Summary
この記事では、初代および不死化細胞株でのUV放射および化学毒素の毒性を評価するために使用される手順について説明します。
Abstract
この記事では、初代(pHCEC)および不死化(iHCEC)ヒト角膜上皮細胞培養における紫外線(UV)放射線および眼毒素の毒性を測定する方法について説明します。細胞は、紫外線および毒性用量の塩化ベンザルコニウム(BAK)、過酸化水素(H 2 O2)、およびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に曝露された。代謝活性は、代謝アッセイを用いて測定した。炎症性サイトカインの放出は、マルチプレックスインターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、および腫瘍壊死因子-α(TNF-α)アッセイを用いて測定し、蛍光色素を用いて細胞の生存率を評価した。
細胞代謝活性およびサイトカイン放出に対するUVの有害な影響は、iHCECのUV曝露の5分およびpHCECの20分で発生した。iHCECおよびpHCECの代謝活性の同様のパーセント低下は、BAK、H2O2、またはSDSへの曝露後に発生し、 サイトカイン放出の最も重要な変化はIL-6およびIL-8で発生した。蛍光染色されたiHCECおよびpHCEC BAKばく露細胞の顕微鏡検査では、0.005%BAKばく露で細胞死が示されましたが、エチジウム染色の程度はpHCECよりもiHCECの方が大きかったです。顕微鏡を使用して毒性効果を評価する複数の方法、代謝活性の評価、およびサイトカイン産生を利用して、初代細胞株と不死化細胞株の両方でUV放射と化学毒素の毒性を決定できました。
Introduction
in vitro毒物学研究は、細胞に損傷を与える可能性のある化学物質やその他の薬剤の毒性作用を予測するために行われます。角膜に対する毒性の評価において、ヒト角膜上皮細胞(HCEC)は、これらの効果を評価するためのモデルにおいて使用されている1、2、3、4。これらのモデルは通常、細胞の代謝活性の変化、細胞増殖、および炎症性サイトカインの産生および放出などの他の細胞機能などの生理学的効果を評価します。これらの毒物学研究では、HCECに対する化学物質とUV放射の有害な影響を評価するために、さまざまなソースからの細胞が選択されています2,3。pHCEC株は、成人のドナー組織からこれらの細胞を提供する企業から入手可能です。初代細胞はディスパーゼで処理し、培養のために角膜を穏やかに掻き取ることができます5。次に、細胞はウイルスと汚染についてテストされ、10%ジメチルスルホキシドで凍結保存された状態で出荷されます。
初代細胞株の利点は、細胞がドナーの細胞と遺伝的に同一であることです。in vitro モデルは in vivo 組織を可能な限り模倣する必要があるため、これは理想的です。初代細胞株の欠点は、細胞分裂または継代の数が限られていることです6。利用可能な細胞数が限られているため、1回の初代培養で実施できる実験の数が制限され、実験のコストが増加します。
不死化細胞株は、細胞培養毒性モデルでも使用されています。しかし、in vivo組織から得られた初代細胞株とは異なり、不死化細胞株は遺伝的に改変されています。不死化細胞は、初代細胞のDNAにウイルスの遺伝子を組み込むことによって作成されます6,7,8。ウイルス遺伝子の取り込みに成功した細胞が不死化細胞株に選択されます。不死化の利点は、無期限の急速な増殖を可能にし、同じ細胞株を使用して複数の実験を実行するための無制限の数の細胞を提供することです。これにより、実験間の一貫性が確保され、コストが削減されます。
細胞増殖を制限する遺伝子の変化に加えて、重要な機能の遺伝子の発現の変化も起こり得る9。したがって、不死化細胞を使用することの欠点は、それらが様々な外部刺激に対するそれらの応答に関して、もはや元の インビボ 細胞を表していない可能性があることである10。比較には、初代および不死化ヒト角膜角膜細胞11、ならびに不死化HCECおよびウサギ角膜上皮初代細胞12に対する化学物質の毒性効果の観察が含まれていました。初代ヒト角化細胞と不死化角化細胞に対する毒素の影響の比較では、有意差は示されませんでした11。この記事で詳述されている方法を使用して、これらのアッセイの有効性を評価する pHCECおよびiHCECに対する紫外線および眼毒素の毒性が決定されます。
インビトロアッセイで一般的に使用される3つの眼毒素、BAK、H2O2、およびSDSが選択されました。BAKは点眼液13、14に一般的に使用されるカチオン性防腐剤であり、H2O2はコンタクトレンズ15の消毒に一般的に使用され、SDSは洗剤およびシャンプー14に見られるアニオン性界面活性剤である。眼の毒素と同様に、紫外線もHCECに重大な損傷を引き起こす可能性があります3。さらに、UVへの過度の曝露は、涙の症状、光過敏症、およびざらざら感を特徴とする光角膜炎として知られる眼の状態を引き起こす可能性があります16。
使用できる初代細胞培養物は無制限であり、開発されたさまざまな不死化細胞株があります。したがって、これらのタイプの細胞を組み込んだモデル間の類似点と相違点を決定するために、初代HCECを不死化HCEC株と比較するための調査が行われました。
この研究では、顕微鏡を使用して、UVおよび毒素に対する細胞の生理学的応答に関するpHCECとiHCECの違いの可能性を評価しました。2つの細胞株の細胞代謝活性と炎症性サイトカイン放出に対するUV放射と化学物質の影響も評価されました。2つの細胞株の違いを決定することの重要性は、1)細胞に対するUV放射の影響、2)細胞に対する毒素の影響、および3)将来の研究のために結果として生じる代謝、細胞生存率、および細胞サイトカイン放出の変化を評価するためのこれらの細胞株の最適な使用を理解することです。
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Protocol
1. pHCECおよびiHCECの培養
- 6 mM L-グルタミン、0.002%細胞培地サプリメントO(材料表)、1.0 μMエピネフリン、0.4%細胞培地サプリメントP(材料表)、5 μg/mL rhインスリン、5 μg/mLアポトランスフェリン、および100 ng/mLヒドロコルチゾンヘミコハク酸塩をコラーゲン-1コーティング培養フラスコ(75 cm2培養フラスコに18 mL)で増殖させます。
- 細胞が~80%のコンフルエントに成長した後に培地を除去して、2〜3日ごとにフラスコ内の培地を交換します。フェノールレッドを含まない解離溶液を加え、細胞が完全に剥離するまでフラスコを37°Cでインキュベートします。DMEM/F12で解離液を血清で中和し、細胞を500 × gで遠心分離します。上清培地を取り出し、細胞をHOEM培地に再懸濁します。
2. 共焦点顕微鏡による細胞サイズの決定
- pHCECとiHCECの両方を、1 mLのHOUEMを含む1 × 105 の濃度のガラス底カバーガラスでコラーゲンコーティングされたペトリ皿に播種します。pHCECおよびiHCECを、1セットの培養液を24時間、別の培養セットを48時間、5%CO2を含む37°Cのインキュベーターで増殖させます。
- インキュベーション期間の後、カルセイン(4 μM)、エチジウムホモ二量体-1(8 μM)、およびアネキシンV(500 μLバッファー-Alexa Fluor 647コンジュゲート溶液中の5 μL)を含む500 μLのアネキシン染色バッファー溶液で細胞を37°Cで20分間染色します。 細胞を染色した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて、カルセイン-AMの場合は488/515 nm、エチジウムホモ二量体-1の場合は543/600 nm、アネキシンVの場合は633/665 nmの励起/発光波長をキャプチャするように顕微鏡を調整します。
- 画像を取得し、Zスタックを取得して、3次元でセルサイズを評価します。
- 2次元(2D)および3次元(3D)画像を取得するには、アポクロマート40x/1.2水対物レンズで画像化する領域を見つけます。アルゴン(488)(最初のスキャン)、HeNe1(543)(2番目のスキャン)、およびHeNe2(633)(3番目のスキャン)レーザーでは、ビームスプリッター、HFT 488/543/633、NFT 635 Vis、およびNFT 545 LP560、LP505を使用して3つの別々のチャネルでスキャンします。
- マルチトラックシーケンシャルスキャンを使用して、クロストークを減らします。
注:LP505は、カルセイン色素の発光をキャプチャするために、488レーザーを備えたチャネル2に使用されます。LP560は、エチジウムホモダイマー1の発光をキャプチャするために、543レーザーを備えたチャネル3で使用されます。NFT 635は、アネキシンVの発光をキャプチャするために633レーザーとともに使用されます。HFTの目的は、励起光と発光光を分離することです。NFTは、指定された波長<光を別のチャネルに反射させ、指定された波長>光を2番目のチャネルに通すことで光を分割します。LPフィルターは、指定された波長よりも短い波長を遮断し、長い波長を通過させます。 - 3Dで画像化するには、共焦点をZスタックに設定し、少なくとも20フレームをスキャンします。
3.紫外線への細胞の曝露
- 細胞を24ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに5×104/mLのHEMOMで播種し、5%CO2で37°Cで3時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、ウェル内の培地の容量を300 μLに減らします。次に、細胞をUV照射(UVAチューブとUVBチューブの両方がインキュベーター内で同時にオンになっているため、6.48 W / m 2のUVAと1.82 W / m2のUVB)に37°Cのインキュベーターで5分間と20分間別々の実験でさらします。
- UV照射後、200 μLの新鮮なHEMOMを各ウェルに加え、5%CO2を用いて37°Cで20時間インキュベートします。
- インキュベーション後、各ウェルに細胞上清を集め、滅菌済みの2 mLポリプロピレンチューブに移します。-80°Cで凍結する。 UV曝露後にpHCECおよびiHCECによって放出されるサイトカインレベルを決定するには、マルチプレックスサイトカインアッセイを使用し、キットの指示に従って、IL-6、IL-8、IL-1β、およびTNF-αの4つのサイトカインを定量します。
- 代謝アッセイ試薬をウェル内の細胞に追加します。
- DMEM/F12で10%代謝アッセイ試薬を調製します。各ウェルの培養液を1 mLの10%代謝アッセイ溶液で交換し、5%CO2 と共に37°Cで4時間インキュベートします。
- 蛍光プレートリーダーを使用して、530/590 nmの励起/発光波長で各溶液の蛍光を測定します。
4.化学毒素への細胞の曝露
- 24ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに5×104/mLのHEMOMで細胞をシードし、5%CO2を用いて37°Cで3時間インキュベートします。インキュベーション期間後、培地を取り出し、細胞を1 mLの化学毒素(BAK 0.001%、H 2 O20.01%、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のSDS 0.0025%)に5〜15分間さらします。
- 化学毒素にさらされた後、ウェルから毒素を取り除き、1 mLのPBSですすぎ、各ウェルに1 mLのHOUMを追加します。20時間のインキュベーション後、培地を1mLの10%代謝アッセイ溶液で交換し、5%CO2 と共に37°Cで4時間インキュベートすることにより、代謝アッセイを行う。蛍光マルチウェルプレートリーダーを使用して、530/590 nmの励起/発光波長で蛍光を測定します。
- 20時間のインキュベーション後のウェルから細胞上清を別々の滅菌2 mLポリプロピレンチューブに移し、-80°Cで凍結します。 化学物質への曝露後にpHCECおよびiHCECによって放出されるサイトカインを定量化します。UV処理された細胞からのサイトカインを評価するために使用したのと同じマルチプレックスプラットフォームを使用してください。キットの指示に従ってマルチプレックスサイトカインアッセイを使用して、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-αの4つのサイトカインを定量します。
5.さまざまな濃度のBAKに曝露された細胞の検査
- 24ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに1×105/mLのHEMOMで細胞をシードし、5%CO2 を含む37°Cで24時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、培地を除去し、細胞を1 mLの化学毒素(BAK 0.001%、BAK 0.005%、およびPBS中のBAK 0.01%)に5分間さらします。
- 曝露後、化学毒素を除去し、1 mLのPBSでウェルをすすぎ、各ウェルに1 mLのHEMOを追加します。20時間のインキュベーション後、カルセイン(4 μM)、エチジウムホモ二量体-1(8 μM)、およびアネキシンV(500 μLバッファー-Alexa Fluor 647コンジュゲート溶液中の5 μL)を含む500 μLのアネキシン染色バッファー溶液で細胞を37°Cで20分間染色します。 顕微鏡を調整して、アネキシンV、カルセインAM、およびエチジウム-1染色の強度を、それぞれ630/675 nm、495/515 nm、および528/617 nmの励起/発光波長で測定します。蛍光顕微鏡を使用した細胞のイメージング
6.データ分析
- 分散分析(ANOVA)、ウェルチ分散分析、またはクラスカル-ウォリス検定を実行する前に、正規性検定と等分散の検定を実行します。テストされた各グループを比較するために、適切な 事後 テストを使用します。p < 0.05 に設定します。
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Representative Results
セルサイズ
一次および不死化HCECは、細胞生存率の3つの異なる段階を反映する3つの蛍光色素で視覚化されました。生細胞は緑色(カルセイン-AM)、死細胞は赤色(エチジウムホモ二量体-1)、アポトーシス細胞は黄色(アネキシンV-蛍光シグナルをよりよく視覚化するためのコンピュータ調整色)です。生細胞は細胞質にエステラーゼを含み、カルセイン-AMをカルセインに変換します。死細胞は、エチジウムホモ二量体-1に対して透過性の細胞膜を有する。アポトーシス細胞は、ホスファチジルセリンが外膜に転座するため、細胞膜で染色されます。
成長の24時間と48時間後の2種類のHCECの細胞サイズの比較は、 図1に示すように、共焦点顕微鏡を使用して行われました。iHCEC(図1A)は10 μmから20 μmの範囲の小さな細胞であり、pHCEC(図1B)は24時間の増殖後に20 μmから50 μmのサイズの範囲です。サイズ範囲において、48時間の成長後にiHCEC(図1C)およびpHCEC(図1D)についても同様の差が観察された。2種類のHCECの3D画像は、共焦点顕微鏡を使用して作成されました(図2A はpHCECを示しています。 図2B はiHCECを示しています)。
図1:共焦点顕微鏡を用いた細胞サイズの比較 。 10〜20μmの範囲の細胞を有する24(A)および48(C)時間の増殖後のiHCEC。 24(B)および48(D)時間の増殖後のpHCECは、20〜50μmの範囲の細胞サイズを有する。 40倍の水対物レンズ。スケールバー= 10および20μm(A);25および50μm(B);10および20μm(C);50 μm (D)略語:iHCEC =不死化ヒト角膜上皮細胞;pHCECs = 初代ヒト角膜上皮細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3D共焦点画像 。 成長48時間後のpHCECs(A)および24時間後のiHCECs(B)の3D共焦点画像。40倍の水対物レンズ。略語:iHCEC =不死化ヒト角膜上皮細胞;pHCECs = 初代ヒト角膜上皮細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
一次および不死化HCECに対するUVの影響
UV曝露後の一次および不死化HCECの両方の代謝活性を 図3に示します。図は、試験ウェルからの正規化された平均を示しています(4つのウェル、2つの別々の実験)。非UV曝露細胞と比較して、照射されたpHCECの代謝活性は、曝露の20分で有意に低下した。iHCECの場合、5分と20分の両方で照射された細胞の代謝活性が低下しました。したがって、iHCECよりもpHCECの代謝活性を低下させるのに長い曝露時間を要した。
図3:5分および20分の紫外線照射への曝露後のpHCECおよびiHCECの代謝活性。 *p<非UV曝露対照の0.05。UV曝露されていないコントロールは、テストサンプルと一緒にインキュベートされたがUVに曝露されていないウェル内の細胞です。Y軸は、UVに曝露されていない細胞の代謝活性に対するパーセントである。エラーバーは標準偏差を示します。略語:iHCEC =不死化ヒト角膜上皮細胞;pHCEC = 初代ヒト角膜上皮細胞;紫外線=紫外線。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
HCECからの炎症性サイトカインの放出に対するUV曝露の影響を 図4に示します。サイトカインの最大放出は、一次および不死化HCECのUV曝露の異なる時間に発生しました。iHCECによるサイトカインの最大放出は、UV曝露の5分でした。細胞は、非UV曝露細胞と比較して有意なレベル(p < 0.05)のIL-1β、IL-6、およびIL-8を放出した。さらに、iHCECの20分間のUV曝露では、有意なサイトカイン放出は発生しませんでした。しかし、pHCECの最大サイトカイン放出は、20分のUV曝露で発生しました。4つのサイトカイン(IL-1β、IL-6、IL-8、およびTNF-α)はすべて、非UV曝露細胞と比較して有意なレベルで放出されました。放出された炎症性サイトカインの総量(pg/mL)に関しては、pHCECはiHCECよりも実質的に多くのIL-1β、IL-8、およびTNF-αを放出しましたが、iHCECはより多くのIL-6を放出しました。
図4:pg/mL単位の紫外線照射後のpHCECおよびiHCECによるサイトカイン放出。 定量化された4つの炎症誘発性サイトカインは、IL-1β(A)、IL-6(B)、IL-8(C)、およびTNF-α(D)です。*p<非UV曝露コントロールの0.05。エラーバーは標準偏差を示します。略語:iHCEC =不死化ヒト角膜上皮細胞;pHCEC = 初代ヒト角膜上皮細胞;紫外線=紫外線;IL =インターロイキン;TNF-α =腫瘍壊死因子アルファ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
一次および不死化HCECに対する化学毒素の影響
図5に示すように、3つの眼毒素への曝露後の代謝活動の減少率は、pHCECとiHCECの間で類似していました。図は、試験ウェルからの正規化された平均を示しています(4つのウェル、2つの別々の実験)。
図5:3つの眼毒素に5分間および15分間曝露した後のpHCECおよびiHCECの代謝活性*p<対照の0.05。非毒素曝露対照は、試験サンプルと共にインキュベートされたが化学毒素に曝露されていないウェル内の細胞である。Y軸は、化学毒素にさらされていない細胞の代謝活性に対するパーセントです。エラーバーは標準偏差を示します。略語:iHCEC =不死化ヒト角膜上皮細胞;pHCEC = 初代ヒト角膜上皮細胞;BAK =塩化ベンザルコニウム;H2 O2 =過酸化水素;SDS = ドデシル硫酸ナトリウム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
pHCECによって放出されたサイトカインの量は、iHCECによって放出される量よりも多かった。サイトカインIL-6の放出は、3つの化学物質への曝露によって最も影響を受けました(BAK 0.001%、H 2O2 0.01%、SDS 0.0025%、図6)。図は、試験ウェル(4倍ウェル、2つの別々の実験)からの平均(pg / mL)を示しています。pHCECとiHCECの両方が、3つの化学物質すべてに曝露した後のIL-6の放出に変化を示しました。BAKは、一次および不死化HCECの両方の対照と比較してIL-6の放出の減少を引き起こしたが、H2O2は、iHCECからのIL-6の放出の増加およびpHCECからの放出の減少を引き起こした。
図6:サイトカイン放出。pg/mLで3つの眼毒素に5分および15分間曝露した後のpHCECおよびiHCECによるサイトカイン放出。定量化された4つの炎症誘発性サイトカインは、IL-1β(A)、IL-6(B)、IL-8(C)、およびTNF-α(D)です。*p < コントロールの 0.05 です。エラーバーは標準偏差を示します。略語:iHCEC =不死化ヒト角膜上皮細胞;pHCEC = 初代ヒト角膜上皮細胞;BAK =塩化ベンザルコニウム;H2 O2 =過酸化水素;SDS =ドデシル硫酸ナトリウム;IL =インターロイキン;TNF-α =腫瘍壊死因子アルファ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
細胞生存率に対するさまざまな濃度のBAKの影響
iHCECの生存率に対するBAK濃度0.001%、0.005%、および0.01%の5分間の効果を 図7に示します。BAKは、pHCECおよびiHCECの両方で0.001%でほとんど効果を示さなかった。pHCECおよびiHCECはいずれもBAKの0.005%および0.01%で有意な損傷を受けた。BAKの0.005%および0.01%では、エチジウム染色の程度はpHCECよりもiHCECの方が大きかった。カルセインは緑に染まり、エチジウムは赤に染まり、アネキシンVは青に染まります(アネキシンVカラーのコンピューター調整色により、蛍光シグナルをよりよく視覚化できます)
図7:異なる濃度のBAKに5分間曝露されたpHCECおよびiHCECの蛍光顕微鏡画像。 スケールバー= 200μm;10倍の対物レンズ。略語:iHCEC =不死化ヒト角膜上皮細胞;pHCEC = 初代ヒト角膜上皮細胞;BAK = 塩化ベンザルコニウム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
2種類のHCECの使用における潜在的な違いが評価された。細胞を同じ濃度の細胞で同じ培地(HOEM)に入れ、短期間および長期間の紫外線と3つの眼毒素に曝露しました。UV放射と化学物質の線量は、比較できる中間応答を生成するのに十分な損傷を細胞に及ぼす生理学的効果に基づいて選択されました。UV放射で5分と20分、選択した線量のBAK(0.001%)、SDS(0.0025%)、およびH2O2(0.01%)の5分と15分のばく露時間は、細胞と未処理の対照の間で有意に異なる応答を示した理想的なばく露時間と濃度でした。
HOEMは、HCECの培養に最適化された無血清培地です。HOEMは、初代細胞と不死化細胞の両方の増殖をサポートします。この調査で使用した不死化細胞株は、SV408を用いて不死化した。SV40不死化細胞は、Rb、p53、およびpp2aを妨害することによって細胞周期の進行を促進することができる癌遺伝子タンパク質を発現する17。網膜芽細胞腫(Rb)はE2F転写因子に結合して阻害し、阻害されない場合、細胞が細胞周期で進行し、分裂することを可能にします18。分子p53はまた、細胞周期19の進行を制御する転写因子に結合する。第3の分子であるpp2a 20,21の阻害も、細胞増殖を促進する22。Rb、p53、およびpp2a17を阻害するSV40癌遺伝子タンパク質の発現は、iHCECとpHCECの応答の違いに寄与する可能性があります。2種類のHCECの細胞サイズも異なっていましたが、これは、細胞が初代細胞の大きなサイズを達成する前に、不死化された細胞がこれらの分子によって分裂することを余儀なくされるため、これらの癌遺伝子阻害タンパク質に起因する可能性があります。
紫外線への角膜曝露は、角膜上皮細胞に深刻な損傷を引き起こす可能性があります。紫外線は細胞内で活性酸素種を生成し、DNAおよび細胞分子に損傷を与え、酵素プロセスを破壊する可能性があります23,24。UVBはDNAを直接損傷し、UVAは細胞内の活性酸素種の産生を介してDNAおよび他の細胞分子に損傷を与え、それが他の生体分子と反応する可能性があります25,26。このUV損傷は、曝露された細胞からの炎症性サイトカインの放出による細胞毒性および炎症を引き起こし得る3、27。この研究では、不死化細胞の代謝活性は低下したが、5分後の初代細胞株では低下しなかったため、不死化細胞は細胞代謝活性に対するUV放射の影響に対してより敏感でした。炎症性サイトカインの放出の違いは、pHCECとiHCECの間でも生じました。pHCECは、20分間の紫外線照射後にiHCECよりも多くのIL-1β、IL-8、およびTNF-αを放出しました。サイトカイン放出におけるこれらの違いは、初代細胞培養物と不死化細胞培養物の細胞サイズの違いに関連している可能性があります。初代細胞と不死化細胞の間のサイトカイン放出の異なる効果は、初代細胞株と不死化細胞株に対するタバコの煙の影響を調べた別の研究で指摘されています28。
化学毒素が眼の刺激を引き起こす可能性をモデル化するために、これらの化学物質の細胞毒性を評価するために様々な細胞培養モデルが開発されてきた。この研究は、HCECに中間的な影響を与える眼毒素は、一次および不死化HCECの両方で代謝活性がほぼ同じ割合で減少することを示しました。3つの眼毒素は、未処理の対照と比較して、ほとんどの炎症性サイトカインの実質的な放出を引き起こさなかった。しかし、この論文は、ベースラインサイトカインレベルの検出におけるこの方法の感度を示しています。不死化細胞株からサイトカインを検出する別の方法が評価されており、ベースラインサイトカインレベル29を検出できないことが判明しました。BAKばく露培養物の顕微鏡画像は、5分間のばく露および20時間の回復後、0.005%および0.01%の濃度でpHCECおよびiHCECの両方に毒性を示した。
このプロトコルの重要なステップは、細胞に中程度の毒性をもたらすUV用量と眼毒素用量を選択し、各タイプのHCECが同じ培地で増殖することを保証することでした。これにより、pHCECとiHCECに対する各治療の効果を比較することができました。この方法の修正は、毒性物質への曝露時に行うことができる。ただし、より短い時点は細胞に毒性を示さない可能性があるため、このプロトコルでテストされた時間に近い曝露時間を維持することをお勧めします。対照的に、長時間の曝露はあまりにも多くの損傷を引き起こす可能性があるため、眼毒素の毒性のわずかな違いは、このプロトコルに記載されている試験薬剤の損傷効果と比較できませんでした。
初代HCECに対する不死化HCECの利点の1つは、不死化細胞が眼毒素への曝露後の代謝活性およびサイトカイン放出について初代細胞よりも標準偏差が低いことである。したがって、曝露後の代謝活性およびサイトカイン放出を評価するため、不死化細胞は初代細胞よりも生理毒性を検出する可能性が高い。初代細胞と不死化細胞株の両方が、UV曝露後の代謝活性とサイトカイン放出に有意な影響を検出し、蛍光色素で細胞を染色した後にBAKの毒性を検出しました。
この調査で言及された毒性エンドポイントに加えて、タイトジャンクション、細胞増殖、細胞遊走、および追加のサイトカインの放出への影響を含む他のエンドポイントをテストできます。このプロトコルでは、細胞透過性、エステラーゼ活性、およびアポトーシスの測定を使用して、4つの炎症性サイトカインの放出、代謝活性、および細胞生存率に対する毒性物質の影響を評価しました。さらに、ウサギの眼刺激性試験などの生体試験では、HCECに対する毒性の作用機序を評価するのに適しているため、毒性試験バッテリーに含める必要があります。in vitroでモデル化できない他の免疫および毒性メカニズムが存在するかどうかを判断するには、動物でのin vivo試験が必要です。
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Disclosures
著者のリンドン・W・ジョーンズは、過去3年間、COREを通じて、アルコン、アラガン、アライド・イノベーションズ、オーリニア・ファーマ、BHVI、クーパービジョン、GL Chemtec、i-Med Pharma、J&J Vision、Lubris、Menicon、Nature's Way、Novartis、Ophtecs、Ote Pharma、PS Therapy、Santen、Shire、SightGlass SightSage、Visioneeringから研究支援または講演謝礼を受けています。Lyndon Jonesは、Alcon、CooperVision、J&J Vision、Novartis、Ophtecsのコンサルタントおよび/または諮問委員会の委員でもあります。他の著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らはこの研究のための資金を受け取らなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
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