर-Alexa Fluor 647 संयुग्म में 5 μL) युक्त एनेक्सीन धुंधला बफर समाधान के 500 μL के साथ दाग दें। कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद, कैल्सीन-एएम के लिए 488/515 एनएम, एथिडियम होमोडीमर -1 के लिए 543/600 एनएम और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एनेक्सीन वी के लिए 633/665 एनएम के उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को कैप्चर करने के लिए माइक्रोस्कोप को समायोजित करें।
- छवियों को प्राप्त करें और तीन आयामों में सेल आकार का आकलन करने के लिए जेड-स्टैक्स लें।
- दो-आयामी (2 डी) और तीन-आयामी (3 डी) छवियों को प्राप्त करने के लिए, एपोक्रोमैट 40x / 1.2 जल उद्देश्य के साथ छवि बनाने के लिए क्षेत्र का पता लगाएं। आर्गन (488) (पहला स्कैन), हेन1 (543) (दूसरा स्कैन, और हेन2 (633) (तीसरा स्कैन) लेजर के साथ, बीम स्प्लिटर्स, एचएफटी 488/543/633, एनएफटी 635 विस और एनएफटी 545 एलपी 560, एलपी 505 का उपयोग करके तीन अलग-अलग चैनलों में स्कैन करें।
- क्रॉसटॉक को कम करने के लिए मल्टी-ट्रैक अनुक्रमिक स्कैनिंग का उपयोग करें।
नोट: एलपी 505 का उपयोग चैनल 2 के लिए 488 लेजर के साथ कैल्सीन डाई के उत्सर्जन को पकड़ने के लिए किया जाता है। एलपी 560 का उपयोग चैनल 3 में 543 लेजर के साथ एथिडियम होमोडीमर 1 के उत्सर्जन को पकड़ने के लिए किया जाता है। एनएफटी 635 का उपयोग एनेक्सीन वी के उत्सर्जन को पकड़ने के लिए 633 लेजर के साथ किया जाता है। एचएफटी का उद्देश्य उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश को अलग करना है। एनएफटी प्रकाश < निर्दिष्ट तरंग दैर्ध्य को एक अलग चैनल में प्रतिबिंबित करके प्रकाश को विभाजित करता है, जबकि प्रकाश को एक निर्दिष्ट तरंग दैर्ध्य > दूसरे चैनल के माध्यम से अनुमति देता है। एलपी फिल्टर निर्दिष्ट तरंग दैर्ध्य की तुलना में कम तरंग दैर्ध्य को अवरुद्ध करते हैं और लंबी तरंग दैर्ध्य को गुजरने देते हैं। - 3 डी में छवि बनाने के लिए, कॉन्फोकल को जेड-स्टैक पर सेट करें और कम से कम 20 फ्रेम स्कैन करें।
3. यूवी विकिरण के लिए कोशिकाओं का संपर्क
- कोशिकाओं को 24-अच्छी कोलेजन -1 लेपित संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में एचओईएम के 5 ×10 4/एमएल पर बीज दें और 3 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि के बाद, कुओं में माध्यम की मात्रा को 300 μL तक कम करें। इसके बाद, कोशिकाओं को अलग-अलग प्रयोगों में 5 और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में यूवी विकिरण (यूवीए 6.48 डब्ल्यू / एम 2 पर यूवीए और यूवीबी दोनों 1.82 डब्ल्यू / एम2 पर यूवीबी और यूवीबी दोनों को चालू किया जाता है) के लिए उजागर करें।
- यूवी विकिरण के बाद, प्रत्येक कुएं में 200 μL ताजा HOEM जोड़ें और 5%CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक कुएं में सेल सुपरनैटेंट इकट्ठा करें और इसे बाँझ 2 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। यूवी एक्सपोजर के बाद पीएचसीईसी और आईएचसीईसी द्वारा जारी साइटोकिन स्तर निर्धारित करने के लिए, मल्टीप्लेक्स साइटोकिन परख का उपयोग करें और निम्नलिखित चार साइटोकिन्स को निर्धारित करने के लिए किट के निर्देशों का पालन करें: आईएल -6, आईएल -8, आईएल -1 और टीएनएफ -α।
- कुओं में कोशिकाओं में चयापचय परख अभिकर्मक जोड़ें।
- डीएमईएम / एफ 12 में 10% चयापचय परख अभिकर्मक तैयार करें। प्रत्येक कुएं में कल्चर माध्यम को 10% चयापचय परख समाधान के 1 एमएल के साथ बदलें और 4 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- 530/590 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक समाधान की प्रतिदीप्ति को मापें।
4. रासायनिक विषाक्त पदार्थों के लिए कोशिकाओं का संपर्क
- 24-वेल कोलेजन -1 लेपित कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में एचओईएम के 5 ×10 4/एमएल पर बीज कोशिकाएं और 3 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि के बाद, माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 5 और 15 मिनट के लिए फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस)) में 1 एमएल रासायनिक विषाक्त पदार्थों (बीएके 0.001%, एच 2 ओ20.01%, और एसडीएस 0.0025%) के संपर्क में लाएं।
- रासायनिक विषाक्त पदार्थों के संपर्क में आने के बाद, कुओं से विषाक्त पदार्थों को हटा दें, 1 एमएल पीबीएस के साथ कुल्ला करें, और प्रत्येक कुएं में 1 एमएल एचओईएम जोड़ें। 20 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को 10% चयापचय परख समाधान के 1 एमएल के साथ बदलकर और 4 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इंक्यूबेट करके एक चयापचय परख करें। 530/590 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरेसेंस मल्टी-वेल प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति को मापें।
- 20 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद कुओं से सेल सुपरनैटेंट को अलग-अलग बाँझ 2 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। रसायनों के संपर्क में आने के बाद पीएचईसी और आईएचसीईसी द्वारा जारी साइटोकिन्स की मात्रा निर्धारित करें। यूवी-उपचारित कोशिकाओं से साइटोकिन्स का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही मल्टीप्लेक्स प्लेटफॉर्म का उपयोग करें। निम्नलिखित चार साइटोकिन्स को निर्धारित करने के लिए किट के निर्देशों का पालन करते हुए मल्टीप्लेक्स साइटोकिन परख का उपयोग करें: आईएल -6, आईएल -8, आईएल -1 और टीएनएफ -α।
5. बीएके की विभिन्न सांद्रता के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं की परीक्षा
- 24-वेल कोलेजन -1 लेपित कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में एचओईएम के 1 ×10 5 / एमएल पर बीज कोशिकाएं और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि के बाद, माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 1 एमएल रासायनिक विषाक्त पदार्थों (बीएके 0.001%, बीएके 0.005%, और बीएके 0.01% पीबीएस में) के संपर्क में लाएं।
- एक्सपोजर के बाद, रासायनिक विषाक्त पदार्थों को हटा दें, कुओं को 1 एमएल पीबीएस के साथ कुल्ला करें, और प्रत्येक कुएं में 1 एमएल एचओईएम जोड़ें। 20 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कैल्सीन (4 μM), एथिडियम होमोडीमर -1 (8 μM), और एनेक्सिन V (500 μL बफर-एलेक्सा फ्लुर 647 संयुग्म में 5 μL) युक्त एनेक्सीन स्टेनिंग बफर समाधान के 500 μL के साथ दाग दें। क्रमशः 630/675 एनएम, 495/515 एनएम और 528/617 एनएम के उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एनेक्सीन वी, कैल्सीन एएम और एथिडियम -1 धुंधला होने की तीव्रता को मापने के लिए माइक्रोस्कोप को समायोजित करें। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की छवि बनाएं।
6. डेटा विश्लेषण
- विचरण (एनोवा), वेल्च एनोवा या क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का विश्लेषण करने से पहले एक सामान्यता परीक्षण और समान विचरण के लिए एक परीक्षण करें। परीक्षण किए गए प्रत्येक समूह की तुलना करने के लिए उपयुक्त पोस्ट-हॉक परीक्षण का उपयोग करें। p < 0.05 सेट करें।
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Representative Results
सेल का आकार
प्राथमिक और अमर एचसीईसी को तीन फ्लोरोसेंट रंगों के साथ देखा गया था, जो सेल व्यवहार्यता के तीन अलग-अलग चरणों को दर्शाते हैं। जीवित कोशिकाएं हरी (कैल्सीन-एएम) होती हैं, मृत कोशिकाएं लाल होती हैं (एथिडियम होमोडीमर -1), और एपोप्टोटिक कोशिकाएं पीली होती हैं (प्रतिदीप्ति संकेत के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एनेक्सिन वी-कंप्यूटर-समायोजित रंग)। जीवित कोशिकाओं में कोशिका साइटोप्लाज्म में एस्टरेज़ होते हैं और कैल्सीन-एएम को कैल्केन में परिवर्तित करते हैं। मृत कोशिकाओं में कोशिका झिल्ली होती है जो एथिडियम होमोडीमर -1 के लिए पारगम्य होती है। एपोप्टोटिक कोशिकाओं में कोशिका झिल्ली पर धुंधलापन होता है क्योंकि फॉस्फेटिडिलसेरिन बाहरी झिल्ली में स्थानांतरित हो जाता है।
24 और 48 घंटे की वृद्धि के बाद दो प्रकार के एचसीईसी के लिए सेल आकार की तुलना कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके की गई थी, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। iHCECs (चित्रा 1A) छोटी कोशिकाएं हैं जो 10 μm से 20 μm तक होती हैं, और pHCECs (चित्रा 1B) 24 घंटे की वृद्धि के बाद आकार में 20 μm से 50 μm तक होती हैं। 48 घंटे की वृद्धि के बाद आईएचसीईसी (चित्रा 1 सी) और पीएचसीईसी (चित्रा 1 डी) के लिए आकार सीमा में समान अंतर देखा गया। दो प्रकार के एचसीईसी की 3 डी छवियां कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बनाई गई थीं (चित्रा 2 ए पीएचईसी दिखाता है; चित्रा 2 बी आईएचसीईसी दिखाता है)।
चित्रा 1: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल के आकार की तुलना । 24 (ए) और 48 (सी) एच के बाद 10 से 20 μm तक के आकार की कोशिकाओं के साथ iHCEC. 24 (B) और 48 (D) h की वृद्धि के बाद pHCEC 20 से 50 μm तक के आकार की कोशिकाओं के साथ 40x जल उद्देश्य। स्केल बार = 10 और 20 μm (A); 25 और 50 μm (B); 10 और 20 μm (C); 50 μm (D)। संक्षेप: iHCECs = अमर मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; पीएचईसी = प्राथमिक मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: 3 डी कॉन्फोकल छवियां। 48 घंटे की वृद्धि (ए) के बाद पीएचईसी की 3 डी कॉन्फोकल छवियां और 24 घंटे (बी) के बाद आईएचसीईसी। 40x पानी का उद्देश्य। संक्षेप: iHCECs = अमर मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; पीएचईसी = प्राथमिक मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
प्राथमिक और अमर एचसीईसी पर यूवी का प्रभाव।
यूवी के संपर्क में आने के बाद प्राथमिक और अमर एचसीईसी दोनों की चयापचय गतिविधि चित्रा 3 में प्रदर्शित होती है। यह आंकड़ा परीक्षण कुओं (चतुष्कोणीय कुओं, दो अलग-अलग प्रयोगों) से सामान्यीकृत साधनों को दर्शाता है। गैर-यूवी उजागर कोशिकाओं की तुलना में, विकिरणित पीएचईसी की चयापचय गतिविधि 20 मिनट के जोखिम में काफी कम हो गई थी। आईएचसीईसी के लिए, 5 और 20 मिनट दोनों में विकिरणित कोशिकाओं के लिए चयापचय गतिविधि कम हो गई। इसलिए, आईएचसीईसी की तुलना में पीएचईसी की चयापचय गतिविधि को कम करने में अधिक समय लगा।
चित्र 3: 5 और 20 मिनट के यूवी विकिरण के संपर्क में आने के बाद पीएचसीईसी और आईएचसीईसी की चयापचय गतिविधि । * गैर-यूवी-उजागर नियंत्रण के पी < 0.05। गैर-यूवी-उजागर नियंत्रण कुओं में कोशिकाएं हैं जो परीक्षण नमूनों के साथ इनक्यूबेट की जाती हैं लेकिन यूवी के संपर्क में नहीं आती हैं। वाई-अक्ष यूवी के संपर्क में नहीं आने वाली कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि के सापेक्ष प्रतिशत है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. संक्षेप: iHCECs = अमर मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; पीएचसीईसी = प्राथमिक मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; यूवी = पराबैंगनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
एचसीईसी से भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई पर यूवी एक्सपोजर का प्रभाव चित्रा 4 में दिखाया गया है। प्राथमिक और अमर एचसीईसी के लिए यूवी एक्सपोजर के अलग-अलग समय पर अधिकतम साइटोकिन रिलीज हुआ। आईएचसीईसी द्वारा अधिकतम साइटोकिन रिलीज यूवी एक्सपोजर के 5 मिनट पर था। कोशिकाओं ने गैर-यूवी-उजागर कोशिकाओं की तुलना में आईएल -1, आईएल -6 और आईएल -8 के महत्वपूर्ण स्तर (पी < 0.05) जारी किए। इसके अलावा, आईएचसीईसी के लिए यूवी एक्सपोजर के 20 मिनट में कोई महत्वपूर्ण साइटोकिन रिलीज नहीं हुआ। हालांकि, पीएचसीईसी के लिए अधिकतम साइटोकिन रिलीज यूवी एक्सपोजर के 20 मिनट में हुआ। सभी चार साइटोकिन्स (आईएल -1, आईएल -6, आईएल -8, और टीएनएफ -α) गैर-यूवी-उजागर कोशिकाओं की तुलना में महत्वपूर्ण स्तर पर जारी किए गए थे। जारी भड़काऊ साइटोकिन्स (पीजी / एमएल) की कुल मात्रा के संदर्भ में, पीएचसीईसी ने आईएचसीईसी की तुलना में काफी अधिक आईएल -1, आईएल -8 और टीएनएफ - α जारी किए, जबकि आईएचसीईसी ने अधिक आईएल -6 जारी किया।
चित्र 4: pg/mL में यूवी विकिरण के संपर्क में आने के बाद pHCECs और iHCECs द्वारा साइटोकिन रिलीज। चार प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स की मात्रा आईएल -1 (ए), आईएल -6 (बी), आईएल -8 (सी), और टीएनएफ -α (डी) है। * गैर-यूवी-उजागर नियंत्रण के पी < 0.05। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. संक्षेप: iHCECs = अमर मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; पीएचसीईसी = प्राथमिक मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; यूवी = पराबैंगनी; आईएल = इंटरल्यूकिन; TNF-α = ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
प्राथमिक और अमर एचसीईसी पर रासायनिक विषाक्त पदार्थों के प्रभाव
तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों के संपर्क में आने के बाद चयापचय गतिविधि में प्रतिशत कमी पीएचईसी और आईएचसीईसी के बीच समान थी, जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है। यह आंकड़ा परीक्षण कुओं (चतुष्कोणीय कुओं, दो अलग-अलग प्रयोगों) से सामान्यीकृत साधनों को दर्शाता है।
चित्रा 5: 5 और 15 मिनट के लिए तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों के संपर्क में आने के बाद पीएचईसी और आईएचसीईसी की चयापचय गतिविधि<। गैर-विष-उजागर नियंत्रण कुओं में कोशिकाएं हैं जो परीक्षण नमूनों के साथ इनक्यूबेट की जाती हैं लेकिन रासायनिक विषाक्त पदार्थों के संपर्क में नहीं आती हैं। वाई-अक्ष रासायनिक विषाक्त पदार्थों के संपर्क में नहीं आने वाली कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि के सापेक्ष प्रतिशत है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. संक्षेप: iHCECs = अमर मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; पीएचसीईसी = प्राथमिक मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; बीएके = बेंजलकोनियम क्लोराइड; एच2 ओ2 = हाइड्रोजन पेरोक्साइड; एसडीएस = सोडियम डोडेसिल सल्फेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पीएचसीईसी द्वारा जारी साइटोकिन्स की मात्रा आईएचसीईसी द्वारा जारी मात्रा से अधिक थी। साइटोकिन आईएल -6 की रिहाई तीन रसायनों (बीएके 0.001%, एच 2 ओ2 0.01%, एसडीएस0.0025%, चित्रा 6) के संपर्क में आने से सबसे अधिक प्रभावित हुई थी। यह आंकड़ा परीक्षण कुओं (चतुष्कोणीय कुओं, दो अलग-अलग प्रयोगों) से अर्थ (pg/mL) दिखाता है। पीएचसीईसी और आईएचसीईसी दोनों ने सभी तीन रसायनों के संपर्क में आने के बाद आईएल -6 की रिहाई में बदलाव दिखाया। बीएके ने प्राथमिक और अमर एचसीईसी दोनों के लिए नियंत्रण की तुलना में आईएल -6 की रिहाई में कमी का कारण बना, जबकि एच2 ओ2 ने आईएचसीईसी से आईएल -6 की रिहाई में वृद्धि और पीएचईसी से रिलीज में कमी का कारण बना।
चित्रा 6: साइटोकिन रिलीज। एमएल में 5 और 15 मिनट के लिए तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों के संपर्क में आने के बाद पीएचईसी और आईएचसीईसी द्वारा साइटोकिन रिलीज। चार प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स की मात्रा आईएल -1 (ए), आईएल -6 (बी), आईएल -8 (सी), और टीएनएफ -α (डी) है। * पी < नियंत्रण का 0.05। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. संक्षेप: iHCECs = अमर मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; पीएचसीईसी = प्राथमिक मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; बीएके = बेंजलकोनियम क्लोराइड; एच2 ओ2 = हाइड्रोजन पेरोक्साइड; एसडीएस = सोडियम डोडेसिल सल्फेट; आईएल = इंटरल्यूकिन; TNF-α = ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
सेल व्यवहार्यता पर बीएके की विभिन्न सांद्रता के प्रभाव।
आईएचसीईसी व्यवहार्यता पर 5 मिनट के लिए बीएके सांद्रता 0.001%, 0.005%, और 0.01% के प्रभाव को चित्र 7 में दिखाया गया है। बीएके ने पीएचसीईसी और आईएचसीईसी दोनों के लिए 0.001% पर बहुत कम प्रभाव दिखाया। पीएचसीईसी और आईएचसीईसी दोनों को बीएके के 0.005% और 0.01% पर काफी नुकसान पहुंचा था। बीएके के 0.005% और 0.01% पर, पीएचईसी की तुलना में आईएचसीईसी में एथिडियम धुंधला होने की डिग्री अधिक थी। कैल्सीन दाग हरे, एथिडियम दाग लाल और एनेक्सिन वी नीले (प्रतिदीप्ति संकेत के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एनेक्सिन वी-कलर कंप्यूटर-समायोजित रंग)
चित्रा 7: 5 मिनट के लिए बीएके की विभिन्न सांद्रता के संपर्क में पीएचसीईसी और आईएचसीईसी की प्रतिदीप्ति सूक्ष्म छवियां। स्केल सलाखों = 200 μm; 10x उद्देश्य. संक्षेप: iHCECs = अमर मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; पीएचसीईसी = प्राथमिक मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं; बीएके = बेंजलकोनियम क्लोराइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
दो प्रकार के एचसीईसी के उपयोग में संभावित अंतर का आकलन किया गया था। कोशिकाओं को कोशिकाओं की समान सांद्रता पर एक ही माध्यम (एचओईएम) में रखा गया था और फिर यूवी विकिरण और तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों की छोटी और लंबी अवधि के संपर्क में लाया गया था। यूवी विकिरण और रसायनों की खुराक को उनके शारीरिक प्रभावों के आधार पर चुना गया था, जो मध्यवर्ती प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करने के लिए कोशिकाओं के लिए पर्याप्त हानिकारक थे जिनकी तुलना की जा सकती थी। यूवी विकिरण के लिए 5 और 20 मिनट का एक्सपोजर समय और बीएके (0.001%), एसडीएस (0.0025%), और एच 2 ओ2(0.01%) की चयनित खुराक के लिए 5 और 15 मिनट आदर्श एक्सपोजर समय और सांद्रता थे जो कोशिकाओं और अनुपचारित नियंत्रणों के बीच काफी अलग प्रतिक्रियाएं दिखाते थे।
एचओईएम एक सीरम-मुक्त माध्यम है जिसे एचसीईसी की संस्कृति के लिए अनुकूलित किया गया है। एचओईएम प्राथमिक और अमर कोशिकाओं दोनों के विकास का समर्थन करता है। इस जांच में इस्तेमाल की गई अमर सेल लाइन को एसवी 408 का उपयोग करके अमर कर दिया गया था। एसवी 40-अमर कोशिकाएं ऑन्कोजीन प्रोटीन को व्यक्त करती हैं जो आरबी, पी 53 और पीपी 2 ए17 के साथ हस्तक्षेप करके सेल चक्र की प्रगति को बढ़ावा दे सकती हैं। रेटिनोब्लास्टोमा (आरबी) ई 2 एफ प्रतिलेखन कारकों को बांधता है और रोकता है, जो जब बाधित नहीं होता है, तो एक सेल को सेल चक्र में प्रगति करने और18 को विभाजित करने की अनुमति देता है। अणु पी 53 कोशिका चक्र19 की प्रगति को नियंत्रित करने के लिए प्रतिलेखन कारकों को भी बांधता है। एक तीसरे अणु, पीपी 2 ए20,21 का निषेध, सेलुलर प्रसार 22 को भी बढ़ावा देताहै। एसवी 40 ऑन्कोजीन प्रोटीन की अभिव्यक्ति जो आरबी, पी 53 और पीपी 2 ए17 को रोकती है, आईएचसीईसी बनाम पीएचईसी की प्रतिक्रिया में अंतर में योगदान कर सकती है। दो प्रकार के एचसीईसी के सेल आकार भी अलग-अलग थे, जो इन ऑन्कोजीन-अवरोधक प्रोटीन के कारण हो सकता है क्योंकि अमर कोशिकाओं को इन अणुओं द्वारा विभाजित करने के लिए मजबूर किया जाता है इससे पहले कि कोशिकाएं प्राथमिक कोशिकाओं के बड़े आकार को प्राप्त करें।
यूवी विकिरण के लिए कॉर्नियल एक्सपोजर कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं को गंभीर नुकसान पहुंचा सकता है। यूवी विकिरण कोशिका में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन कर सकता है, डीएनए और सेल अणुओं को नुकसान पहुंचा सकता है, और एंजाइम प्रक्रियाओं को बाधित कर सकताहै23,24। यूवीबी सीधे डीएनए को नुकसान पहुंचाता है, और यूवीए कोशिका के भीतर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के माध्यम से डीएनए और अन्य सेलुलर अणुओं को नुकसान पहुंचाता है जो तब अन्य बायोमोलेक्यूल्स25,26 के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं। यह यूवी क्षति उजागर कोशिकाओं से भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई के कारण साइटोटॉक्सिसिटी और सूजन का कारण बन सकती है 3,27. इस अध्ययन में, अमर कोशिकाएं सेल चयापचय गतिविधि पर यूवी विकिरण प्रभावों के प्रति अधिक संवेदनशील थीं, क्योंकि अमर कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि में गिरावट आई थी, लेकिन 5 मिनट के बाद प्राथमिक सेल लाइन में नहीं। भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई में अंतर पीएचईसी और आईएचसीईसी के बीच भी हुआ। पीएचसीईसी ने 20 मिनट के यूवी विकिरण के बाद आईएचसीईसी की तुलना में अधिक आईएल -1, आईएल -8 और टीएनएफ -α जारी किए। साइटोकिन रिलीज में ये अंतर प्राथमिक और अमर सेल संस्कृतियों के सेल आकार के बीच अंतर से संबंधित हो सकते हैं। प्राथमिक और अमर कोशिकाओं के बीच साइटोकिन रिलीज में अंतर प्रभाव एक अन्य अध्ययन में नोट किया गया है जिसने प्राथमिक और अमर सेल लाइनों28 पर सिगरेट के धुएं के प्रभावों की जांच की।
ओकुलर जलन पैदा करने के लिए रासायनिक विषाक्त पदार्थों की क्षमता को मॉडल करने के लिए, इन रसायनों की साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए विभिन्न सेल कल्चर मॉडल विकसित किए गए हैं। इस अध्ययन से पता चला है कि एचसीईसी पर मध्यवर्ती प्रभाव डालने वाले ओकुलर विषाक्त पदार्थों में प्राथमिक और अमर एचसीईसी दोनों के लिए चयापचय गतिविधि में लगभग समान प्रतिशत की कमी होती है। तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों ने अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में अधिकांश भड़काऊ साइटोकिन्स की पर्याप्त रिहाई का कारण नहीं बनाया। हालांकि, यह पेपर बेसलाइन साइटोकिन स्तरों का पता लगाने में इस विधि की संवेदनशीलता को दर्शाता है। अमर सेल लाइनों से साइटोकिन्स का पता लगाने के लिए एक और विधि का मूल्यांकन किया गया है और बेसलाइन साइटोकिन स्तर29 का पता लगाने में असमर्थ पाया गया था। बीएके-उजागर संस्कृतियों की सूक्ष्म छवियों ने 5 मिनट के जोखिम और 20 घंटे की वसूली के बाद 0.005% और 0.01% सांद्रता पर पीएचईसी और आईएचसीईसी दोनों में विषाक्तता दिखाई।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम यूवी खुराक और ओकुलर टॉक्सिन खुराक का चयन कर रहे थे जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं को मध्यवर्ती विषाक्तता हुई और यह सुनिश्चित किया गया कि प्रत्येक प्रकार के एचसीईसी एक ही माध्यम में बढ़े। इसने पीएचईसी और आईएचसीईसी पर प्रत्येक उपचार के प्रभावों के बीच तुलना करने की अनुमति दी। इस विधि के संशोधन विषाक्त एजेंटों के संपर्क में आने के समय में किए जा सकते हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में परीक्षण किए गए समय के करीब एक्सपोजर समय बनाए रखने की सिफारिश की जाती है क्योंकि कम समय बिंदु कोशिकाओं पर विषाक्तता नहीं दिखा सकते हैं। इसके विपरीत, बहुत लंबे समय तक एक्सपोजर से बहुत अधिक नुकसान हो सकता है ताकि ओकुलर विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता में मामूली अंतर की तुलना इस प्रोटोकॉल में वर्णित परीक्षण एजेंटों के हानिकारक प्रभावों से नहीं की जा सके।
प्राथमिक एचसीईसी पर अमर एचसीईसी के फायदों में से एक यह है कि अमर कोशिकाओं में ओकुलर विषाक्त पदार्थों के संपर्क में आने के बाद चयापचय गतिविधि और साइटोकिन रिलीज के लिए प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में कम मानक विचलन थे। इस प्रकार, एक्सपोजर के बाद चयापचय गतिविधि और साइटोकिन रिलीज का आकलन करने के लिए, अमर कोशिकाओं को प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में शारीरिक विषाक्तता का पता लगाने की अधिक संभावना है। प्राथमिक कोशिकाओं और अमर सेल लाइन दोनों ने यूवी एक्सपोजर के बाद चयापचय गतिविधि और साइटोकिन रिलीज पर महत्वपूर्ण प्रभावों का पता लगाया, और दोनों ने प्रतिदीप्ति रंगों के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद बीएके की विषाक्तता का पता लगाया।
इस जांच में उल्लिखित विषाक्तता समापन बिंदुओं के अलावा, अन्य समापन बिंदुओं का परीक्षण किया जा सकता है, जिसमें तंग जंक्शनों, सेल प्रसार, सेल माइग्रेशन और अतिरिक्त साइटोकिन्स की रिहाई पर प्रभाव शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल ने सेल पारगम्यता, एस्टरेज़ गतिविधि और एपोप्टोसिस के माप का उपयोग करके चार भड़काऊ साइटोकिन्स, चयापचय गतिविधि और सेल व्यवहार्यता की रिहाई पर विषाक्त एजेंटों के प्रभावों का मूल्यांकन किया। इसके अलावा, विवओ परीक्षणों में, जैसे कि खरगोश ओकुलर जलन परीक्षण, विषाक्तता परीक्षण बैटरी में शामिल किया जाना चाहिए, क्योंकि आईएन विट्रो विषाक्तता परीक्षण एचसीईसी के लिए विषाक्तता की कार्रवाई के तंत्र का आकलन करने के लिए उपयुक्त हैं। जानवरों में विवो परीक्षणों में यह निर्धारित करने की आवश्यकता होती है कि क्या अन्य प्रतिरक्षा और विषाक्तता तंत्र मौजूद हैं जिन्हें इन विट्रो में मॉडलिंग नहीं किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक, लिंडन डब्ल्यू जोन्स, पिछले 3 वर्षों में, कोर के माध्यम से, निम्नलिखित कंपनियों से अनुसंधान समर्थन या व्याख्यान मानद प्राप्त किया है: एल्कॉन, एलर्गन, एलाइड इनोवेशन, ऑरिनिया फार्मा, बीएचवीआई, कूपरविजन, जीएल चेमटेक, आई-मेड फार्मा, जे एंड जे विजन, लुब्रिस, मेनिकॉन, नेचर्स वे, नोवार्टिस, ओफ्टेक, ओटे फार्मा, पीएस थेरेपी, सैंटन, शायर, साइटग्लास साइटसेज, और विजनियरिंग। लिंडन जोन्स एक सलाहकार भी हैं और / या एल्कॉन, कूपरविजन, जे एंड जे विजन, नोवार्टिस और ओफ्टेक के लिए एक सलाहकार बोर्ड पर कार्य करते हैं। अन्य लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों को इस काम के लिए कोई धन नहीं मिला।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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