Summary
В этой статье описываются процедуры, используемые для оценки токсичности УФ-излучения и химических токсинов на первичной и иммортализированной клеточной линии.
Abstract
В данной статье описаны методы измерения токсичности ультрафиолетового (УФ) излучения и глазных токсинов на первичных (pHCEC) и иммортализированных (iHCEC) культурах эпителиальных клеток роговицы человека. Клетки подвергались воздействию ультрафиолетового излучения и токсических доз хлорида бензалкония (BAK), перекиси водорода (H2O2) и додецилсульфата натрия (SDS). Метаболическую активность измеряли с помощью метаболического анализа. Высвобождение воспалительных цитокинов измеряли с помощью мультиплексного интерлейкина (IL)-1β, IL-6, IL-8 и анализа фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), а жизнеспособность клеток оценивали с использованием флуоресцентных красителей.
Повреждающее действие ультрафиолета на метаболическую активность клеток и высвобождение цитокинов происходило через 5 минут воздействия ультрафиолета для iHCEC и 20 минут для pHCEC. Аналогичное процентное снижение метаболической активности iHCEC и pHCEC произошло после воздействия BAK, H2O2или SDS, и наиболее значительные изменения в высвобождении цитокинов произошли для IL-6 и IL-8. Микроскопия флуоресцентно окрашенных клеток, подвергшихся воздействию iHCEC и pHCEC BAK, показала гибель клеток при воздействии BAK 0,005%, хотя степень окрашивания этидия была выше в iHCEC, чем pHCEC. Используя несколько методов оценки токсических эффектов с помощью микроскопии, оценки метаболической активности и продукции цитокинов, токсичность ультрафиолетового излучения и химических токсинов может быть определена как для первичных, так и для иммортализированных клеточных линий.
Introduction
Токсикологические исследования in vitro проводятся для прогнозирования токсического воздействия химических веществ и других агентов, которые могут вызвать повреждение клеток. При оценке токсичности для роговицы эпителиальные клетки роговицы человека (ГЦС) использовались в моделях для оценки этих эффектов 1,2,3,4. Эти модели обычно оценивают физиологические эффекты, такие как изменения метаболической активности клетки, пролиферация клеток и другие функции клеток, такие как производство и высвобождение воспалительных цитокинов. Для этих токсикологических исследований были отобраны клетки из различных источников для оценки повреждающего воздействия химических веществ и ультрафиолетового излучения на HCECs 2,3. Линии pHCEC доступны у компаний, которые предоставляют эти клетки из донорских тканей взрослых. Первичные клетки можно обработать диспазой и аккуратно соскоблить роговицу для посева5. Затем клетки проверяют на наличие вирусов и загрязнения, а затем отправляют криоконсервированными в 10% диметилсульфоксид.
Преимущество первичных клеточных линий заключается в том, что клетки генетически идентичны клеткам донора. Это идеально, так как модель in vitro должна максимально имитировать ткань in vivo . Недостатком первичных клеточных линий является то, что они имеют ограниченное количество клеточных делений или пассажей6. Ограниченное количество доступных клеток ограничивает количество экспериментов, которые могут быть проведены с одной первичной культурой, увеличивая стоимость экспериментов.
Иммортализированные клеточные линии также использовались в моделях токсичности клеточных культур. Однако, в отличие от первичной клеточной линии, полученной из ткани in vivo, иммортализированная клеточная линия была генетически изменена. Иммортализированные клетки создаются путем включения генов вируса в ДНК первичных клеток 6,7,8. Клетки с успешным включением вирусных генов отбираются для иммортализированной клеточной линии. Преимущество иммортализации заключается в том, что она допускает неограниченную быструю пролиферацию, предоставляя неограниченное количество клеток для проведения нескольких экспериментов с использованием одной и той же клеточной линии. Это обеспечивает согласованность между экспериментами и снижает стоимость.
В дополнение к изменениям в генах, которые ограничивали пролиферацию клеток, также могут происходить изменения в экспрессии генов критической функциональности9. Таким образом, недостатком использования иммортализированных клеток является то, что они могут больше не представлять исходные клетки in vivo с точки зрения их реакции на различные внешние раздражители10. Сравнения включали наблюдение токсического воздействия химических веществ на первичные и иммортализированные кератоциты роговицычеловека 11, а также на иммортализированные ГХЕК и первичные эпителиальные клеткироговицы кроликов 12. Сравнение воздействия токсинов на первичные кератоциты человека и иммортализированные кератоциты не показало существенных различий11. Используя методы, подробно описанные в этой статье, будет определена эффективность этих анализов для оценки токсичности УФ-излучения и глазных токсинов на pHCEC и iHCEC.
Были выбраны три глазных токсина, обычно используемых в анализах in vitro: BAK, H2 O2 и SDS. BAK представляет собой катионный консервант, обычно используемый в офтальмологических растворах 13,14,H 2 O2 обычно используется для дезинфекции контактных линз 15, а SDS представляет собой анионное поверхностно-активное вещество, содержащееся в моющих средствах и шампунях 14. Подобно глазным токсинам, УФ-излучение также может нанести значительный ущерб HCEC3. Кроме того, чрезмерное воздействие ультрафиолета может вызвать глазное заболевание, известное как фотокератит, характеризующееся симптомами слезотечения, светочувствительности и ощущения зернистости16.
Существует неограниченное количество первичных клеточных культур, которые могут быть использованы, и различные иммортализированные клеточные линии, которые были разработаны. Поэтому было проведено исследование для сравнения первичных HCEC с иммортализированной линией HCEC, чтобы определить сходства и различия между моделями, которые включают эти типы клеток.
В этом исследовании использовалась микроскопия для оценки возможных различий между pHCEC и iHCEC в физиологическом ответе клеток на ультрафиолетовое излучение и токсины. Также оценивалось влияние ультрафиолетового излучения и химических веществ на метаболическую активность клеток и высвобождение воспалительных цитокинов для двух клеточных линий. Важность определения различий между двумя клеточными линиями заключается в понимании оптимального использования этих клеточных линий для оценки: 1) влияния ультрафиолетового излучения на клетки, 2) воздействия токсинов на клетки и 3) результирующих изменений в метаболизме, жизнеспособности клеток и высвобождении клеточных цитокинов для будущих исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура pHCEC и iHCEC
- Выращивайте pHCEC и iHCEC в эпителиальной среде глаза человека (HOEM) со следующими добавками: 6 мМ L-глютамина, 0,002% добавка клеточной среды O (таблица материалов), 1,0 мкМ адреналина, 0,4% добавка клеточной среды P (таблица материалов), 5 мкг/мл резус-инсулина, 5 мкг/мл апотрансферрина и 100 нг/мл гемисукцината гидрокортизона в колбах с коллагеновым покрытием (18 мл в колбедля культуры 75 см2).
- Меняйте среду в колбах каждые 2-3 дня, удаляя среду после того, как клетки вырастут до ~80% слияния. Добавьте диссоциирующий раствор без фенолового красителя и инкубируйте колбу при 37 °C до полного отделения клеток. Нейтрализуют диссоциационный раствор с помощью DMEM/F12 с сывороткой, а затем центрифугируют клетки при 500 × г. Удалите надосадочную среду и ресуспендируйте клетки в среде HOEM.
2. Определение размера клеток с помощью конфокальной микроскопии
- Посейте как pHCEC, так и iHCEC в чашки Петри, покрытые коллагеном, с покровными стеклами со стеклянным дном в концентрации 1 × 105 с 1 мл HOEM. Выращивайте pHCEC и iHCEC, один набор культур в течение 24 часов и другой набор культур в течение 48 часов, в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2.
- После инкубационного периода окрашивают клетки 500 мкл буферного раствора для окрашивания аннексина, содержащего кальцеин (4 мкМ), гомодимер-этидий-1 (8 мкМ) и аннексин V (5 мкл в буфере 500 мкл - конъюгат Alexa Fluor 647) в течение 20 мин при 37 °C. После окрашивания клеток настройте микроскоп для захвата длин волн возбуждения/излучения 488/515 нм для кальцеина-AM, 543/600 нм для гомодимера этидия-1 и 633/665 нм для аннексина V с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
- Получите изображения и сделайте Z-стеки, чтобы оценить размер ячейки в трех измерениях.
- Чтобы получить двухмерные (2D) и трехмерные (3D) изображения, найдите область для изображения с помощью апохромата 40x/1.2 водного объектива. С помощью лазеров Argon (488) (первое сканирование), HeNe1 (543) (второе сканирование) и HeNe2 (633) (третье сканирование) сканирование в трех отдельных каналах с использованием светоделителей: HFT 488/543/633, NFT 635 VIS и NFT 545 LP560, LP505.
- Используйте многодорожечное последовательное сканирование, чтобы уменьшить перекрестные помехи.
ПРИМЕЧАНИЕ: LP505 используется для канала 2 с лазером 488 для улавливания излучения красителя кальцеина. LP560 используется в канале 3 с лазером 543 для улавливания излучения гомодимера этидия 1. NFT 635 используется с лазером 633 для улавливания излучения аннексина V. Целью HFT является разделение возбуждающего и излучающего света. NFT расщепляет свет, отражая свет < указанной длине волны в отдельный канал, позволяя свету > указанной длины волны во второй канал. Фильтры LP блокируют более короткие длины волн, чем указанная длина волны, и пропускают более длинные волны. - Чтобы получить изображение в 3D, установите конфокальный стек в Z-стек и отсканируйте не менее 20 кадров.
3. Воздействие на клетки УФ-излучения
- Засейте клетки в 5 × 104 / мл HOEM в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины, покрытой коллагеном-1, и инкубируйте при 37 ° C с 5% CO2 в течение 3 часов. После инкубационного периода уменьшите объем среды в лунках до 300 мкл. Затем подвергните клетки воздействию ультрафиолетового излучения (как UVA при 6,48 Вт / м 2 , так и UVB при 1,82 Вт / м2, поскольку трубки UVA и UVB включены в инкубаторе одновременно) в инкубаторе с температурой 37 ° C в течение 5 и 20 минут в отдельных экспериментах.
- После УФ-излучения добавьте 200 мкл свежего HOEM в каждую лунку и инкубируйте в течение 20 часов при 37 ° C с 5% CO2.
- После инкубации соберите надосадочную жидкость клетки в каждую лунку и переложите ее в стерильные полипропиленовые пробирки объемом 2 мл. Заморозить при -80 °C. Чтобы определить уровни цитокинов, высвобождаемых pHCEC и iHCEC после воздействия ультрафиолета, используйте мультиплексный анализ цитокинов и следуйте инструкциям набора для количественного определения следующих четырех цитокинов: IL-6, IL-8, IL-1β и TNF-α.
- Добавьте реагент метаболического анализа в клетки в лунках.
- Приготовьте 10% реагент метаболического анализа в DMEM/F12. Замените питательную среду в каждой лунке 1 мл 10% раствора метаболического анализа и инкубируйте при 37 ° C с 5% CO2 в течение 4 часов.
- Измерьте флуоресценцию каждого раствора с помощью считывателя флуоресцентных пластин на длинах волн возбуждения/излучения 530/590 нм.
4. Воздействие на клетки химических токсинов
- Семенные клетки при 5 × 104 / мл HOEM в каждой лунке 24-луночной культуральной пластины, покрытой коллагеном-1, и инкубируют при 37 ° C с 5% CO2 в течение 3 часов. После инкубационного периода удалите среду и подвергните клетки воздействию 1 мл химических токсинов (BAK 0,001%, H2O2 0,01% и SDS 0,0025% в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)) в течение 5 и 15 минут.
- После воздействия химических токсинов удалите токсины из лунок, промойте 1 мл PBS и добавьте по 1 мл HOEM в каждую лунку. После 20 ч инкубации проводят метаболический анализ, заменяя среду 1 мл 10% метаболического раствора и инкубируя при 37 ° C с 5% CO2 в течение 4 часов. Измерьте флуоресценцию с помощью флуоресцентного многолуночного планшетного считывателя на длинах волн возбуждения/излучения 530/590 нм.
- После 20-часовой инкубации переносят надосадочные жидкости клеток из лунок в отдельные стерильные полипропиленовые пробирки объемом 2 мл и замораживают при -80 °C. Количественное определение цитокинов, высвобождаемых pHCEC и iHCEC после воздействия химических веществ. Используйте ту же мультиплексную платформу, которая используется для оценки цитокинов из клеток, обработанных ультрафиолетом. Используйте мультиплексный анализ цитокинов в соответствии с инструкциями набора для количественного определения следующих четырех цитокинов: IL-6, IL-8, IL-1β и TNF-α.
5. Исследование клеток, подвергшихся воздействию различных концентраций БАК
- Семенные клетки при 1 × 10 5 / мл HOEM в каждой лунке 24-луночной культуральной пластины, покрытой коллагеном-1, и инкубируют при 37 ° C с5% CO2 в течение 24 часов. После инкубационного периода удалите среду и подвергните клетки воздействию 1 мл химических токсинов (BAK 0,001%, BAK 0,005% и BAK 0,01% в PBS) в течение 5 мин.
- После воздействия удалите химические токсины, промойте лунки 1 мл PBS и добавьте по 1 мл HOEM в каждую лунку. После 20 ч инкубации окрашивают клетки 500 мкл буферного раствора для окрашивания аннексина, содержащего кальцеин (4 мкМ), гомодимер-этидия-1 (8 мкМ) и аннексин V (5 мкл в буфере 500 мкл - конъюгат Alexa Fluor 647) в течение 20 мин при 37 °C. Настройте микроскоп для измерения интенсивности окрашивания аннексина V, кальцеина AM и этидия-1 на длинах волн возбуждения/излучения 630/675 нм, 495/515 нм и 528/617 нм соответственно. Изображение клеток с помощью флуоресцентного микроскопа
6. Анализ данных
- Проведите тест на нормальность и тест на равные дисперсии, прежде чем выполнять дисперсионный анализ (ANOVA), тест Уэлча ANOVA или тест Крускала-Уоллиса. Используйте соответствующий постфактум тест для сравнения каждой тестируемой группы. Установите p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Размер ячейки
Первичные и иммортализированные HCEC визуализировали с помощью трех флуоресцентных красителей, которые отражают три различные стадии жизнеспособности клеток. Живые клетки зеленые (кальцеин-AM), мертвые клетки красные (гомодимер этидия-1), а апоптотические клетки желтые (аннексин V-скорректированный компьютером цвет для лучшей визуализации флуоресцентного сигнала). Живые клетки содержат эстеразы в цитоплазме клетки и превращают кальцеин-AM в кальцеин. Мертвые клетки имеют клеточные мембраны, проницаемые для гомодимера этидия-1. Апоптотические клетки окрашиваются на клеточной мембране, поскольку фосфатидилсерин транслоцируется на внешнюю мембрану.
Сравнение размера клеток для двух типов HCEC после 24 и 48 ч роста было проведено с помощью конфокальной микроскопии, как показано на рисунке 1. iHCEC (рис. 1A) представляют собой более мелкие клетки, которые варьируются от 10 мкм до 20 мкм, а pHCEC (рис. 1B) имеют размер от 20 мкм до 50 мкм после 24 ч роста. Аналогичные различия в диапазоне размеров наблюдались для iHCEC (рис. 1C) и pHCEC (рис. 1D) после 48 ч роста. 3D-изображения двух типов HCEC были сделаны с помощью конфокальной микроскопии (на рисунке 2A показаны pHCEC; На рисунке 2B показаны iHCEC).
Рисунок 1: Сравнение размера клеток с помощью конфокальной микроскопии . ИКХЭЦ после 24 (А) и 48 (С) ч роста с клетками размером от 10 до 20 мкм. pHCEC после 24 (B) и 48 (D) ч роста с клетками размером от 20 до 50 мкм. 40-кратная водная цель. Масштабные линейки = 10 и 20 мкм (А); 25 и 50 мкм (В); 10 и 20 мкм (С); 50 мкм (D). Сокращения: iHCECs = иммортализированные эпителиальные клетки роговицы человека; pHCECs = первичные эпителиальные клетки роговицы человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: 3D конфокальные изображения. 3D-конфокальные изображения pHCEC через 48 ч роста (A) и iHCEC через 24 ч (B). 40-кратный водный объектив. Сокращения: iHCECs = иммортализированные эпителиальные клетки роговицы человека; pHCECs = первичные эпителиальные клетки роговицы человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Влияние ультрафиолета на первичные и иммортализированные ГХЕК
Метаболическая активность как первичных, так и иммортализированных ГХЕК после воздействия ультрафиолета показана на рисунке 3. На рисунке показаны нормализованные средние значения из тестовых скважин (четырехкратные скважины, два отдельных эксперимента). По сравнению с клетками, не подвергшимися воздействию ультрафиолета, метаболическая активность облученных pHCEC была значительно снижена через 20 минут воздействия. Для iHCEC метаболическая активность снижалась для клеток, облученных как через 5, так и через 20 минут. Следовательно, для снижения метаболической активности pHCEC требовалось больше времени воздействия, чем iHCEC.
Рисунок 3: Метаболическая активность pHCEC и iHCEC после воздействия 5 и 20 мин УФ-излучения . *p < 0,05 контроля, не подвергающегося воздействию ультрафиолета. Контроль, не подвергающийся воздействию ультрафиолета, представляет собой клетки в лунках, инкубированных с испытуемыми образцами, но не подвергающихся воздействию ультрафиолета. Ось Y представляет собой процент по отношению к метаболической активности клеток, не подвергающихся воздействию ультрафиолета. Столбцы погрешности указывают на стандартное отклонение. Сокращения: iHCECs = иммортализированные эпителиальные клетки роговицы человека; pHCECs = первичные эпителиальные клетки роговицы человека; УФ = ультрафиолет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Влияние ультрафиолетового облучения на высвобождение воспалительных цитокинов из ГЦЭС показано на рисунке 4. Максимальное высвобождение цитокинов происходило в разное время воздействия ультрафиолета на первичные и иммортализированные ГХЕК. Максимальное высвобождение цитокинов iHCEC было при 5 минутах воздействия ультрафиолета. Клетки высвобождали значительные уровни (p < 0,05) IL-1β, IL-6 и IL-8 по сравнению с клетками, не подвергшимися воздействию ультрафиолета. Более того, при 20-минутном воздействии ультрафиолета на iHCEC не происходило значительного высвобождения цитокинов. Однако максимальное высвобождение цитокинов для pHCEC происходило через 20 минут воздействия ультрафиолета. Все четыре цитокина (IL-1β, IL-6, IL-8 и TNF-α) высвобождались на значительных уровнях по сравнению с клетками, не подвергшимися воздействию ультрафиолета. С точки зрения общего количества высвобождаемых воспалительных цитокинов (пг / мл), pHCEC высвобождают значительно больше IL-1β, IL-8 и TNF-α, чем iHCEC, тогда как iHCEC высвобождают больше IL-6.
Рисунок 4: Высвобождение цитокинов pHCEC и iHCEC после воздействия УФ-излучения в пг/мл. Четыре количественно определяемых провоспалительных цитокина: IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) и TNF-α (D). *p < 0,05 контроля без воздействия ультрафиолета. Столбцы погрешности указывают на стандартное отклонение. Сокращения: iHCECs = иммортализированные эпителиальные клетки роговицы человека; pHCECs = первичные эпителиальные клетки роговицы человека; УФ = ультрафиолет; IL = интерлейкин; TNF-α = фактор некроза опухоли альфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Воздействие химических токсинов на первичные и иммортализированные ГХЕК
Процентное снижение метаболической активности после воздействия трех глазных токсинов было одинаковым между pHCEC и iHCEC, как показано на рисунке 5. На рисунке показаны нормализованные средние значения из тестовых скважин (четырехкратные скважины, два отдельных эксперимента).
Рисунок 5: Метаболическая активность pHCEC и iHCEC после воздействия трех глазных токсинов в течение 5 и 15 мин. *p < 0,05 контроля. Контроль, не подверженный воздействию токсинов, представляет собой клетки в лунках, инкубированные с исследуемыми образцами, но не подвергающиеся воздействию химических токсинов. Ось Y представляет собой процент относительно метаболической активности клеток, не подвергающихся воздействию химических токсинов. Столбцы погрешности указывают на стандартное отклонение. Сокращения: iHCECs = иммортализированные эпителиальные клетки роговицы человека; pHCECs = первичные эпителиальные клетки роговицы человека; BAK = хлорид бензалкония; H 2O2 = перекись водорода; SDS = додецилсульфат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Количество цитокинов, высвобождаемых pHCEC, было больше, чем количество, высвобождаемое iHCEC. На высвобождение цитокина IL-6 больше всего повлияло воздействие трех химических веществ (BAK 0,001%, H2O2 0,01%, SDS 0,0025%, рис. 6). На рисунке показаны средние значения (пг/мл) из тестовых скважин (четырехкратные лунки, два отдельных эксперимента). Как pHCEC, так и iHCEC показали изменение высвобождения IL-6 после воздействия всех трех химических веществ. BAK вызывал снижение высвобождения IL-6 по сравнению с контролем как для первичных, так и для иммортализированных HCEC, тогда как H 2 O2вызывал увеличение высвобождения IL-6 из iHCEC и снижение высвобождения из pHCEC.
Рисунок 6: Высвобождение цитокинов. Высвобождение цитокинов pHCEC и iHCEC после воздействия трех глазных токсинов в течение 5 и 15 минут в пг/мл. Четыре количественно определяемых провоспалительных цитокина: IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) и TNF-α (D). *p < 0,05 контроля. Столбцы погрешности указывают на стандартное отклонение. Сокращения: iHCECs = иммортализированные эпителиальные клетки роговицы человека; pHCECs = первичные эпителиальные клетки роговицы человека; BAK = хлорид бензалкония; H 2O2 = перекись водорода; SDS = додецилсульфат натрия; IL = интерлейкин; TNF-α = фактор некроза опухоли альфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Влияние различных концентраций BAK на жизнеспособность клеток
Влияние концентраций BAK 0,001%, 0,005% и 0,01% в течение 5 мин на жизнеспособность iHCEC показано на рисунке 7. BAK показал незначительный эффект при 0,001% как для pHCEC, так и для iHCEC. Как pHCEC, так и iHCEC были значительно повреждены при 0,005% и 0,01% BAK. При 0,005% и 0,01% BAK степень окрашивания этидия была выше у iHCEC, чем у pHCEC. Кальцеин окрашивается в зеленый цвет, этидий окрашивается в красный и аннексин V в синий (аннексин V-цвет, регулируемый компьютером для лучшей визуализации сигнала флуоресценции)
Рисунок 7: Флуоресцентные микроскопические изображения pHCEC и iHCEC, подвергшихся воздействию различных концентраций BAK в течение 5 мин. Масштабные линейки = 200 мкм; 10-кратная цель. Сокращения: iHCECs = иммортализированные эпителиальные клетки роговицы человека; pHCECs = первичные эпителиальные клетки роговицы человека; BAK = хлорид бензалкония. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Были оценены потенциальные различия в использовании двух типов HCEC. Клетки помещали в одну и ту же среду (HOEM) при одинаковых концентрациях клеток, а затем подвергали краткосрочному и длительному воздействию ультрафиолетового излучения и трех глазных токсинов. Дозы ультрафиолетового излучения и химических веществ были выбраны на основе их физиологических эффектов, которые были достаточно разрушительными для клеток, чтобы вызвать промежуточные реакции, которые можно было бы сравнить. Время воздействия 5 и 20 мин для УФ-излучения и 5 и 15 мин для выбранных доз BAK (0,001%), SDS (0,0025%) и H 2 O2 (0,01%) было идеальнымвременем воздействия и концентрациями, которые показали значительно различающуюся реакцию между клетками и необработанным контролем.
HOEM — это среда, не содержащая сыворотки, оптимизированная для культивирования HCEC. HOEM поддерживает рост как первичных, так и иммортализированных клеток. Иммортализированная клеточная линия, использованная в этом исследовании, была иммортализирована с использованием SV408. SV40-иммортализированные клетки экспрессируют онкогенные белки, которые могут способствовать прогрессированию клеточного цикла, вмешиваясь в Rb, p53 и pp2a17. Ретинобластома (Rb) связывается с факторами транскрипции E2F и ингибирует их, которые, если их не ингибировать, позволяют клетке прогрессировать в клеточном цикле и делиться18. Молекула p53 также связывается с факторами транскрипции, чтобы контролировать прогрессирование клеточного цикла19. Ингибирование третьей молекулы, pp2a 20,21, также способствует клеточной пролиферации22. Экспрессия белков онкогена SV40, которые ингибируют Rb, p53 и pp2a17, может способствовать различиям в ответе iHCEC по сравнению с pHCEC. Размеры клеток двух типов HCEC также были разными, что может быть связано с этими белками, ингибирующими онкогены, потому что иммортализированные клетки вынуждены делиться этими молекулами до того, как клетки достигнут большого размера первичных клеток.
Воздействие ультрафиолетового излучения на роговицу может привести к серьезному повреждению эпителиальных клеток роговицы. Ультрафиолетовое излучение может производить активные формы кислорода в клетке, повреждать ДНК и клеточные молекулы и нарушать ферментные процессы23,24. UVB напрямую повреждает ДНК, а UVA повреждает ДНК и другие клеточные молекулы посредством производства активных форм кислорода внутри клетки, которые затем могут реагировать с другими биомолекулами25,26. Это повреждение ультрафиолетом может вызвать цитотоксичность и воспаление из-за высвобождения воспалительных цитокинов из подвергшихся воздействию клеток 3,27. В этом исследовании иммортализированные клетки были более чувствительны к воздействию ультрафиолетового излучения на метаболическую активность клеток, так как через 5 минут наблюдалось падение метаболической активности иммортализированных клеток, но не в первичной клеточной линии. Различия в высвобождении воспалительных цитокинов также наблюдались между pHCEC и iHCEC. pHCEC высвобождают больше IL-1β, IL-8 и TNF-α, чем iHCEC после 20 минут ультрафиолетового излучения. Эти различия в высвобождении цитокинов могут быть связаны с различиями между размером клеток первичных и иммортализированных клеточных культур. Дифференциальные эффекты высвобождения цитокинов между первичными и иммортализированными клетками были отмечены в другом исследовании, в котором изучалось влияние сигаретного дыма на первичные и иммортализированные клеточные линии28.
Чтобы смоделировать способность химических токсинов вызывать раздражение глаз, были разработаны различные модели клеточных культур для оценки цитотоксичности этих химических веществ. Это исследование показало, что глазные токсины, оказывающие промежуточное воздействие на ГХЕК, имеют примерно одинаковое процентное снижение метаболической активности как для первичных, так и для иммортализированных ГХЕК. Три глазных токсинов не вызывали существенного высвобождения большинства воспалительных цитокинов по сравнению с необработанным контролем. Тем не менее, эта статья показывает чувствительность этого метода в определении исходных уровней цитокинов. Был оценен другой метод обнаружения цитокинов из иммортализированных клеточных линий, и было обнаружено, что он не может обнаружить исходные уровни цитокинов29. Микроскопические изображения культур, подвергшихся воздействию BAK, показали токсичность как pHCEC, так и iHCEC при концентрациях 0,005% и 0,01% после 5-минутного воздействия и 20-часового восстановления.
Важнейшими шагами в этом протоколе были выбор доз ультрафиолетового излучения и доз глазного токсина, которые приводили к промежуточной токсичности для клеток, и обеспечение того, чтобы каждый тип ГХЕК рос в одной и той же среде. Это позволило провести сравнение эффектов каждого лечения на pHCEC и iHCEC. Модификации этого метода могут быть сделаны во время воздействия токсичных агентов. Тем не менее, рекомендуется поддерживать время воздействия, близкое к времени, проверенному в этом протоколе, поскольку более короткие моменты времени могут не показывать токсичность на клетках. Напротив, слишком длительное воздействие может привести к слишком большому ущербу, так что незначительные различия в токсичности глазных токсинов не могут быть сопоставлены с повреждающим действием тестируемых агентов, описанных в этом протоколе.
Одним из преимуществ иммортализированных ГХЕК по сравнению с первичными ГХЕК является то, что иммортализированные клетки имели более низкие стандартные отклонения, чем первичные клетки, по метаболической активности и высвобождению цитокинов после воздействия глазных токсинов. Таким образом, для оценки метаболической активности и высвобождения цитокинов после воздействия иммортализированные клетки с большей вероятностью обнаруживают физиологическую токсичность, чем первичные клетки. Как первичные клетки, так и иммортализированная клеточная линия обнаружили значительное влияние на метаболическую активность и высвобождение цитокинов после воздействия ультрафиолета, и оба обнаружили токсичность BAK после окрашивания клеток флуоресцентными красителями.
В дополнение к конечным точкам токсичности, упомянутым в этом исследовании, могут быть протестированы и другие конечные точки, включая влияние на плотные соединения, пролиферацию клеток, миграцию клеток и высвобождение дополнительных цитокинов. В этом протоколе оценивалось влияние токсических агентов на высвобождение четырех воспалительных цитокинов, метаболическую активность и жизнеспособность клеток с использованием измерений проницаемости клеток, активности эстеразы и апоптоза. Кроме того, тесты in vivo, такие как тестирование на раздражение глаз кроликов, должны быть включены в батарею тестов на токсичность, поскольку тесты на токсичность in vitro подходят для оценки механизма действия токсичности на HCEC. Тесты in vivo на животных необходимы, чтобы определить, существуют ли другие иммунные и токсические механизмы, которые не могут быть смоделированы in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор, Линдон В. Джонс, за последние 3 года через CORE получил исследовательскую поддержку или гонорары за чтение лекций от следующих компаний: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage и Visioneering. Линдон Джонс также является консультантом и/или членом консультативного совета Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis и Ophtecs. Остальным авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Авторы не получили финансирования для этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H.
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
