Summary
In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Methode des Wachstums, der Reinigung und der Titration des onkolytischen Herpes-simplex-Virus für die präklinische Anwendung.
Abstract
Onkolytische Viren (OVs), wie das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV), sind eine schnell wachsende Behandlungsstrategie im Bereich der Krebsimmuntherapie. OVs, einschließlich oHSV, replizieren sich selektiv in Krebszellen und töten sie ab (schonen gesunde / normale Zellen), während sie eine Anti-Tumor-Immunität induzieren. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften werden oHSV-basierte Behandlungsstrategien zunehmend präklinisch und klinisch zur Behandlung von Krebs eingesetzt, einschließlich des von der FDA zugelassenen Talimogens Laherparevec (T-Vec). Wachstum, Reinigung und Titration sind drei wesentliche Labortechniken für alle OVs, einschließlich oHSVs, bevor sie für experimentelle Studien verwendet werden können. Dieses Papier beschreibt eine einfache Schritt-für-Schritt-Methode zur Verstärkung von oHSV in Vero-Zellen. Wenn sich oHSVs vermehren, erzeugen sie einen zytopathischen Effekt (CPE) in Vero-Zellen. Sobald 90-100% der infizierten Zellen eine CPE aufweisen, werden sie schonend geerntet, mit Benzonase und Magnesiumchlorid(MgCl2)behandelt, filtriert und mit der Saccharose-Gradienten-Methode gereinigt. Nach der Reinigung wird die Anzahl der infektiösen oHSV (als Plaque-bildende Einheiten oder PFUs bezeichnet) durch einen "Plaque-Assay" in Vero-Zellen bestimmt. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um hochtitere oHSV-Bestände für In-vitro-Studien in Zellkultur und in vivo Tierversuchen vorzubereiten.
Introduction
Onkolytische Viren (OVs) sind eine aufkommende und einzigartige Form der Krebsimmuntherapie. OVs replizieren sich selektiv in tumoren Zellen und lysieren sie (schonen normale/gesunde Zellen)1 und induzieren gleichzeitig eine Antitumorimmunität2. Das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV) ist eines der am umfangreichsten untersuchten Viren unter allen OVs. Talimogene Laherparepvec (T-VEC) ist die erste und einzige OV, die in den USA die FDA-Zulassung für die Behandlung des fortgeschrittenen Melanoms3erhalten hat. Neben T-VEC werden viele weitere gentechnisch veränderte oHSVs präklinisch und klinisch bei verschiedenen Krebsarten3,4,5,6,7, 8getestet. Die derzeitige fortgeschrittene rekombinante DNA-Biotechnologie hat die Machbarkeit der Entwicklung neuer oHSVs, die für therapeutische Transgene kodieren, weiter erhöht3,5. Ein effizientes System der oHSV-Vermehrung, -Aufreinigung und -bestimmung ist entscheidend, bevor ein (neu entwickeltes) oHSV für In-vitro- und In-vivo-Studien getestet werden kann. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Schritt-für-Schritt-Methode des oHSV-Wachstums (in Vero-Zellen), der Reinigung (durch die Saccharose-Gradienten-Methode) und der Titration (durch einen oHSV-Plaque-Assay in Vero-Zellen) (Abbildung 1). Es kann leicht in jedem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) eingesetzt werden, um einen qualitativ hochwertigen Virusbestand für präklinische Studien zu erhalten.
Vero, eine afrikanische grüne Affennierenzelllinie, ist die am häufigsten verwendete Zelllinie für die oHSV-Vermehrung9,10,11,12,13, da Vero-Zellen einen defekten antiviralen Interferon-Signalweg haben14. Andere Zelllinien mit inaktiviertem Stimulator der Interferon-Gene (STING) signalisierung können auch für das oHSV-Wachstum verwendet werden12,13. Dieses Protokoll verwendet Vero-Zellen für oHSV-Wachstum und Plaque-Assay. Nach der Vermehrung werden oHSV-infizierte Zellen geerntet, lysiert und einer Reinigung unterzogen, wobei lysierte Zellen zuerst mit Benzonase-Nuklease behandelt werden, um die DNA der Wirtszelle abzubauen, die Nukleinsäure-Protein-Aggregation zu verhindern und die Viskosität des Zelllysats zu reduzieren. Da die ordnungsgemäße Aktivierung der Benzonase oft Mg2+erfordert, werden in diesem Protokoll15 1-2mM MgCl2 verwendet. Die Wirtszellreste aus dem mit Benzonase behandelten Zelllysat werden durch serielle Filtration vor der Hochgeschwindigkeits-Saccharose-Gradientenzentrifugation weiter eliminiert. Ein viskoses 25%iges Saccharoselösungskissen trägt dazu bei, eine langsamere Virusmigration durch die Saccharoseschicht zu gewährleisten, wobei wirtszellbezogene Komponenten im Überstand belassen werden, wodurch die Reinigung verbessert und der Virusverlust im Pelletbegrenzt wird 16. Das gereinigte oHSV wird dann auf Vero-Zellen titriert, und virale Plaques werden durch Giemsa-Färbung17 oder X-Gal-Färbung (für LacZ-kodierende oHSVs)18visualisiert.
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Protocol
1) oHSV-Wachstum
HINWEIS: Stellen Sie die Genehmigung des institutionellen Biosicherheitsausschusses sicher, bevor Sie mit oHSV zusammenarbeiten. Diese Studie wurde unter dem genehmigten IBC-Protokoll Nr. 18007 durchgeführt. Halten Sie die BSL2-Vorsichtsmaßnahmen ein: Bleichen Sie alle Pipetts, Spitzen, Röhrchen und andere Materialien, die mit dem Virus in Kontakt kommen. Sprühen Sie Handschuhe mit 70% Isopropylalkohol, bevor die Hände die BSL2-Zellkulturhaube verlassen. Waschen Sie die Hände nach der Arbeit mit einem Virus immer gründlich mit Seife.
- Am Tag -1 Vero-Zellen mit niedriger Passage in 20 T-150 cm2 Kolben mit einer Dichte von 7-8 × 10 6 Zellen/Kolben in normalem Vero-Zellmedium aussäen.
HINWEIS: Vero Medium wird durch Ergänzung von Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (IFCS) hergestellt. - An Tag 0 (Zellen sind zu 80-90% konfluent), fügen Sie oHSV-Inoculum auf die Vero-Zellen hinzu.
- Herstellung von Virus inoculum
- Verwenden Sie eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 (MOI kann je nach Replikationskapazität des Virus von 0,01 bis 0,1 variieren) für die Virusverstärkung. Verwenden Sie Formel (1), um die Virusmenge (ml) für 20 Kolben zu berechnen.
Virusmenge (ml) für 20 Kolben = benötigte Virusmenge (pfu)/Titer Virusvorrat (pfu/ml)(1) - Verwenden Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 1% IFCS, um das Virusinoculum (7 ml pro T-150 cm2-Kolben, dh ~ 140 ml für 20 Kolben) vorzubereiten. Fügen Sie die erforderliche Menge oHSV zu 140 ml DPBS/1% iger IFCS-Lösung mit hohem Glukosegehalt hinzu, Wirbel für 1 minute und halten Sie die Mischung bereit für die Zugabe zu Vero-Zellen.
- Verwenden Sie eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 (MOI kann je nach Replikationskapazität des Virus von 0,01 bis 0,1 variieren) für die Virusverstärkung. Verwenden Sie Formel (1), um die Virusmenge (ml) für 20 Kolben zu berechnen.
- Waschen Sie die T-150 cm2 Kolben 2x mit DPBS mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 1% IFCS (10 ml /Waschen). Saugen Sie den DPBS/1% IFCS an und fügen Sie 7 ml Virus inoculum/T-150 cm2 Kolben hinzu.
- Die Kolben vorsichtig für 5 min mit einer Kolbenwippe schaukeln, um das Inokält über die Vero-Monoschicht richtig zu verteilen, und dann die Kolben bei 37 ° C für 1,5-2 h inkubieren. Stellen Sie sicher, dass das Inkubatorregal eben ist.
- Entfernen Sie das Inokum und fügen Sie DMEM mit 1% IFCS (25 ml / Kolben) hinzu. Inkubieren Sie die Kolben für 2-4 Tage.
- Herstellung von Virus inoculum
- Überprüfen Sie die Flaschen täglich auf 90-100% CPE (siehe Abbildung 2).
- Ernten Sie die oHSV-infizierten Vero-Zellen.
- Sammeln Sie den Kulturüberstand (~ 20 ml) aus jedem Kolben (lassen Sie ~ 5 ml in jedem Kolben) in 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen oder Medienbehältern.
- Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen vorsichtig vom Boden der Kolben abzukratzen.
HINWEIS: Die Zellen sollten schnell aus den Kolben kommen. - Geben Sie ~15 ml des Kulturüberstands (gesammelt in Schritt 1.4.1) in jeden Kolben (der das Volumen von ~20 ml in jedem Kolben bringt, d.h. 400 ml für 20 Kolben) und waschen Sie den Boden der Kolben einige Male vorsichtig mit einer sterilen serologischen Pipett von 10 ml.
HINWEIS: Nicht kräftig pipeten. Ziel ist es, alle Zellen intakt zu halten. - Sammeln Sie die Zellen (+ Medium) in 50 mL konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis (verwenden Sie 8 Röhrchen, um 400 ml geerntete Zellen aus 20 Kolben zu halten).
- Drehen Sie die Zellen bei 300 g für 10 min bei 4 °C und saugen Sie den Überstand an.
- 1,25 ml (50 %) Virus Buffer (VB) und 1,25 ml (50%) des Kulturüberstands (gesammelt in Schritt 1.4.1) zu jedem Zentrifugenröhrchen und suspendieren Sie jedes Pellet gründlich wieder. Übertragen Sie die re-suspendierten Zellen von acht 50-ml-Zentrifugenröhrchen in ein 50-ml-kegelförmiges Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Siehe die Herstellung der VB-Lösung in Tabelle 1. Filtersterilisieren Sie die VB-Lösung mit einem Mediensterilisationsfilter. Verwenden Sie 0,5 ml VB + 0,5 ml Überstand pro T-150 cm2 Kolben für die erneute Suspension, d.h. für 20 Kolben (20 ml), verwenden Sie 10 ml VB und 10 ml Kulturüberstand. - Die wieder suspendierten Zellen mit Trockeneis/100% Ethanol einfrieren und bei -80 °C lagern.
2) oHSV-Reinigung
- Snap-Freeze (in Trockeneis und 100% Ethanol) / Auftauen (in einem 37 ° C warmen Wasserbad) der Zellen gefolgt von Wasserbad-Beschallung für 1 min für insgesamt 3 Zyklen, um eine ordnungsgemäße Lyse der Zellen zu gewährleisten, um das Virus im Überstand freizusetzen.
HINWEIS: Führen Sie die Beschallung für 1 Minute mit 40 kHz, 120 V Leistung durch. Wenn kein abstimmbarer Beschaller verfügbar ist, verwenden Sie einen Ultraschall-Wasserbad-Ultraschallgerät. Nehmen Sie ein 50 μL Aliquot für die Titration in Abschnitt 3, das hilft zu identifizieren, welcher der folgenden Schritte für einen möglichen Virusverlust während des Reinigungsverfahrens verantwortlich ist. - Das Zelllysat wird mit Benzonase-Nuklease (175 Einheiten/ml) + 2 mMMgCl2 (1 M Stamm = 2 μL/ml), Wirbel behandelt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Legen Sie das Rohr auf Eis und führen Sie die folgenden Schritte bei 4 °C durch.
- Pelletieren Sie die Zellreste durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit.
- Drehen Sie das Zelllysat bei 300 g für 10 min.
- Sammeln Sie den Überstand in einem neuen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (suspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml VB erneut, bezeichnen Sie es als Pellet-1 und lagern Sie es bei 4 °C für die Verwendung in Schritt 2.3.5; siehe Abbildung 1).
- Drehen Sie den Überstand (erhalten in Schritt 2.3.2) erneut bei 500 g für 10 min.
- Sammeln Sie den Überstand in einem neuen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (suspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml VB erneut, bezeichnen Sie es als Pellet-2 und lagern Sie es bei 4 °C für die Verwendung in Schritt 2.3.5; siehe Abbildung 1).
- Kombinieren Sie das wieder suspendierte Pellet-1 (ab 2.3.2) und Pellet-2 (ab 2.3.4) zu einem neuen 1,7-ml-Zentrifugenrohr, 2x Vortex/Sonicat (Wasserbad) und spinnen Sie es bei 400 g für 10 min. Sammeln Sie den Überstand und kombinieren Sie ihn mit dem in Schritt 2.3.4 erhaltenen Überstand; siehe Abbildung 1).
HINWEIS: Führen Sie die Beschallung für 1 Minute mit 40 kHz, 120 V Leistung durch, um die Virusaggregation vor dem Filtrationsverfahren in Schritt 2.4 zu verhindern. Nehmen Sie ein 50 μL Aliquot des kombinierten Überstands zur Titration in Abschnitt 3.
- Filtern Sie den kombinierten Überstand (~21 mL, d.h. 20 mL ab 1.4.6, 0.5 mL ab 2.3.2 und 0.5 mL ab 2.3.4) mit der folgenden 3-stufigen Filtrationsmethode.
- Ziehen Sie 21 ml des Überstands mit einer 10-ml-Spritze (jeweils 5-7 ml für einen einfachen Durchgang durch den Filter) und führen Sie ihn durch einen sterilen 5 μm Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membranfilter, der auf einem neuen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (als TUBE 1gekennzeichnet) platziert ist.
- 1 ml VB wird in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen gegeben, das in 2.4.1 entleert wurde (um die verbleibende Spuren von Virusüberstand zu sammeln), Wirbel, und durch denselben 5 μm PVDF-Filter auf TUBE 1 gehen (wodurch die Gesamtmenge auf 22 ml Filtrat gebracht wird). Fahren Sie mit Schritt 2.4.2 fort.
- Ziehen Sie 22 mL des Filtrats aus TUBE 1 (wie in 2.4.1) und leiten Sie es durch einen sterilen 0,8 μm Mixed CelluloseEster (MCE) Membranfilter, der auf einem neuen 50 mL konischen Zentrifugenröhrchen (als TUBE 2 gekennzeichnet) platziert ist.
- Fügen Sie 1 ml VB zu TUBE 1 hinzu, das in Schritt 2.4.2, Wirbel, entleert wurde, und führen Sie es durch den gleichen 0,8 μm MCE-Filter, der auf TUBE 2 platziert ist (wodurch die Gesamtmenge auf 23 ml Filtrat gebracht wird). Fahren Sie mit Schritt 2.4.3 fort.
- Ziehen Sie 23 ml Filtrat aus TUBE 2 (wie in 2.4.1) und leiten Sie es durch einen sterilen 0,45 μm PVDF-Filter, der auf einem neuen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (als TUBE 3gekennzeichnet) platziert ist.
- Fügen Sie 1 ml VB zu TUBE 2 hinzu, das in Schritt 2.4.3, Wirbel, entleert wurde, und leiten Sie es durch den gleichen 0,45 μm PVDF-Filter, der auf TUBE 3 platziert ist (wodurch die Gesamtmenge auf 24 ml Filtrat gebracht wird).
HINWEIS: Nehmen Sie ein Aliquot von 50 μL des Filtrats zur Titration in Abschnitt 3.
- Fügen Sie 1 ml VB zu TUBE 2 hinzu, das in Schritt 2.4.3, Wirbel, entleert wurde, und leiten Sie es durch den gleichen 0,45 μm PVDF-Filter, der auf TUBE 3 platziert ist (wodurch die Gesamtmenge auf 24 ml Filtrat gebracht wird).
- Ziehen Sie 21 ml des Überstands mit einer 10-ml-Spritze (jeweils 5-7 ml für einen einfachen Durchgang durch den Filter) und führen Sie ihn durch einen sterilen 5 μm Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membranfilter, der auf einem neuen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (als TUBE 1gekennzeichnet) platziert ist.
- Hochgeschwindigkeitszentrifugation mit dem Saccharose-Gradienten-Verfahren
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde ein F13-14x50cy-Rotor mit festem Winkel verwendet. Sowohl der Rotor als auch die Zentrifuge müssen bei 4 °C sein, bevor mit den folgenden Schritten fortgefahren werden kann.- 10 ml einer eiskalten, steril gefilterten 25%igen Saccharoselösung (hergestellt durch Auflösen von 25 g Saccharosepulver in 100 ml Hank's Balanced Salt Solution) in ein neues 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen geben.
- Langsam (3 ml/min) werden 24 ml des Virusfiltrats (aus Schritt 2.4.3.1) auf die Saccharoseschicht auffüllen. Achten Sie darauf, getrennte Schichten des Virusfiltrats und der Saccharoselösung zu erhalten.
HINWEIS: Bis zu 30 ml der Virusschicht können über 10 ml der Saccharoselösung hinzugefügt werden. - Zentrifuge das Röhrchen für 90 min bei 22.620 g bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und die Saccharoseschicht aus dem konischen 50 mL Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Das Viruspellet sollte weißlich sein. Nehmen Sie ein 50 μL Aliquot des Überstandes und ein 50 μL Aliquot der Saccharoseschicht zur Titration in Abschnitt 3.
- Suspendieren Sie das Pellet erneut in 10% iger Glycerin/PBS-Lösung.
- 1 ml steriles 10% Glycerin (verdünnt in PBS) in das konische Zentrifugenröhrchen mit 50 ml geben, um das Pellet abzudecken.
HINWEIS: Die Menge der wieder suspendierten Mischung kann je nach Pelletgröße variieren (z. B. 0,8-1,2 ml). Ein kleineres Volumen würde eine höhere Viruskonzentration ergeben. - Legen Sie das 50 mL konische Zentrifugenrohr für 2-4 h auf Eis. Beschallen / wirbeln Sie das Pellet während dieser Zeit alle 15 Minuten für 30 s, um das Pellet zu vertreiben / wieder aufzuhängen.
- Sammeln Sie das wieder suspendierte Pellet (1 ml 10% Glycerin / PBS + die Pelletgröße bringt das Gesamtvolumen auf ~ 1,3 ml) in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. [Optional: Fügen Sie weitere 0,3 ml 10% Glycerin / PBS in das gleiche konische 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu, um die verbleibende Spurenmenge des Pellets zu sammeln, pipetieren Sie es nach oben und unten und kombinieren Sie es mit dem wieder suspendierten Pellet in Schritt 2.6.3, um das Gesamtvolumen auf ~ 1,6 ml zu bringen.]
- Wenn die Suspension in Schritt 2.6.3 trüb oder trüb ist (aufgrund von Zellablagerungen), zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 g für 10 min, übertragen Sie den Überstand in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fahren Sie mit Schritt 2.6.4 fort.
- Nehmen Sie ein 50 μL Aliquot für die oHSV-Titration in Abschnitt 3. Den Rest der Lösung (250 μL/Aliquot) in sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen (gut versiegelt für die Langzeitlagerung) einfrieren und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern (bereit für experimentelle Studien, sobald der oHSV-Titer bestimmt ist).
HINWEIS: Alle Materialien, die mit dem Virus in Kontakt kommen, müssen vor dem Entfernen aus der Haube oder der Entsorgung gebleicht oder mit ultravioletter Strahlung behandelt werden.
- 1 ml steriles 10% Glycerin (verdünnt in PBS) in das konische Zentrifugenröhrchen mit 50 ml geben, um das Pellet abzudecken.
3. oHSV-Titration und Plaque-Assay
- Samen Sie 1,7-1,8 x10 5 Vero-Zellen/Well in einer 6-Well-Zellkulturplatte in Vero-Zellmedium (DMEM mit 10% IFCS; siehe Schritt 1.1).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen homogen im gesamten Brunnen verteilt sind. Wirbeln Sie die Platte nicht, was zu einer Ansammlung von Zellen in der Mitte der Vertiefungen führen kann. Um ein Verwirbeln zu verhindern, schaukeln Sie die Platte langsam von Hand vertikal, dann horizontal und dann vorsichtig in den Inkubator. - Am nächsten Tag (wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreichen), saugen Sie das Kulturmedium an und fügen Sie 1 ml / Well PBS mit hohem Glukosegehalt hinzu, ergänzt mit 1% IFCS. Lassen Sie die Platte in der Zellkulturhaube, bis Schritt 3.3 abgeschlossen ist.
- Verdünnen Sie das Virus in 5-ml-Polypropylenröhrchen seriell mit PBS/1% IFCS(Abbildung 3).
HINWEIS: Verwenden Sie das in Schritt 2.6.4 gesammelte Aliquot von 50 μL zur seriellen Verdünnung. In der1. Röhrchen (10-3 Verdünnung) werden 2 μL des Virus im Jahr 1998 μL PBS/1%IFCS, Wirbel, hinzugefügt. Im2. Röhrchen (10-5 Verdünnung) 10 μL aus dem 1. Röhrchen in 990 μL PBS/1% IFCS, Wirbel nehmen. In der3. Röhrchen (10-6 Verdünnung) 100 μL aus der 2. Röhrchen in 900 μL PBS/1% IFCS, Wirbel nehmen; Setzen Sie diese 10-fache serielle Verdünnung bis zur10-9-Verdünnung fort. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 3. - Aspiratieren Sie PBS/1% IFCS und fügen Sie 0,7 ml/Well des seriell verdünnten Virus (beginnend von 10-5 bis 10-9)zu Vero-Zellen hinzu.
HINWEIS: Lassen Sie die Zellen nicht trocknen. - Die Platte vorsichtig auf einer Wippe für 5 min bei Raumtemperatur schaukeln (um eine homogene Verteilung des Virusinokulums zu gewährleisten).
- Inkubieren Sie die Platte für 1,5 h bei 37 °C.
HINWEIS: Bereiten Sie während dieser Inkubationszeit eine 1:1000-Verdünnung des humanen Immunglobulins G (IgG) in DMEM vor, die mit 1% IFCS ergänzt wird. Bereiten Sie für eine 6-Well-Platte 12,5 ml vor, damit 2 ml / Well in Schritt 3.7 verwendet werden können. Passen Sie die Verdünnung an, um Chargenschwankungen im menschlichen IgG zu berücksichtigen. - Entfernen Sie das Virus-Inokum aus den Vertiefungen und fügen Sie 2 ml / Well von 0,1% humanem IgG (um das oHSV im Kulturmedium zu neutralisieren und die Bildung von sekundären Plaques zu verhindern) in DMEM mit 1% IFCS ergänzt. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 3-4 Tage.
HINWEIS: Klare Plaques bilden sich normalerweise in 3 Tagen. - Fixier- und Färbeplatten
- Entfernen Sie den Überstand und fixieren Sie die Zellen für 5 min in reinem Methanol (1 ml /Well). Entfernen Sie das Methanol und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.
- Verdünnen Sie den Giemsa-Fleck (1:5) mit entionisiertem Wasser und fügen Sie 1 ml des verdünnten Giemsa-Flecks pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10-15 min.
- Entfernen Sie den Fleck, spülen Sie ihn mit Leitungswasser ab und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.
- Zählen Sie die Plaques mit einem Seziermikroskop.
- Optional für oHSVs mit lacZ-Ausdruck:
- Entfernen Sie den Überstand und fixieren Sie die Zellen mit kaltem 0,2% Glutaraldehyd / 2% Paraformaldehyd für 5-10 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS.
- Fügen Sie den Zellen X-gal-Lösung hinzu (1 ml/Well) und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h.
HINWEIS: Der X-gal-Fleck sollte am Tag der Färbung frisch zubereitet werden; Langzeitlagerung kann zu einem Ausbleichen der Farbe führen. Siehe die Herstellung der X-gal-Lösung in Tabelle 1. - Entfernen Sie den X-gal-Fleck und waschen Sie den Teller 1 Minute lang mit Leitungswasser.
- Gegenfleck mit neutraler roter Lösung (1 ml/well) für 2 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Siehe Herstellung der neutralroten Lösung in Tabelle 1. - Waschen Sie den Teller mit Leitungswasser für 1 min; Lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.
- Zählen Sie blaue Plaques mit einem Seziermikroskop (Abbildung 4).
- Berechnen Sie den Titer mit der Formel (2)
Titer in pfu/ml (plaquebildende Einheiten) = Anzahl der Plaques/0,7 ml × Verdünnungsfaktor (2)
HINWEIS: Wenn beispielsweise 25 Plaques in der10-9-Verdünnungsbohrung gefunden werden, beträgt der Titer 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/ml. Dies ist der letzte oHSV-Titer von Aliquoten, die in Schritt 2.6.4 hergestellt wurden.
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Representative Results
Ein kurzer Überblick über das gesamte Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt, die die kritischen Schritte beim Wachstum, der Reinigung und der Titration von oHSV darstellt. CPE in Vero-Zellen kann bereits 4 Stunden nach HSV-Infektion nachgewiesen werden19. Abbildung 2 zeigt CPE in Vero-Zellen zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach einer oHSV-Infektion. Das Niveau des CPE wird im Laufe der Zeit erhöht. In diesem Protokoll wird 90-100% CPE normalerweise innerhalb von 48 Stunden nach der Impfung mit niedrigem MOI oHSV beobachtet (was die beste Zeit ist, um Zellen für die Reinigung zu ernten). Abhängig vom in Schritt 1.2 geimpften oHSV-MOI und/oder dem Replikationspotenzial des oHSV kann es jedoch bis zu 4 Tage dauern. Über diesen Zeitraum hinaus können Zellen mit CPE lysiert werden, was zur Freisetzung des Virus im Überstand führt. Um einen hohen viralen Titer zu erhalten, ist es daher wichtig, CPE-betroffene Zellen zu ernten, wenn sie intakt sind. Ein weiterer wichtiger Faktor, der zum endgültigen Virustiter beiträgt, ist die Anzahl oder Größe der Gewebekulturkolben, die für die oHSV-Amplifikation verwendet werden. Abbildung 3 zeigt den Prozess der seriellen Verdünnung (10-3 bis 10-9) eines bestimmtenVirusbestands (erhalten in Schritt 2.6.4), der für die Titerbestimmung durch den Plaque-Assay erforderlich ist. Bei oHSVs mit lacZ-Expression können virale Plaques durch X-gal-Färbung visualisiert werden (Abbildung 4). In diesem Protokoll wurden 20 T-150 cm2 Gewebekulturkolben verwendet, für die 1,3-1,6 ml oHSV-Schaft mit einem Titer von 1 × 1010 pfu/ml zu erwarten sind.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der wichtigsten Schritte, die am Wachstum, der Reinigung und dem Plaque-Assay beteiligt sind. Abkürzungen: oHSV = onkolytisches Herpes-simplex-Virus; CPE = zytopathische Wirkung; VB = Viruspuffer; HBSS = Hank's Balanced Salt Solution; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zytopathische Wirkung in Vero-Zellen nach oHSV-Infektion. Vero-Zellen wurden mit oHSV-Kodierung für mCherry (in roter Fluoreszenz dargestellt) bei einem MOI von 0,01 geimpft und bei 36, 48 und 72 h Postvirusinfektion abgebildet (10-fache Vergrößerung). CPE wird durch Rundung der oHSV-infizierten Zellen identifiziert (gekennzeichnet durch schwarze Pfeile). Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzung: oHSV = onkolytisches Herpes-simplex-Virus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Eine serielle Verdünnung eines oHSV-Bestands für Plaque-Assays. Siehe auch Schritt 3.3 des Protokolls. Abkürzung: oHSV = onkolytisches Herpes-simplex-Virus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ein repräsentatives Bild von X-gal-gefärbten Plaques bei 72 h nach oHSV-Infektion. Unverdünnte (obere Vertiefung) und verdünnte (1:10; untere Vertiefung) oHSV-infizierte Zellkulturüberstände, die vero-Zellen zugesetzt werden (70-80% konfluent), gefolgt von dem in Abschnitt 3.8.5 beschriebenen X-gal-Färbeprotokoll (ausgenommen Gegenfärbung mit NeutralRot). Repräsentative Bilder einer X-gal-gefärbten Virusplakette (von links) werden in der Mitte (4x; Skalenbalken = 1000 μm) und rechts (10x; Skalenbalken = 200 μm) Panels präsentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zusammensetzung der Lösung | |
| Vorbereitung des Viruspuffers | Menge |
| 1 M Natriumchlorid | 15 ml |
| 1 M Trishydrochlorid | 3 ml |
| Gereinigtes Wasser | 132 ml |
| pH-Wert auf 6,8 einstellen | |
| Herstellung von X-gal-Lösung (~6,5 mL für eine 6-Well-Platte) | |
| 250 mM Kaliumferricyanid | 130 μL |
| 250 mM Kaliumferrocyanid | 130 μL |
| 1 M Magnesiumchlorid | 13 μL |
| X-gal vorgelöst (20 mg/ml) in Dimethylsulfoxid (DMSO) | 162,5 μL |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Herstellung der neutralen roten Lösung für eine 6-Well-Platte | |
| Neutrale rote Lösung | 100 μL |
| Methanol | 1 ml |
| Gereinigtes Wasser | 7 ml |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Lösung.
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Discussion
Das Protokoll beginnt mit dem Wachstum von oHSV in Vero-Zellen mit niedriger Passage. Die Konfluenz der Vero-Zellmonoschicht sollte zum Zeitpunkt der Virusimpfung ~ 80% betragen, da überwachsene Zellen enge faserige Strukturen entwickeln können, die den Eintritt von oHSV in Vero-Zellen reduzieren können20. Sobald 90-100% CPE beobachtet wurde, wird der Kulturüberstand entfernt, Zellen geerntet, in VB/Überstand resuspendiert (siehe Schritt 1.4.6), einrastig eingefroren und bei -80 °C zur späteren Reinigung gelagert. Blaho und Kollegen verwendeten eine etwas andere Methode zur Ernte und Lagerung infizierter Vero-Zellen. So werden die Kolben, die die Zellen und Kulturmedien enthalten (ergänzt mit 1% Rinderserumalbumin und PBS mit Kalium), zunächst bei -80 °C mindestens 15 min gelagert, gefolgt von einem langsamen Aufwärmen der Kolben bei Raumtemperatur. Die Zellen werden dann geerntet, mit steriler Milch vermischt und bei -80 °C bis zur Reinigung20 gelagert. In diesem Fall wirkt sterile Milch als Stabilisator, und es wurde gezeigt, dass der Titer eines Virusbestandes dramatisch höher ist, wenn er in steriler Milch / Medium gelagert wird, als in Medium allein20. In einer anderen Studie zeigte jedoch ein direkter Vergleich zwischen verschiedenen Stabilisatoren (einschließlich steriler Milch), die zur Lagerung mehrerer Herpesviren bei -80 °C verwendet wurden, keine signifikanten Auswirkungen auf die endgültigen Virustiter21. Hier wurde das Zellpellet in VB mit Tris-Buffer-Kochsalzlösung (pH 6,8) und 10% Glycerin als Speicherstabilisator resuspendiert, was für experimentelle Studien in der Regel einen hohen Virustiter (wie in Schritt 3.10 beschrieben) ergibt.
Es ist wichtig, alle zell- und medienbezogenen Komponenten aus dem wieder suspendierten Pellet zu entfernen, um einen hochwertigen Virusbestand zu erhalten. Die Entfernung von nicht-viralen Partikeln ist entscheidend, um mögliche Immunreaktionen während In-vivo-Experimenten zu vermeiden. Mehrere Methoden der Virusreinigung wurden beschrieben, darunter Zentrifugation22,verschiedene Gradientenmethoden23,Filtration24und Affinitätschromatographie25. Obwohl dieses Protokoll auf der Hochgeschwindigkeitszentrifugation mit einer Saccharose-Gradienten-Methode basiert, wurde eine Vielzahl anderer Gradientenmethoden von anderen verwendet, wie Iodixanol11,26, Percoll27und Ficoll-Nycodenz23. Diese Gradientenmethoden trennen das Virus durch dichte und erfordern die Isolierung des Bandes vom Gradienten anstelle des Saccharosepolsters, auf dem das Virus pelletiert wird. Die Saccharose-Gradienten-Methode bietet einen schonenden Ansatz zur Trennung viraler Partikel, da sie das Risiko minimiert, virale Hüllproteine zu stören und gleichzeitig die virale Infektiosität beizubehalten. Trotz dieser Vorteile könnte die hohe Osmolarität der konzentrierten Saccharoselösung die Viruspartikel dehydrieren; Daher wurde die Iodixanol-Gradientenmethode entwickelt, um diesen Nachteil zu überwinden. Die Iodixanol-Gradientenmethode erfordert jedoch eine Ultrazentrifuge und sammlung des Virionenbandes. Andere Faktoren, die bei der oHSV-Reinigung berücksichtigt werden müssen, sind Geschwindigkeit und Zeit der Zentrifugation und die Wahl des Viruspuffers, der für die Langzeitlagerung verwendet wird. Dieses Protokoll hat die Einschränkung, dass die Reinheit von oHSV nicht bestätigt wird; Es wurde jedoch eine hohe Anzahl funktioneller Viruspartikel in einem bestimmten gereinigten oHSV-Bestand durch Titration auf Vero-Zellen gefunden (siehe Abschnitt 3).
oHSV bildet Plaques auf Vero-Zellen (Abbildung 4). Die viralen Plaques können durch Giemsa-Färbung identifiziert werden, was eine einfache und bequeme Methode ist. Giemsa färbt Vero-Zellen und hinterlässt die viralen Plaques transparent oder leer, die leicht visualisiert (mit bloßem Auge) und mit einem Seziermikroskop gezählt werden können. Während die Überlagerung der Medien mit Agarose oder Methylcellulose häufig während der Plaquebildung (in Schritt 3.7) verwendet wird, um die Ausbreitung des Virus und sekundärer Infektionen und Plaqueschwänze zu verhindern28, ist die Verwendung von menschlichem IgG zur Neutralisierung von oHSV im Kulturüberstand einfacher und bequemer. Für oHSVs, die lacZexprimieren, können Plaques durch X-Gal-Färbung visualisiert werden (Abbildung 4), während die Fluoreszenzmikroskopie für fluoreszierendes Protein (dh grün fluoreszierendes Protein) verwendet wird - oHSVs18. Weitere Assays zum Nachweis von oHSV-infizierten Zellen umfassen immunhistochemische oder -fluoreszierende mit oHSV-spezifischen Antikörpern29 oder laserbasiertes Scannen von Nahinfrarot-Fluorophor-konjugierten oHSV-spezifischen Antikörpern30.
Es gibt kritische Maßnahmen, die befolgt werden müssen, um einen guten Virusbestand zu erreichen, wie z. B. die Aufrechterhaltung der Sterilität, um eine mikrobielle (Bakterien, Hefe oder Schimmel) Kontamination und gesunde Vero-Zellen zu verhindern. Da die Hülle von oHSV extrem thermosensitivist 20, sollte der oHSV-Stamm in einem Kryoprotektivum wie 10% Glycerin gehandhabt werden. Insgesamt kann dieses Protokoll leicht in einer Laborumgebung verwendet und praktiziert werden, ist jedoch möglicherweise nicht für die Großproduktion von Viren nützlich.
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Disclosures
SDR ist Miterfinder von Patenten im Zusammenhang mit onkolytischen Herpes-simplex-Viren, im Besitz und verwaltet von der Georgetown University und dem Massachusetts General Hospital, die Lizenzgebühren von Amgen und ActiVec Inc. erhalten haben und im wissenschaftlichen Beirat von EG 427 sind. Die anderen Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Forschung im Saha-Labor wurde teilweise durch Mittel des DOD (W81XWH-20-1-0702) und der Dodge Jones Foundation-Abilene unterstützt. Samuel D. Rabkin und Melissa R.M. Humphrey wurden teilweise von NIH unterstützt (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
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