Summary
Dendritiske rygsøjler er vigtige cellulære træk i nervesystemet. Her beskrives levende billeddannelsesmetoder til vurdering af strukturen og funktionen af dendritiske rygsøjler i C. elegans. Disse tilgange understøtter udviklingen af mutante skærme for gener, der definerer dendritisk rygsøjleform eller funktion.
Abstract
Dendritiske rygsøjler er specialiserede steder for synaptisk innervering moduleret af aktivitet og tjener som substrater for læring og hukommelse. For nylig er dendritiske rygsøjler blevet beskrevet for DD GABAergiske neuroner som inputsteder fra præsynaptiske kolinerge neuroner i motorkredsløbet af Caenorhabditis elegans. Dette synaptiske kredsløb kan nu tjene som en kraftfuld ny in vivo-model af rygsøjlemorfogenese og funktion, der udnytter den letkøbte genetik og klar tilgængelighed af C. elegans til levende cellebilleddannelse.
Denne protokol beskriver eksperimentelle strategier til vurdering af DD-rygsøjlens struktur og funktion. I denne tilgang bruges en superopløsningsbilledstrategi til at visualisere de indviklede former af actinrige dendritiske rygsøjler. For at evaluere DD-rygfunktionen stimulerer den lysaktiverede opsin, Chrimson, de præsynaptiske kolinerge neuroner, og calciumindikatoren, GCaMP, rapporterer de fremkaldte calciumtransienter i postsynaptiske DD-rygsøjler. Sammen omfatter disse metoder kraftfulde tilgange til identifikation af genetiske determinanter for dendritiske rygsøjler i C. elegans , der også kan styre rygsøjlemorfogenese og funktion i hjernen.
Introduction
Dendritiske rygsøjler er specialiserede cellulære strukturer, der modtager input fra naboneuroner til synaptisk transmission. Aktivering af neurotransmitterreceptorer hæver intracellulære calcium- og nedstrøms signalveje i disse karakteristiske neuronale fremspring1. På grund af den grundlæggende betydning af dendritiske rygsøjler for neurotransmission og deres fejlregulering i neuroudviklingssygdomme1, er opdagelsen af faktorer, der modulerer dendritisk rygmarvsmorfogenese og funktion, af stor interesse for neurovidenskab.
For nylig er dendritiske rygsøjler blevet identificeret i C. elegans nervesystem baseret på nøgleegenskaber, der deles med pattedyrs rygsøjler2. Denne bestemmelse er afgørende, fordi den åbner mulighed for at udnytte fordelene ved C. elegans til at undersøge rygsøjlebiologi. Dendritiske rygsøjler på Dorsal D (DD) motorneuroner modtager input fra kolinerge neuroner (VA og VB) i den ventrale nerveledning (figur 1A) 2,3,4. Her præsenteres billeddannelsesmetoder for at udforske strukturen af DD-dendritiske rygsøjler og deres funktion in vivo i et intakt nervesystem, der er let tilgængeligt for levende billeddannelse og genetisk analyse. Til overvågning af formen af dendritiske rygsøjler, (1) cytosoliske fluorescerende proteiner, som fylder dendritisk proces og rygsøjler; (2) membranbundne fluorescerende proteiner, som dekorerer grænsen til dendritiske rygsøjler og dendritter; eller (3) actinmarkørerne, LifeAct5 eller Utrophin6, som er beriget med dendritiske rygsøjler, anvendes og afslører dermed deres form. For at overvåge funktionaliteten af DD-rygsøjler bruges GCaMP-fluorescens til at detektere Ca ++ transienter fremkaldt ved aktivering af den rødforskudte opsin, Chrimson, i presynaptiske kolinerge neuroner7. Begge strategier forventes at lette undersøgelsen af DD dendritiske rygsøjler i vildtype og mutante dyr.
Protocol
1. Bestemmelse af strukturen af DD dendritiske rygsøjler
- Opret transgene orme til mærkning af DD-rygsøjler
- Brug flp-13-promotoren til at opbygge en udtryksvektor for etiketten af interesse (f.eks. cytoplasmatisk mCherry, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::utrophin) (figur 1). Se den komplette liste over plasmider i supplerende fil 1.
- Brug etablerede metoder til at generere en transgen linjemærkning DD-rygsøjler 8,9.
- Forbered tætningsmidlet
- Lav en 1:1 blanding af paraffinbaseret indlejringsmedium10 (se Materialetabel).
- Mediet opvarmes ved 60 °C indtil smeltning, derefter aliquot i mikrocentrifugerør med 1,5 ml låg, og der opretholdes en varmeblok ved 60-70 °C.
BEMÆRK: Tætningsmiddel kan vare i 4 uger i varmeblokken.
- Forbered et bedøvelsesmiddel.
- Der fremstilles stamopløsninger i destilleret H2O af 1% trikain og 1 M levamisol (se materialeoversigt). Opbevares ved -20 °C.
- Forbered en arbejdsløsning på 0,05% Tricaine og 15 mM levamisolbedøvelsesmiddel, som beskrevet i trin 1.3.3-1.3.511.
- Bland 75 μL 1% Tricaine-bestand og 22,5 μL 1 M levamisol.
- Tilsæt M9-buffer til et slutvolumen på 1,5 ml.
- Aliquot 10 μL 0,05% Tricaine, 15 mM levamisol i 0,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Den bedøvende blanding er følsom over for temperatur, og individuelle alikvoter af arbejdsløsningen bør ikke genfryses efter optøning for hvert forsøg. Se supplerende fil 2 for en opskrift på M9-buffer.
- Anskaf billeder i høj opløsning
- Forbered 10% agarose og oprethold det i vandbadet ved 60 °C.
BEMÆRK: Se rapporten af Monica Driscoll i WormBook12. - Monter 15-20 unge voksne på 10% agarosepuder og tilsæt 3 μL bedøvelsesmiddel (se trin 3).
- Påfør coverslip (orme immobiliseres inden for 5 min).
- Forsegl kanterne på dækslippen med smeltet klæbemiddelblanding (se Materialetabel).
- Anskaf billeder
- Erhvervelse i superopløsning
- Brug et laserscanningskonfokalmikroskop udstyret til superopløsningsmikroskopi med en 63x/1,40 Plan-Apochromat olieobjektivlinse for at opnå en lille pixelstørrelse (f.eks. < 50 nm). Anskaf Z-stakke ved hjælp af den trinstørrelse, der anbefales af producentens software (se Materialetabel).
- Saml en række optiske sektioner, der spænder over det samlede volumen af DD-ventralprocessen (f.eks. 15-20 skiver ved 0,19 μm trinstørrelse eller 2- 3 μm tyk). Indsend Z-stakke til billedbehandling ved hjælp af producentens software, og analyser billeder med en score højere end 7 (figur 1B, figur 2 og figur 3).
- Nyquist opkøb
- Brug et konfokalmikroskop til laserscanning til at vælge den optimale pixelstørrelse for bølgelængden af lys og numerisk blænde af det objektive objektiv, der er i brug (f.eks. 40x/1.4 Plan Fluor-oliemål).
BEMÆRK: Den mindre pixelstørrelse afslører den fine struktur af DD-rygsøjler. - Indsend stak til 3D-dekonvolution ved hjælp af automatisk algoritme (se materialetabel) (figur 3).
- Brug et konfokalmikroskop til laserscanning til at vælge den optimale pixelstørrelse for bølgelængden af lys og numerisk blænde af det objektive objektiv, der er i brug (f.eks. 40x/1.4 Plan Fluor-oliemål).
- Brug det mindst mulige Z-trin (f.eks. bestemt af Piezo-trinnet), fordi oversampling i Z kan give skarpere billeder efter 3D-dekonvolution13.
- Erhvervelse i superopløsning
- Forbered 10% agarose og oprethold det i vandbadet ved 60 °C.
- Billedanalyse
- Brug passende billedbehandlingssoftware (se Materialetabel) til at skabe fremskrivninger med maksimal intensitet af Z-stacks14.
- Tæl fremspringene manuelt på DD-dendritten.
BEMÆRK: Fremspring er vinkelrette forlængelser fra hovedakslen (figur 1B, pilespidser). - Bestem længden af DD-dendriten scoret for at beregne tætheden af rygsøjler pr. 10 μm DD-dendrit (figur 1C).
- Klassificer rygsøjler som tynde / svampe, filopodiale, stubbe eller forgrenede (figur 2A).
BEMÆRK: Tynde / svampe rygsøjler udviser en smal base (hals) og en bredere spids (hoved). Filopodiale rygsøjler viser ikke en indsnævret base (ingen hals), men har en konstant bredde. Stubby rygsøjler har en bred base og spids. Forgrenede rygsøjler er fremspring med mere end en spids.
2. Vurdering af aktivering af DD dendritiske rygsøjler ved presynaptisk kolinerg signalering
- Oprette transgene orme ved hjælp af konventionelle teknikker (f.eks. mikroinjektion)8,9
- Brug flp-13-promotoren til at drive ekspression af Ca++ -sensoren, GCaMP6'er, i DD-neuroner og unc-4-promotoren til at drive ekspression af Chrimson, en rødforskudt kanalrhodopsin, i præsynaptiske VA-neuroner (figur 4A). Se listen over plasmider i supplerende fil 1.
- Forbered All-trans Retinal (ATR) og kontrolplader.
BEMÆRK: ATR er en nødvendig cofaktor for Chrimson til at fungere som en optogenetisk aktiveret ionkanal.- Der fremstilles 100 mM ATR-stamopløsning i ethanol (100 %). Opbevares ved -20 °C i 1 ml aliquots.
- Under en laminær strømningshætte tilsættes 300 μL OP50-bakteriekultur natten over og 0,25 μL ATR til hver 60 mm NGM (Nematode Growth Medium) næringsagarplade og spredes med en steril glasstang.
- Til kontrol tilsættes 300 μL OP50-bakterier og 0,25 μL ethanol (100%) til en separat gruppe NGM-plader.
- Lad pladerne sidde i emhætten ved stuetemperatur i 24 timer (beskyttet mod omgivende lys) for at tillade bakterievækst.
BEMÆRK: Plader kan bruges efter den første 24 timers inkubation eller opretholdes ved 4 °C til brug inden for 5 dage.
- Opsætning af eksperimentet
- Placer fem NC3569 L4-trins larver på OP50-frøet ATR eller kontrolplader, der mangler ATR og vokser i mørke ved 23 °C.
- Tre dage senere skal du bruge et stereodissekeringsmikroskop til at bekræfte vulvaudvikling for at vælge L4-trins afkom fra ATR og kontrolplader til billeddannelse som beskrevet i trin 2.4.1-2.4.3.
- På et mikroskopglas anbringes 2 μL 0,05 μm polyperler (2,5% faste stoffer m/v) (se Materialetabel).
- Brug en platintråd ("ormepluk") til at tilføje en lille kugle superlim til opløsningen og hvirvle forsigtigt for at generere trådformede "tråde" af lim. Derefter tilsættes 3 μL M9-buffer (figur 4B).
- Anbring ca. ti L4 larver i opløsningen og påfør en dækslip.
BEMÆRK: Limfibre vil tilfældigt kontakte orme og immobilisere dem, efter at dækslippet er påført. Orme, der er indlejret i store kugler af lim, ser udtørrede ud og bør ikke afbildes. - Forseglingskanter på dæksel som nævnt i trin 1.4.4.
- Optagelse af fremkaldte Ca++ transienter i dendritiske rygsøjler.
- Brug et konfokalt mikroskop med roterende disk udstyret med et følsomt CCD-kamera, en 100x TIRF-olieobjektivlinse og 488 nm og 561 nm laserlinjer (se Materialetabel).
- Juster mikroskoptrinnet for at placere DD-rygsøjler i brændplanet.
- Opsæt time-lapse-erhvervelse for at belyse prøven med 488 nm laserlinje hver ramme (til detektering af GCaMP6s fluorescens) og 561 nm laserlinjen med periodiske intervaller (til Chrimson excitation).
BEMÆRK: Brug for eksempel 488 nm lys til at tage på hinanden følgende snapshots (200 ms) af GCaMP6s signal kombineret med en 200 ms puls på 561 nm lys hver 5. ramme (figur 4C-E). Med denne konfiguration detekteres GCaMP-niveauer før og efter hver 561 nm-puls ~ 1 s fra hinanden (200 ms 488 nm laser til at detektere GCaMP før VA-aktivering, 200 ms 561 nm puls til aktivering af VA og ~ 600 ms til at skifte mellem laserlinjer og emissionsfiltre. Med denne opsætning aktiveres VA-neuroner hver 2,5 s.
- Analyse af in vivo Ca++ billeddannelse
- Brug 2D-dekonvolution og billedjustering til at korrigere mindre afvigelser som følge af ormens bevægelse under anskaffelsen (se Materialetabel).
- Definer DD-dendritisk rygsøjle som interesseområdet (ROI i figur 4C-D).
- Dupliker ROI og flyt til en naboregion inde i ormen for at indsamle baggrundssignal (dvs. støj).
- Brug passende software (se Materialetabel) til at eksportere GCaMP6s intensiteter for at udmærke sig for hvert tidspunkt. Træk baggrundsfluorescens fra rygsøjlens ROI-fluorescens.
- Bestem ændringen i fluorescens ved at trække GCaMP6s fluorescens i rammen umiddelbart før 561 nm excitation (F0) fra hvert tidspunkt efter excitation (ΔF), og divider derefter med F0 for at bestemme ΔF / F0 (figur 4E).
- Tegn de normaliserede spor (se materialeoversigt).
- Udfør en parret statistisk test for hver måling af GCaMP6s fluorescens før og efter hver puls på 561 nm lys.
BEMÆRK: Denne fremgangsmåde udelukker effektivt tilfældige udsving i GCaMP6s fluorescens, der ellers reducerer den statistiske effekt af at sammenligne det gennemsnitlige GCaMP6s-signal fra alle målinger før og efter 561 nm excitation (figur 4F). - For målinger, der viser en normal eller gaussisk fordeling, skal du bruge en parret parametrisk ANOVA-test og korrigere for flere sammenligninger for hver af de to grupper (ATR før vs. efter, ingen ATR før vs. efter). Alternativt kan du bruge en ikke-parametrisk ANOVA med posthoc-korrektion til flere test til data, der normalt ikke distribueres.
BEMÆRK: Orme dyrket på plader, der mangler ATR ("ingen ATR"), er nødvendige kontroller og bør ikke vise 561 nm-aktiverede Ca ++ transienter, fordi ATR er påkrævet for Chrimson-funktion.
Representative Results
Målinger med tre uafhængige markører (cytosolisk mCherry, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) gav en gennemsnitlig tæthed på 3,4 ± 1,03 DD dendritiske rygsøjler pr. 10 μm DD-dendrit hos unge voksne af vildtype (figur 1B,C). Til denne analyse blev målingerne opnået med GFP::Utrofinmarkøren, der gav en signifikant lavere rygsøjletæthed, udelukket (2,4 ± 0,74, figur 1) på grund af interaktioner mellem Utrophin og actincytoskelet6, der potentielt driver rygsøjlemorfogenese15. Målingerne af rygsøjlens tæthed i lysmikroskopet kan sammenlignes med værdien af 4,2 rygsøjler/10 μm dendrit opnået ved rekonstruktion af 12 rygsøjler fra elektronmikrografer af DD1-neuronen2. Den levende cellebilleddannelsesmetode bekræftede, at DD-rygsøjlernes tynde / svampeformede morfologi dominerer i de voksne vs. alternative rygsøjleformer (f.eks. Filopodial, stubby, forgrenet) (figur 2B), som også er typisk for rygsøjler i det modne pattedyrs nervesystem16.
En optogenetisk strategi blev brugt til at spørge, om de formodede dendritiske rygsøjler detekteret ved højopløselig lysmikroskopi (figur 1 og figur 2) reagerer på neurotransmitterfrigivelse fra præsynaptiske steder, et karakteristisk kendetegn ved dendritiske rygsøjler i pattedyrneuroner. Grønt lys (561 nm) blev brugt til at aktivere en channelrhodopsin-variant, Chrimson, i presynaptiske kolinerge neuroner og blåt lys (488 nm) til påvisning af Ca ++-afhængig fluorescens udsendt af en cytoplasmatisk GCaMP-sonde i postsynaptiske DD-dendritiske rygsøjler. Dette eksperiment detekterede forbigående udbrud af GCaMP-signal i DD-rygsøjler umiddelbart efter optogenetisk aktivering af Chrimson i præsynaptiske VA-neuroner (figur 3). Succesen med dette eksperiment afhænger af det pålidelige udtryk for Chrimson i alle presynaptiske VA-neuroner. I dette tilfælde blev en kromosomal integrant17 af Punc-4::Chrimson-markøren brugt til at sikre ensartet VA-ekspression. Dette eksperiment kunne også udføres med et ekstrakromosomalt array. Chrimson-ekspression i en specifik VA-neuron kan uafhængigt bekræftes, for eksempel ved at koble Chrimson-transgenet til en SL2-transpliceret ledersekvens med en nedstrøms nuklear-lokaliseret GFP som en co-ekspressionsmarkør2. Det er vigtigt at udføre et kontroleksperiment i fravær af ATR for at bekræfte, at det målte GCaMP-signal afhænger af optogenetisk aktivering af Chrimson, som er strengt ATR-afhængig (figur 4D). Endelig, fordi fremkaldte Ca++ -signaler er forbigående, er det afgørende at vedtage en billeddannelsesprotokol, der tillader hurtig skift (<1 s) mellem 561 nm excitation og GCaMP-signaloptagelse med 488 nm laseren (figur 4).
Figur 1: Mærkning af DD dendritiske rygsøjler . (A) (Øverst) Seks Dorsale D (DD1-DD6) neuroner i den ventrale nerveledning af C. elegans. (Nederst) Hos voksne kontakter ventralt rettede DD-rygsøjler (pilespids) præsynaptiske terminaler af ventrale A (VA) og ventrale B (VB) motorneuroner (magenta), og DD-kommissioner strækker sig til dorsalnerveledningen for at give GABAergisk output til kroppens muskler (pil)18. Dette tal er ændret i forhold til reference2. (B) Fluorescerende mikrografer (Airyscan) af DD-rygsøjler mærket med cytosolisk mCherry, myristoyleret mRuby (MYR::mRuby), LifeAct::GFP og GFP::Utrophin i unge voksne orme. Grå pilespidser peger på rygsøjler. Skalabar = 2 μm. (C) Tæthed (rygsøjler/10 μm) af DD-neurondendritiske rygsøjler mærket med cytosolisk mCherry (3,77 ± 0,9), MYR::mRuby (3,09 ± 0,8), LifeAct::GFP (3,44 ± 1,1) eller GFP::Utrophin (2,41 ± 0,8). Alle prøver distribueres normalt. One-Way ANOVA viser, at rygsøjletætheder for cytosolisk mCherry, MYR::mRuby og LifeAct::GFP ikke er signifikant (NS) forskellige, mens rygsøjletætheden reduceres for GFP::Utrophin vs. cytosolisk mærket mCherry (p = 0,0016) og LifeAct::GFP (p = 0,0082). Den stiplede røde linje repræsenterer rygsøjlens tæthed af DD-neuroner vurderet ud fra 3D EM-rekonstruktion (4,2 rygsøjler / 10 μm). Dette tal er ændret i forhold til reference2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Imaging DD dendritiske rygsøjler. (A) (Øverst) Skematisk af rygsøjleformer. (Nederst) Airyscan-billeder af hver type rygsøjle (Scale bar = 500 nm) mærket med LifeAct::GFP (grøn) og 3D-rekonstruktioner ved serielle elektronmikrografer af en højtryksfrossen voksen (blå). (B) Rygfrekvens efter type, visualiseret med LifeAct::GFP: Tynd/svampe (55,5 ± 14,5%), Filopodial (10,3 ± 8,70%), Stubby (18,8 ± 10,7%), Forgrenet (15,42 ± 6,01%). Spines frekvens efter type visualiseret med MYR::mRuby: Tynd/Svampe (52,2 ± 16,5%), Filopodial (5,68 ± 7,0%), Stubby (33,1 ± 14,8%), Forgrenet (9,02 ± 9,6%). Uparret T-test, Filopodial (p = 0,0339); Stubby (p = 0,0009) og forgrenede (p = 0,011) rygsøjler mærket med MYR::mRuby-markøren er væsentligt forskellige fra LifeAct::GFP. Dette tal er ændret i forhold til reference2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Strategier til erhvervelse af billeder i høj opløsning af DD-rygsøjler. (A-B) (Øverst) Fluorescerende billeder af DD1-dendritter mærket med en cytosolisk markør (mCherry) af (A) Airyscan-detektor og (B) Nyquist-erhvervelse. (Nederst) DD-dendrit (rød) er afbildet med en billedanalysesoftware (auto-path-mulighed for filamentsporing), og DD-rygsøjler (blå) er grafisk illustreret ved hjælp af det halvautomatiske rygsøjledetekteringsmodul. Pilen peger på forgrenet rygsøjle forstørret i C og D. Pilespidser angiver nabotynde/svamperygge forstørret i C og D. Skalabjælke = 2 μm. (C-D) Forstørrede eksempler på (øverst) forgrenet rygsøjle (pil) og (nederst) to nærliggende tynde/svamperygge (pilespidser) opnået med (C) Airyscan-detektor eller ved (D) Nyquist-erhvervelse. Skala bar = 500 nm. Data gengivet fra2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vurdering af funktionen af DD-rygsøjler. (A) DD-motorneuroner udtrykker Ca ++ indikatoren GCaMP6s (grøn), og VA-motorneuroner udtrykker channelrhodopsin-varianten, Chrimson (magenta)7. (B) Skematisk afbildningsmetode til montering af orme til Ca++ -målinger. (1) På et rent mikroskopglas (2) anbring 2 μL 0,05 μm polyperler, (3) brug en platintråd ("ormeplukke") til at tilføje en lille kugle superlim og (4) hvirvl ind i opløsningen for at generere trådformede tråde af lim. (5) Tilsæt 3μL M9-buffer. (6) Anbring ca. ti L4-larver i opløsningen, (7) påfør dækslip og forsegl kanter med vaselin/voks. (C-D) Aktivering af VA-neuroner korrelerer med Ca ++ transienter i DD1-rygsøjler. GCaMP6s fluorescens afbildet (med 0,5 s intervaller) med periodisk lysaktivering af Chrimson (2,5 s intervaller) fremkalder Ca ++ transienter med (C) +ATR (n = 12), men ikke i (D) kontroller (-ATR, n = 12). Paneler er snapshots over tid (er), før og efter puls på 561 nm lys (lodret lyserød linje). Skalastænger = 2 μm. GCaMP6s-signal hentes fra en ROI (Region of Interest) ved spidsen af hver rygsøjle. (E) GCaMP6s fluorescens i løbet af 10 s optagelsesperioden plottet for +ATR (grøn) vs -ATR (kontrol, grå) (n = 12 videoer). Lodrette lyserøde bjælker angiver 561 nm belysning (f.eks. Chrimson-aktivering). Hvert dyr blev stimuleret 4 gange med 561 nm lys. Målinger blev indsamlet før og efter hver puls på 561 nm lys. (F) Afbildning af GCaMP6s fluorescens før og efter hver puls på 561 nm lys. GCaMP6s fluorescens blev målt 1 s efter hver puls på 561 nm lys. Fordi prøver normalt ikke distribueres, blev en parret ikke-parametrisk Friedman-test anvendt til at korrigere for flere sammenligninger af GCaMP6s fluorescens før vs. efter 561 nm lysstimulering for orme dyrket enten med ATR (+ATR, grøn) (*** p = 0,0004, n = 48 målinger) eller i fravær af ATR (-ATR, grå) (NS, Ikke signifikant, p = 0,0962, n = 48 målinger). Dette tal er ændret i forhold til reference2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Liste over plasmider, der anvendes i undersøgelsen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Sammensætning og fremstilling af M9-buffer. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Airyscan-detektoren blev valgt til at erhverve snapshots af DD-rygsøjler, fordi den giver et højere signal-støj-forhold og bedre opløsning end konventionelle konfokale mikroskoper19,20. AiryScan-billeddannelse tillader også brug af konventionelle fluorescerende proteiner (f.eks. GFP, mCherry osv.), Der nu er bredt tilgængelige for C. elegans. Selvom billeder med højere opløsning kan opnås med andre superopløsningsmetoder (f.eks. STORM, STED, PALM), kræver disse metoder fotoaktiverbare eller fotoomskiftelige fluorescerende proteiner21. Som et alternativ til Airyscan anbefales konventionelle konfokale mikroskoper. For eksempel opnår billeddannelse med Nyquist-erhvervelse (figur 3) pixelstørrelsen ved hjælp af et 40x / 1.3-mål på 123.9 nm, der er tilstrækkeligt til at skelne mellem rygsøjlemorfologiske typer (figur 2).
Til bestemmelse af rygsøjlens tæthed anbefales det at bruge et cytosolisk fluorescerende protein såsom (1) mCherry eller GFP, (2) LifeAct til at mærke actincytoskelettet eller (3) et myristoyleret fluorescerende protein (f.eks. MYR::mRuby) til mærkning af plasmamembranen (figur 1B). Til sammenligning reducerer F-actinbindingsproteinet Utrophin rygsøjlens tæthed (figur 1C), hvilket indikerer en negativ effekt på rygsøjlemorfogenese, når Utrophin er overudtrykt.
De nuværende billeddannelsesmetoder skal hjælpe med at identificere genetiske varianter, der styrer rygsøjlemorfologi 1,16. DD-rygsøjlemorfologi (dvs. tynd/svampet, filopodial, stubby, forgrenet, se figur 2) kan vurderes ud fra enkelte 2D-fremskrivninger af de ventrale nervelednings laterale billeder, da de fleste DD-rygsøjler antager en karakteristisk ventralt rettet orientering. I disse sammenligninger er det vigtigt at bruge den samme fluorescerende markør for hver tilstand, da tilsyneladende rygsøjlemorfologiske typer synes at være påvirket af mærkningsmetoden (f.eks. MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Derudover blev det bemærket, at rygformerne er dynamiske og sandsynligvis ændrer form som reaktion på de eksterne signaler 2,16. Det er således også vigtigt at sammenligne rygformer mellem genotyper på lignende udviklingsstadier og under lignende forhold.
Orienteringen af C. elegans ventrale ledning er kritisk afgørende for nøjagtig billedoptagelse. Både de ventrale og dorsale ledninger på modsatte sider af dyret skal være synlige i samme Z-plan, hvilket indikerer, at ormen er orienteret på sin side (figur 1B). Det er bedst ikke at samle billeder af orme, der bevæger sig eller er i kontakt med andre orme eller bobler nær den ventrale ledning, da dette kan nedbryde billeder af rygsøjler.
Til in vivo calciumbilleddannelse skal friske dias forberedes umiddelbart før hver erhvervelse. Det er bedst at afbilde orme i kontakt med kun tynde limfibre vs. "klumper" af lim, der har tendens til at udtørre orme og nedbryde billedet (figur 4B). I eksperimentet vist i figur 4 aktiverer pulsen på 561 nm lys hele synsfeltet. For at øge den tidsmæssige og rumlige opløsning til at detektere lokale Ca++ transienter, for eksempel inden for individuelle DD-rygsøjler, kan en galvo miniscanner, der er oprettet til 561 nm laserlinjen, bruges til at stimulere et mindre område af interesse17.
Disclosures
Vi erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Billeddannelse og analyse af Imaris blev udført i Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) understøttet af NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 og EY08126). LSM 880 er støttet af tilskud 1S10OD201630. Billedbehandling på en Nikon-spindedisk blev udført på Nikon Center of Excellence. Vi takker Jenny Schafer, CISR-direktør, og Bryan Millis for træning og indsigtsfulde diskussioner og medlemmer af Burnette-laboratoriet: Dylan Burnette, Aidan Fenix og Nilay Taneja for råd. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud til DMM (R01NS081259 og R01NS106951) og et American Heart Association-tilskud til ACC (18PRE33960581).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
References
- Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
- Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918 (2019).
- Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692 (2018).
- Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (4), 1029-1034 (2015).
- Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma - Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
- Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
- Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).
