Summary
Dendritiska spines är viktiga cellulära egenskaper i nervsystemet. Här beskrivs levande avbildningsmetoder för att bedöma strukturen och funktionen hos dendritiska ryggar i C. elegans. Dessa tillvägagångssätt stöder utvecklingen av mutanta skärmar för gener som definierar dendritisk ryggradsform eller funktion.
Abstract
Dendritiska spines är specialiserade platser för synaptisk innervation modulerad av aktivitet och fungerar som substrat för inlärning och minne. Nyligen har dendritiska ryggar beskrivits för DD GABAergiska neuroner som ingångsställen från presynaptiska kolinerga neuroner i motorkretsen av Caenorhabditis elegans. Denna synaptiska krets kan nu fungera som en kraftfull ny in vivo-modell av ryggradsmorfogenes och funktion som utnyttjar den facila genetiken och den färdiga tillgängligheten hos C. elegans till levande cellavbildning.
Detta protokoll beskriver experimentella strategier för att bedöma DD-ryggradens struktur och funktion. I detta tillvägagångssätt används en superupplöst bildstrategi för att visualisera de invecklade formerna av aktinrika dendritiska ryggar. För att utvärdera DD-ryggradsfunktionen stimulerar det ljusaktiverade opsinet, Chrimson, de presynaptiska kolinerga neuronerna, och kalciumindikatorn, GCaMP, rapporterar de framkallade kalciumtransienterna i postsynaptiska DD-spines. Tillsammans omfattar dessa metoder kraftfulla metoder för att identifiera genetiska determinanter för dendritiska ryggar i C. elegans som också kan styra ryggradens morfogenes och funktion i hjärnan.
Introduction
Dendritiska spines är specialiserade cellulära strukturer som tar emot input från närliggande neuroner för synaptisk överföring. Aktivering av neurotransmittorreceptorer höjer intracellulära kalcium- och nedströms signalvägar i dessa karakteristiska neuronala utsprång1. På grund av den grundläggande betydelsen av dendritiska spines för neurotransmission och deras felreglering i neurodevelopmental sjukdomar1, är upptäckten av faktorer som modulerar dendritisk ryggradsmorfogenes och funktion av stort intresse för neurovetenskapens område.
Nyligen har dendritiska ryggar identifierats i C. elegans nervsystem baserat på viktiga egenskaper som delas med däggdjurs ryggar2. Denna bestämning är avgörande eftersom den öppnar möjligheten att utnyttja fördelarna med C. elegans för att undersöka ryggradsbiologi. Dendritiska ryggar på dorsala D (DD) motorneuroner får input från kolinerga neuroner (VA och VB) i ventral nervkabel (figur 1A)2,3,4. Här presenteras avbildningsmetoder för att utforska strukturen hos DD-dendritiska ryggar och deras funktion in vivo i ett intakt nervsystem som är lättillgängligt för levande avbildning och genetisk analys. För övervakning av formen av dendritiska spines, (1) cytosoliska fluorescerande proteiner, som fyller den dendritiska processen och ryggraden; (2) membranbundna fluorescerande proteiner, som dekorerar gränsen för dendritiska spines och dendriter; eller (3) aktinmarkörerna, LifeAct5 eller Utrophin6, som är berikade i dendritiska ryggar används, vilket avslöjar deras form. För att övervaka funktionaliteten hos DD-spines används GCaMP-fluorescens för att detektera Ca++-transienter som framkallas genom aktivering av det rödförskjutna opsinet, Chrimson, i presynaptiska kolinerga neuroner7. Båda strategierna förväntas underlätta studien av DD-dendritiska ryggar hos vilda och muterade djur.
Protocol
1. Bestämning av strukturen hos DD dendritiska spines
- Skapa transgena maskar för att märka DD-taggar
- Använd flp-13-promotorn för att bygga en uttrycksvektor för etiketten av intresse (t.ex. cytoplasmatisk mCherry, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP:::utrophin) (figur 1). Se den fullständiga listan över plasmider i tilläggsfil 1.
- Använd etablerade metoder för att generera en transgen linje som märker DD-ryggar 8,9.
- Förbered tätningsmedlet
- Gör en 1:1-blandning av paraffinbaserat inbäddningsmedium10 (se Materialförteckning).
- Värm mediet vid 60 °C tills det smälter, alikvotera sedan i 1,5 ml täckta mikrocentrifugrör och håll ett värmeblock vid 60–70 °C.
OBS: Tätningsmedel kan hålla i 4 veckor i värmeblocket.
- Förbered ett bedövningsmedel.
- Gör stamlösningar i destillerad H2O-plastikel av 1 % trikain och 1 M levamisol (se materialtabell). Förvaras vid -20 °C.
- Bered en arbetslösning av 0,05% trikain och 15 mM levamisolebedövningsmedel, enligt beskrivningen i steg 1.3.3-1.3.511.
- Blanda 75 μl 1 % trikainstam och 22,5 μl 1 M levamisol.
- Tillsätt M9-buffert till en slutlig volym på 1,5 ml.
- Alikvot 10 μl 0,05 % trikain, 15 mM levamisol i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvaras vid -20 °C.
OBS: Narkosblandningen är känslig för temperatur, och individuella alikvoter av arbetslösningen bör inte frysas om efter upptining för varje experiment. Se tilläggsfil 2 för ett recept på M9-buffert.
- Skaffa högupplösta bilder
- Förbered 10% agaros och håll den i vattenbadet vid 60 °C.
OBS: Se rapporten av Monica Driscoll i WormBook12. - Montera 15-20 unga vuxna på 10% agaroskuddar och tillsätt 3 μL bedövningsmedel (se steg 3).
- Applicera coverslip (maskar immobiliseras inom 5 min).
- Försegla kanterna på täckglaset med smält självhäftande tätningsblandning (se Materialförteckning).
- Hämta bilder
- Förvärv med superupplösning
- Använd ett laserscanningskonfokalmikroskop utrustat för superupplösningsmikroskopi med en 63x / 1.40 Plan-Apochromat oljeobjektivlins för att uppnå en liten pixelstorlek (t.ex. < 50 nm). Skaffa Z-stackar med den stegstorlek som rekommenderas av tillverkarens programvara (se Materialförteckning).
- Samla en serie optiska sektioner som sträcker sig över den totala volymen av DD-ventralprocessen (t.ex. 15-20 skivor med 0,19 μm stegstorlek eller 2- 3 μm tjock). Skicka in Z-stackar för bildbehandling med tillverkarens programvara och analysera bilder med en poäng högre än 7 (figur 1B, figur 2 och figur 3).
- Nyquist förvärv
- Använd ett konfokalmikroskop för laserskanning för att välja den optimala pixelstorleken för ljusets våglängd och numeriska bländare för objektivlinsen som används (t.ex. 40x / 1.4 Plan Fluoroljemål).
OBS: Den mindre pixelstorleken kommer att avslöja den fina strukturen hos DD-ryggar. - Skicka in stack för 3D-dekonvolution med automatisk algoritm (se materialförteckning) (bild 3).
- Använd ett konfokalmikroskop för laserskanning för att välja den optimala pixelstorleken för ljusets våglängd och numeriska bländare för objektivlinsen som används (t.ex. 40x / 1.4 Plan Fluoroljemål).
- Använd minsta möjliga Z-steg (t.ex. bestämt av Piezo-steg) eftersom översampling i Z kan ge skarpare bilder efter 3D-dekonvolution13.
- Förvärv med superupplösning
- Förbered 10% agaros och håll den i vattenbadet vid 60 °C.
- Bildanalys
- Använd lämplig bildbehandlingsprogramvara (se materialförteckning) för att skapa projektioner med maximal intensitet av Z-stackarna14.
- Räkna utsprången manuellt på DD-dendriten.
OBS: Utsprång är vinkelräta förlängningar från huvudaxeln (figur 1B, pilspetsar). - Bestäm längden på DD-dendriten som görs för att beräkna ryggradens densitet per 10 μm DD-dendrit (figur 1C).
- Klassificera ryggar som tunna/svampiga, filopodiala, stubbiga eller grenade (figur 2A).
OBS: Tunna / svampryggar uppvisar en smal bas (nacke) och en bredare spets (huvud). Filopodial spines visar inte en trång bas (ingen nacke) men har en konstant bredd. Stubby spines har en bred bas och spets. Grenade spines är utsprång med mer än en spets.
2. Bedömning av aktivering av DD-dendritiska ryggar genom presynaptisk kolinerg signalering
- Skapa transgena maskar med konventionella tekniker (t.ex. mikroinjektion)8,9
- Använd flp-13-promotorn för att driva uttryck av Ca++ -sensorn, GCaMP6s, i DD-neuroner och unc-4-promotorn för att driva uttryck av Chrimson, en rödförskjuten channelrhodopsin, i presynaptiska VA-neuroner (figur 4A). Se listan över plasmider i tilläggsfil 1.
- Förbered All-trans Retinal (ATR) och kontrollplattor.
OBS: ATR är en nödvändig kofaktor för att Chrimson ska fungera som en optogenetiskt aktiverad jonkanal.- Bered 100 mM ATR stamlösning i etanol (100%). Förvaras vid -20 °C i alikvoter på 1 ml.
- Under en laminär flödeshuv, tillsätt 300 μL OP50 bakteriekultur över natten och 0,25 μL ATR till varje 60 mm NGM (Nematode Growth Medium) näringsagarplatta och sprid med en steril glasstav.
- För kontroller, tillsätt 300 μl OP50-bakterier och 0,25 μl etanol (100%) till en separat grupp av NGM-plattor.
- Låt plattorna sitta i huven vid rumstemperatur i 24 timmar (skyddade mot omgivande ljus) för att möjliggöra bakterietillväxt.
OBS: Plattorna kan användas efter den första 24 timmars inkubationen eller hållas vid 4 °C för användning inom 5 dagar.
- Konfigurera experimentet
- Placera fem NC3569 L4-stegslarver på OP50-seedade ATR- eller kontrollplattor som saknar ATR och växer i mörker vid 23 °C.
- Tre dagar senare, använd ett stereodissekeringsmikroskop för att bekräfta vulvautveckling för att plocka L4-stegavkomma från ATR och kontrollplattor för avbildning enligt beskrivningen i steg 2.4.1-2.4.3.
- Placera 2 μl 0,05 μm polypärlor (2,5 % fasta ämnen w/v) på mikroskopglas (se materialförteckning).
- Använd en platinatråd ("maskplockning") för att lägga till en liten kula superlim till lösningen och virvla försiktigt för att generera trådformiga "trådar" av lim. Tillsätt sedan 3 μL M9-buffert (figur 4B).
- Placera cirka tio L4-larver i lösningen och applicera en täckglas.
OBS: Limfibrer kommer slumpmässigt att kontakta maskar och immobilisera dem efter att täckglaset har applicerats. Ormar som är inbäddade i stora limkulor verkar torkade och bör inte avbildas. - Försegla kanterna på täckglaset enligt steg 1.4.4.
- Inspelning av framkallade Ca++ -transienter i dendritiska ryggar.
- Använd ett konfokalmikroskop med snurrande skivor utrustat med en känslig CCD-kamera, en 100x TIRF-oljeobjektivlins och 488 nm och 561 nm laserlinjer (se materialtabell).
- Justera mikroskopsteget för att placera DD-ryggar i fokalplanet.
- Ställ in time-lapse-förvärv för att belysa provet med 488 nm laserlinje varje ram (för detektering av GCaMP6s fluorescens) och 561 nm laserlinje med jämna mellanrum (för Chrimson excitation).
OBS: Använd till exempel 488 nm-ljus för att fånga på varandra följande ögonblicksbilder (200 ms) av GCaMP6s-signalen i kombination med en 200 ms puls på 561 nm ljus var 5: e bildruta (figur 4C-E). Med denna konfiguration detekteras GCaMP-nivåer före och efter varje 561 nm-puls ~ 1 s från varandra (200 ms 488 nm laser för att detektera GCaMP före VA-aktivering, 200 ms 561 nm puls för att aktivera VA och ~ 600 ms för att växla mellan laserlinjer och emissionsfilter. Med denna inställning aktiveras VA-neuroner var 2,5: e sekund.
- Analys av in vivo Ca++ -avbildning
- Använd 2D-dekonvolution och bildjustering för att korrigera mindre avvikelser som uppstår från maskrörelsen under förvärvet (se materialförteckningen).
- Definiera DD-dendritisk ryggrad som intresseområdet (ROI i figurerna 4C-D).
- Duplicera avkastningen och flytta till en angränsande region inuti masken för att samla in bakgrundssignal (dvs. brus).
- Använd lämplig programvara (se Materialförteckning) för att exportera GCaMP6s-intensiteter för att utmärka sig för varje tidpunkt. Subtrahera bakgrundsfluorescens från ryggradens ROI-fluorescens.
- Bestäm förändringen i fluorescens genom att subtrahera GCaMP6s-fluorescensen i ramen omedelbart före 561 nm excitation (F0) från varje tidpunkt efter excitation (ΔF) och dividera sedan med F0 för att bestämma ΔF / F0 (figur 4E).
- Diagram över de normaliserade spåren (se Materialförteckning).
- Utför ett parat statistiskt test för varje mätning av GCaMP6s fluorescens före och efter varje puls på 561 nm ljus.
OBS: Detta tillvägagångssätt utesluter effektivt slumpmässiga fluktuationer i GCaMP6s-fluorescens som annars minskar den statistiska effekten av att jämföra den genomsnittliga GCaMP6s-signalen från alla mätningar före och efter 561 nm excitation (figur 4F). - För mätningar som visar en normal eller Gaussisk fördelning, använd ett parat parametriskt ANOVA-test och korrigera för flera jämförelser för var och en av de två grupperna (ATR före vs. efter, ingen ATR före vs. efter). Alternativt, för data som normalt inte distribueras, använd en icke-parametrisk ANOVA med posthoc-korrigering för flera tester.
OBS: Maskar som odlas på plattor som saknar ATR ("ingen ATR") är nödvändiga kontroller och bör inte visa 561 nm-aktiverade Ca ++ transienter eftersom ATR krävs för Chrimson-funktionen.
Representative Results
Mätningar med tre oberoende markörer (cytosolic mCherry, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) gav en genomsnittlig densitet på 3,4 ± 1,03 DD dendritiska ryggar per 10 μm DD-dendrit hos unga vuxna av vildtyp (figur 1B,C). För denna analys exkluderades de mätningar som erhölls med GFP::Utropfinmarkören som gav en signifikant lägre ryggradstäthet (2,4 ± 0,74, figur 1) på grund av interaktioner mellan Öfte och aktincytoskelettet6 som potentiellt driver ryggradsmorfogenesen15. Mätningarna av ryggradstätheten i ljusmikroskopet är jämförbara med värdet 4,2 spines/10 μm dendrit erhållen från rekonstruktionen av 12 spines från elektronmikrografer av DD1-neuronen2. Avbildningsmetoden med levande celler bekräftade att DD-ryggradens tunna/svampformade morfologi dominerar i vuxna kontra alternativa ryggradsformer (t.ex. filopodial, stubbig, grenad) (figur 2B), vilket också är typiskt för ryggar i det mogna däggdjursnervsystemet16.
En optogenetisk strategi användes för att fråga om de presumtiva dendritiska ryggraden som detekteras med högupplöst ljusmikroskopi (figur 1 och figur 2) är mottagliga för neurotransmittorfrisättning från presynaptiska platser, ett karakteristiskt kännetecken för dendritiska ryggar i däggdjursneuroner. Grönt ljus (561 nm) användes för att aktivera en channelrhodopsin-variant, Chrimson, i presynaptiska kolinerga neuroner och blått ljus (488 nm) för att detektera Ca++-beroende fluorescens som emitteras av en cytoplasmatisk GCaMP-sond i postsynaptiska DD-dendritiska ryggar. Detta experiment detekterade övergående skurar av GCaMP-signal i DD-ryggar omedelbart efter optogenetisk aktivering av Chrimson i presynaptiska VA-neuroner (figur 3). Framgången för detta experiment beror på det tillförlitliga uttrycket av Chrimson i alla presynaptiska VA-neuroner. I detta fall användes en kromosomalintegrant 17 av Punc-4::Chrimson-markören för att säkerställa ett konsekvent VA-uttryck. Detta experiment kan också utföras med en extrakromosomal array. Chrimson-uttryck i en specifik VA-neuron kan bekräftas oberoende, till exempel genom att koppla Chrimson-transgenen till en SL2-transplicerad ledarsekvens med en nedströms kärnlokaliserad GFP som en samuttrycksmarkör2. Det är viktigt att utföra ett kontrollexperiment i frånvaro av ATR för att bekräfta att den uppmätta GCaMP-signalen beror på optogenetisk aktivering av Chrimson, som är strikt ATR-beroende (figur 4D). Slutligen, eftersom framkallade Ca ++ -signaler är övergående, är det viktigt att anta ett bildprotokoll som möjliggör snabb växling (<1 s) mellan 561 nm excitation och GCaMP-signalförvärv med 488 nm-lasern (figur 4).
Figur 1: Märkning av DD dendritiska ryggar . (A) (Överst) Sex dorsala D (DD1-DD6) neuroner i den ventrala nervkabeln hos C. elegans. (Nederst) Hos vuxna kontaktar ventralt riktade DD-ryggar (pilspets) presynaptiska terminaler av ventrala A (VA) och ventrala B (VB) motorneuroner (magenta), och DD-kommissurer sträcker sig till dorsalnervkabeln för att ge GABAergisk utgång till kroppsmuskler (pil)18. Denna siffra har ändrats från referens2. (B) Fluorescerande mikrografer (Airyscan) av DD-ryggar märkta med cytosolisk mCherry, myristoylerad mRuby (MYR::mRuby), LifeAct::GFP och GFP::Utrophin hos unga vuxna maskar. Grå pilspetsar pekar på ryggar. Skalstreck = 2 μm. (C) Densitet (ryggar/10 μm) av DD neuron dendritiska ryggar märkta med cytosolisk mCherry (3,77 ± 0,9), MYR::mRuby (3,09 ± 0,8), LifeAct::GFP (3,44 ± 1,1) eller GFP::Utrophin (2,41 ± 0,8). Alla prover distribueras normalt. Envägs ANOVA visar att ryggradstätheten för cytosolisk mCherry, MYR::mRuby och LifeAct::GFP inte är signifikant (NS) olika, medan ryggradstätheten reduceras för GFP::Utrophin vs. cytosoliskt märkt mCherry (p = 0,0016) och LifeAct::GFP (p = 0,0082). Den streckade röda linjen representerar ryggradstätheten hos DD-neuroner bedömda från 3D EM-rekonstruktion (4,2 spines/10 μm). Denna siffra har ändrats från referens2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Imaging DD dendritiska ryggar. (A) (Överst) Schematisk över ryggformer. (Nederst) Airyscan-bilder av varje typ av ryggrad (skalstång = 500 nm) märkta med LifeAct::GFP (grön) och 3D-rekonstruktioner av seriella elektronmikrografer av en högtrycksfrusen vuxen (blå). (B) Ryggradsfrekvens efter typ, visualiserad med LifeAct::GFP: Tunn/Svamp (55,5 ± 14,5%), Filopodial (10,3 ± 8,70%), Stubby (18,8 ± 10,7%), Grenad (15,42 ± 6,01%). Spines frekvens efter typ visualiserad med MYR::mRuby: Thin/Mushroom (52,2 ± 16,5%), Filopodial (5,68 ± 7,0%), Stubby (33,1 ± 14,8%), Grenad (9,02 ± 9,6%). Oparat T-test, Filopodial (p = 0,0339); Stubbiga (p = 0,0009) och grenade (p = 0,011) ryggar märkta med MYR::mRuby-markören skiljer sig avsevärt från LifeAct::GFP. Denna siffra har ändrats från referens2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Strategier för att få högupplösta bilder av DD-ryggar. (A-B) (Överst) Fluorescerande bilder av DD1-dendriter märkta med en cytosolisk markör (mCherry) av (A) Airyscan-detektor och (B) Nyquist-förvärv. (Nederst) DD-dendrit (röd) avbildas med en bildanalysprogramvara (auto-path option of filament tracer), och DD-spines (blå) illustreras grafiskt med hjälp av den halvautomatiska spinesdetekteringsmodulen. Pilen pekar på grenad ryggrad förstorad i C och D. Pilspetsar betecknar angränsande tunna/svampryggar förstorade i C och D. Skalstång = 2 μm. (C-D) Förstorade exempel på (övre) grenad ryggrad (pil) och (nedre) två angränsande tunna/svampryggar (pilspetsar) erhållna med (C) Airyscan-detektor eller genom (D) Nyquist-förvärv. Skalstreck = 500 nm. Data som återges från2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bedömning av DD-ryggarnas funktion. (A) DD-motorneuroner uttrycker Ca ++ -indikatorn GCaMP6s (grön) och VA-motorneuroner uttrycker channelrhodopsin-varianten, Chrimson (magenta)7. (B) Schematisk avbildningsmetod för montering av maskar för Ca++ -mätningar. (1) På ett rent mikroskopglas, (2) placera 2 μL 0,05 μm polypärlor, (3) använd en platinatråd ("maskplockning") för att lägga till en liten kula av superlim och (4) virvla in i lösningen för att generera trådformiga limsträngar. (5) Lägg till 3 μl M9-buffert. (6) Placera cirka tio L4-larver i lösningen, (7) applicera täckglas och försegla kanter med vaselin/vax. (C–D) Aktivering av VA-neuroner korrelerar med Ca++ -transienter i DD1-ryggar. GCaMP6s fluorescens avbildad (med 0,5 s intervall) med periodisk ljusaktivering av Chrimson (2,5 s intervall) framkallar Ca++ transienter med (C) +ATR (n = 12) men inte i (D) kontroller (-ATR, n = 12). Paneler är ögonblicksbilder över tid (er), före och efter puls på 561 nm ljus (vertikal rosa linje). Skalstänger = 2 μm. GCaMP6s-signalen förvärvas från en ROI (Region of Interest) vid spetsen av varje ryggrad. (E) GCaMP6s-fluorescens under den inspelningsperiod på 10 s som ritats för +ATR (grön) vs -ATR (kontroll, grå) (n = 12 videor). Vertikala rosa staplar betecknar 561 nm belysning (t.ex. Chrimson-aktivering). Varje djur stimulerades 4 gånger med 561 nm ljus. Mätningar samlades in före och efter varje puls på 561 nm ljus. (F) Diagram över GCaMP6s-fluorescensen före och efter varje puls på 561 nm ljus. GCaMP6s fluorescens mättes 1 s efter varje puls på 561 nm ljus. Eftersom prover inte distribueras normalt användes ett parat icke-parametriskt Friedman-test för att korrigera för flera jämförelser av GCaMP6s fluorescens före vs. efter 561 nm ljusstimulering för maskar odlade antingen med ATR (+ATR, grön) (*** p = 0,0004, n = 48 mätningar) eller i frånvaro av ATR (-ATR, grå) (NS, Inte signifikant, p = 0,0962, n = 48 mätningar). Denna siffra har ändrats från referens2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: Lista över plasmider som används i studien. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Sammansättning och beredning av M9-buffert. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Airyscan-detektorn valdes för att få ögonblicksbilder av DD-ryggar eftersom den ger ett högre signal-brusförhållande och bättre upplösning än konventionella konfokalmikroskop19,20. AiryScan-avbildning tillåter också användning av konventionella fluorescerande proteiner (t.ex. GFP, mCherry, etc.), nu allmänt tillgängliga för C. elegans. Även om bilder med högre upplösning kan erhållas med andra superupplösningsmetoder (t.ex. STORM, STED, PALM), kräver dessa metoder fotoaktiverbara eller fotoomkopplingsbara fluorescerande proteiner21. Som ett alternativ till Airyscan rekommenderas konventionella konfokalmikroskop. Till exempel uppnår avbildning med Nyquist-förvärv (figur 3) pixelstorleken med ett 40x / 1.3-mål på 123,9 nm, tillräckligt för att skilja de ryggradsmorfologiska typerna (figur 2).
För bestämning av ryggradstätheten rekommenderas användning av ett cytosoliskt fluorescerande protein såsom (1) mCherry eller GFP, (2) LifeAct för att märka aktincytoskeletten eller (3) ett myristoylerat fluorescerande protein (t.ex. MYR::mRuby) för att märka plasmamembranet (figur 1B). Som jämförelse minskar det F-aktinbindande proteinet Utrophin ryggradstätheten (figur 1C), vilket indikerar en negativ effekt på ryggradsmorfogenesen när Utrophin är överuttryckt.
De nuvarande avbildningsmetoderna bör hjälpa till att identifiera genetiska varianter som styr ryggradsmorfologin 1,16. DD-ryggradsmorfologi (dvs. tunn/svamp, filopodial, stubbig, grenad, se figur 2) kan bedömas från enstaka 2D-projektioner av de ventrala nervkabelns laterala bilder eftersom de flesta DD-ryggar antar en karakteristiskt ventralt riktad orientering. I dessa jämförelser är det viktigt att använda samma fluorescerande markör för varje tillstånd eftersom uppenbara ryggradsmorfologiska typer verkar påverkas av märkningsmetoden (t.ex. MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Dessutom noterades att ryggformerna är dynamiska och sannolikt ändrar form som svar på de yttre signalerna 2,16. Således är det också viktigt att jämföra ryggradsformer mellan genotyper i liknande utvecklingsstadier och under liknande förhållanden.
Orienteringen av C. elegans ventrala sladd är kritiskt avgörande för korrekt bildförvärv. Både ventrala och dorsala sladdar på motsatta sidor av djuret ska vara synliga i samma Z-plan, vilket indikerar att masken är orienterad på sin sida (Figur 1B). Det är bäst att inte samla bilder av maskar som rör sig eller kommer i kontakt med andra maskar eller bubblor nära ventralkabeln, eftersom detta kan försämra bilder av spines.
För kalciumavbildning in vivo måste färska objektglas beredas omedelbart före varje förvärv. Det är bäst att avbilda maskar i kontakt med endast tunna limfibrer vs. "globs" av lim som tenderar att torka maskar och försämra bilden (figur 4B). I experimentet som visas i figur 4 aktiverar pulsen på 561 nm ljus hela synfältet. För att öka den tidsmässiga och rumsliga upplösningen för att detektera lokala Ca++ -transienter, till exempel inom enskilda DD-ryggar, kan en galvo-miniskanner som ställts in för 561 nm-laserlinjen användas för att stimulera ett mindre område av intresse17.
Disclosures
Vi förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Avbildning och analys på Imaris utfördes i Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) som stöds av NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 och EY08126). LSM 880 stöds av bidrag 1S10OD201630. Avbildning på en Nikon-spinnskiva utfördes vid Nikon Center of Excellence. Vi tackar Jenny Schafer, CISR-chef, och Bryan Millis för utbildning och insiktsfulla diskussioner och medlemmar i Burnette-labbet: Dylan Burnette, Aidan Fenix och Nilay Taneja för råd. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag till DMM (R01NS081259 och R01NS106951) och ett American Heart Association-bidrag till ACC (18PRE33960581).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
References
- Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
- Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918 (2019).
- Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692 (2018).
- Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (4), 1029-1034 (2015).
- Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma - Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
- Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
- Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).
