Summary
Un protocole standard est décrit pour étudier l’activité antitumorale et la toxicité associée de l’IL-1α dans un modèle murin syngénique de HNSCC.
Abstract
La thérapie par cytokines est une stratégie immunothérapeutique prometteuse qui peut produire des réponses immunitaires antitumorales robustes chez les patients cancéreux. La cytokine pro-inflammatoire interleukine-1 alpha (IL-1α) a été évaluée comme agent anticancéreux dans plusieurs études précliniques et cliniques. Cependant, les toxicités limitant la dose, y compris les symptômes pseudo-grippaux et l’hypotension, ont refroidi l’enthousiasme pour cette stratégie thérapeutique. L’administration d’IL-1α à base de nanoparticules de polyanhydride (NP) représenterait une approche efficace dans ce contexte, car elle pourrait permettre une libération lente et contrôlée de l’IL-1α par voie systémique tout en réduisant les effets secondaires toxiques. Ici, une analyse de l’activité antitumorale des NPs polyanhydride chargés en IL-1α dans un modèle murin syngénique de carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) est décrite. Des cellules épithéliales oropharyngées murines exprimant de manière stable HPV16 E6/E7 ainsi que des cellules hRAS et luciférase (mEERL) ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de souris C57BL/6J. Une fois que les tumeurs ont atteint 3-4 mm dans n’importe quelle direction, une formulation de 1,5% d’IL-1a - chargée 20:80 1,8-bis(p-carboxyphénoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphénoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticule (IL-1α-NP) a été administrée à des souris par voie intrapéritonéale. La taille de la tumeur et le poids corporel ont été mesurés en continu jusqu’à ce que la taille de la tumeur ou la perte de poids atteigne les critères d’euthanasie. Des échantillons de sang ont été prélevés pour évaluer les réponses immunitaires antitumorales par ponction veineuse sous-maxillaire, et les cytokines inflammatoires ont été mesurées par des tests multiplex de cytokines. Les ganglions lymphatiques tumoraux et inguinaux ont été réséqués et homogénéisés en une suspension unicellulaire pour analyser diverses cellules immunitaires par cytométrie en flux multicolore. Ces méthodes standard permettront aux chercheurs d’étudier la réponse immunitaire antitumorale et le mécanisme potentiel des NP immunostimulantes et d’autres agents d’immunothérapie pour le traitement du cancer.
Introduction
L’un des domaines émergents de l’immunothérapie du cancer est l’utilisation de cytokines inflammatoires pour activer le système immunitaire des patients contre leurs cellules tumorales. Plusieurs cytokines pro-inflammatoires (c’est-à-dire l’interféron alpha (IFNα), l’interleukine-2 (IL-2) et l’interleukine-1 (IL-1)) peuvent développer une immunité antitumorale significative, ce qui a suscité un intérêt pour l’exploration des propriétés antitumorales ainsi que de la sécurité des médicaments à base de cytokines. L’interleukine-1 alpha (IL-1α) en particulier, est une cytokine pro-inflammatoire connue sous le nom de cytokine maîtresse de l’inflammation1. Depuis la découverte de cette cytokine à la fin des années 1970, elle a été étudiée comme agent anticancéreux ainsi que comme médicament hématopoïétique pour traiter les effets négatifs de la chimiothérapie2. À la fin des années 1980, plusieurs études précliniques et cliniques ont été menées pour déterminer les effets anticancéreux de l’IL-1α 3,4,5,6. Ces études ont révélé une activité antitumorale prometteuse de l’IL-1α recombinante (rIL-1α) contre le mélanome, le carcinome à cellules rénales et le carcinome ovarien. Cependant, des toxicités, y compris de la fièvre, des nausées, des vomissements, des symptômes pseudo-grippaux et l’hypotension limitant la dose la plus sévère ont été fréquemment observées. Malheureusement, ces toxicités liées à la dose ont refroidi l’enthousiasme pour une utilisation clinique ultérieure de la rIL-1α.
Pour tenter de résoudre le problème critique des toxicités induites par l’IL-1α, des formulations de nanoparticules de polyanhydride (NP) qui permettent la libération contrôlée d’IL-1α par la cinétique d’érosion de surface seront étudiées. Ces formulations de NP sont destinées à récolter les bénéfices des propriétés antitumorales de l’IL-1α tout en réduisant les effets secondaires limitant la dose7. Les polyanhydrides sont des polymères approuvés par la FDA qui se dégradent par érosion de surface, ce qui entraîne une libération presque nulle d’agents encapsulés 8,9,10,11,12. Les copolymères amphiphiles polyanhydrides contenant du 1,8-bis-(p-carboxyphénoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) et du 1,6-bis-(p-carboxyphénoxy)hexane (CPH) ont été signalés comme étant d’excellents systèmes d’administration pour diverses charges utiles dans la recherche en oncologie et en immunologie 8,12. Dans le protocole suivant 20:80, des NP CPTEG:CPH chargés de 1,5% en poids de rIL-1α (IL-1α-NPs) seront utilisés pour étudier l’activité antitumorale et la toxicité de cette cytokine dans un modèle murin de HNSCC.
L’objectif global des procédures suivantes est d’évaluer l’activité antitumorale des IL-1α-NPs sur les HNSCC. Les procédures décrites, y compris l’évaluation de la croissance tumorale et de la survie, peuvent être appliquées à tout agent immunomodulateur d’intérêt. Ces procédures doivent être effectuées dans un modèle murin syngénique avec un système immunitaire intact13 afin de maximiser la pertinence clinique. La toxicité de l’IL-1α-NP sera également évaluée en mesurant les changements dans les niveaux circulants de cytokines pro-inflammatoires et le poids des animaux. Il existe de nombreuses méthodes pour déterminer la toxicité in vivo des médicaments; Cependant, les méthodes les plus largement utilisées impliquent la mesure des enzymes sériques pour la toxicité des organes et les changements histologiques dans ces organes. Cependant, pour effectuer des analyses histologiques, l’animal doit être sacrifié, ce qui affectera les courbes de survie de l’expérience. Par conséquent, ce protocole comprendra un protocole pour le prélèvement de sang sur des souris vivantes pour la mesure des cytokines dans les échantillons de sérum. Le sérum recueilli peut être utilisé pour mesurer la toxicité de tout analyte sérique souhaité. La cytométrie de flux multicolore sera utilisée pour comprendre les changements dans la population de cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral et la migration des cellules immunitaires vers le ganglion lymphatique. D’autres méthodes peuvent être utilisées pour identifier les cellules immunitaires, y compris l’immunohistochimie et / ou l’immunofluorescence des sections préservées14. Cependant, ces techniques peuvent être longues et fastidieuses à réaliser sur un grand nombre d’animaux. Dans l’ensemble, les méthodes suivantes permettront aux chercheurs d’étudier la réponse immunitaire antitumorale et les mécanismes potentiels des agents immunostimulants pour le traitement du cancer.
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Protocol
Toutes les procédures in vivo utilisées dans cette étude ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Iowa.
1. Préparation et maintenance de la lignée cellulaire HNSCC
REMARQUE: Dans cette étude, la lignée cellulaire épithéliale oropharyngée murine transformée de manière stable avec HPV E6 et E7 avec hRas et luciférase (mEERL) sera utilisée. Cette lignée cellulaire a été développée à partir de la souche de souris C57BL/6J et a été offerte par le Dr Paola D. Vermeer (Département de chirurgie, École de médecine Sanford de l’Université du Dakota du Sud, Dakota du Sud, États-Unis).
- Décongeler un flacon congelé de cellules mEERL dans un bain-marie préchauffé (37 °C), puis transférer dans un tube conique de 15 ml contenant un milieu de culture chaud (milieu Eagle modifié de Dulbecco [DMEM] complété par 40,5 % de DMEM/Hams F12 à 1:1, 10 % de sérum bovin fœtal [FBS], 0,1 % de gentamicine, 0,005 % d’hydrocortisone, 0,05 % de transferrine, 0,05 % d’insuline, 0,0014 % de tri-iodothyronine et 0,005 % de facteur de croissance épidermique).
- Centrifuger le tube conique à 277 x g pendant 5 min à 25 °C pour retirer le média. Ensuite, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu frais de 3 à 5 mL et la transférer dans un ballon de culture cellulaire T-25. Pour une récupération optimale après un stockage congelé, plaquez des cellules à haute densité.
REMARQUE : Les flacons T-25 ont été utilisés en raison de leur plus petite taille, ce qui accélère les temps de récupération de l’entreposage congelé lorsque les cellules sont à proximité par rapport aux flacons de T-75. - Laisser les cellules se développer dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2, se dilater en flacons plus grands (c.-à-d. T-75 ou T-150) et passer tous les 3 jours. Lorsqu’il y a suffisamment de cellules pour l’implantation souhaitée chez toutes les souris, retirez les flacons, jetez le média et rincez doucement les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ensuite, ajouter 4 mL (si vous utilisez des fioles T150) de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber à 37 °C pendant 2 min. Augmenter ou diminuer la quantité de trypsine en fonction de la taille du plat ou du flacon utilisé.
REMARQUE: Le type de lignée cellulaire et le degré de confluence peuvent affecter les temps de trypsinisation. De longues périodes de trypsinisation peuvent endommager les cellules, ce qui entraîne une faible viabilité. Utilisez le minimum de temps nécessaire à la trypsinisation. - Au microscope, les cellules détachées sur la trypsinisation se déplacent librement. Si certaines cellules sont encore attachées, tapotez très doucement la fiole pour mobiliser les cellules adhérentes restantes. Ajouter un nouveau média (tartre de média au besoin) pour arrêter la réaction de trypsine et recueillir la suspension cellulaire dans des tubes coniques de 50 mL. Centrifuger à 277 x g pendant 5 min à 25 °C pour retirer le média.
- Remettez les cellules en suspension dans un milieu frais et comptez les cellules. Centrifuger une fois de plus (comme décrit ci-dessus), puis ajouter du PBS froid aux cellules pour obtenir une concentration finale de 10 × 106 cellules/mL. Gardez la ou les suspensions cellulaires sur de la glace avant l’injection à des souris.
2. Implantation tumorale, traitement médicamenteux et mesure
REMARQUE : Les animaux de laboratoire ont été gardés dans l’installation de soins aux animaux de l’Université de l’Iowa et ont suivi les procédures d’asepsie appropriées pour les manipuler.
- Anesthésier les souris C57Bl/6J avec un mélange de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Rasez soigneusement la zone du flanc ou le site d’injection souhaité avec un rasoir électrique.
REMARQUE : N’oubliez pas de documenter l’utilisation des substances désignées conformément aux règles et règlements de l’établissement (ou autres). - Désinfecter la zone du flanc avec un tampon d’éthanol et injecter lentement 100 μL (contenant 1 x 106 cellules) de la suspension cellulaire par voie sous-cutanée à l’aide d’une seringue de 25-28 G. Anesthésiez les souris avant l’injection pour éviter les mouvements brusques et la perte cellulaire. Avant chaque injection, mélangez délicatement la suspension cellulaire pour empêcher les cellules de se déposer au fond du flacon ou du tube conique.
- Après avoir pris la suspension cellulaire dans la seringue, retirez toutes les bulles et l’espace mort du haut. Injectez la suspension cellulaire de manière lente et régulière. N’utilisez pas la même aiguille sur plusieurs souris. Faites toujours des suspensions de cellules supplémentaires pour tenir compte de la perte accidentelle.
- Placez l’animal dans leurs cages respectives et surveillez-les jusqu’à ce qu’ils se remettent de l’anesthésie. Pendant l’anesthésie, les animaux sont à risque d’hypothermie; Par conséquent, fournissez de la chaleur supplémentaire ou placez les souris les unes près des autres pour les garder au chaud (si elles sont logées dans la même cage).
- Lorsque les tumeurs atteignent 3 mm dans n’importe quelle direction, randomisez les souris (par taille et / ou poids de la tumeur) dans les groupes de traitement, puis commencez le traitement médicamenteux. Injecter aux souris par voie intrapéritonéale (i.p.) des NPs15 contenant 3,75 μg de rIL-1α/souris aux jours 4 et 9. Mesurer et enregistrer le volume tumoral ((longueur x largeur 2) /2) et le poids de la souris quotidiennement ou tous les deux jours jusqu’à ce que la taille de la tumeur ou les souris atteignent les critères d’euthanasie.
REMARQUE: Même avec un chercheur expérimenté, il est difficile d’implanter la tumeur de même taille chez toutes les souris. Randomiser les animaux en groupes expérimentaux en fonction de la taille de la tumeur et du poids de la souris.
3. Prélèvement sanguin et séparation du sérum
REMARQUE: Le prélèvement sanguin d’une veine sous-maxillaire est une technique facile et efficace qui permet le prélèvement de sang sur des animaux conscients ou sous anesthésie. Pour cette étude, du sang a été prélevé sur les animaux lorsqu’ils étaient sous anesthésie.
- Anesthésiez les souris avec une injection de mélange kétamine/xylazine comme mentionné ci-dessus.
- Saisissez la peau lâche sur l’épaule à l’aide de la main non dominante et percez la veine sous-maxillaire avec une aiguille ou une lancette de 18 G, légèrement derrière la mandibule (une tache blanche à cette zone).
- Percez la veine pour assurer la circulation sanguine immédiatement. Recueillir de 200 à 300 μL de sang (selon le poids de la souris) dans un tube microcentrifuge en polypropylène de 1,5 mL ou un tube séparateur de sérum. Après le prélèvement sanguin, appliquez une légère pression sur le site de ponction jusqu’à ce que le saignement ait cessé. Remettez les souris dans leurs cages respectives et observez-les jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie.
REMARQUE: Ne pas prélever plus de 1% du poids corporel de la souris en une seule collection ou sur une période de 24 heures. - Laissez le sang recueilli coaguler à température ambiante pendant 20-30 min. Placez les tubes sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être centrifugés.
- Centrifuger le sang coagulé à 1540 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Recueillir la couche supérieure (sérum) sans déranger les globules rouges. Conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
4. Multiplexage du sérum collecté
- Décongelez les échantillons de sérum ou de plasma tout en les gardant sur la glace.
- Centrifuger les échantillons à 1540 x g pendant 5 min à 4 °C pour sédimenter les débris cellulaires et prélever soigneusement la couche de sérum par le haut.
- Sortez le kit multiplex à température ambiante.
REMARQUE: Il existe plusieurs kits multiplex disponibles dans le commerce qui sont conçus pour des cytokines, des chimiokines ou des facteurs de croissance spécifiques. En outre, il est possible de personnaliser le kit en fonction de la protéine d’intérêt. - Effectuer le test selon le protocole du fabricant pour détecter les cytokines.
REMARQUE: La plupart des kits multiplex utilisent des billes magnétiques pour lier l’anticorps capturé. Il est donc essentiel d’utiliser une laveuse magnétique automatisée ou portative pendant le lavage. Sinon, les billes magnétiques se détacheront de la plaque et on n’aura pas assez d’événements pour prendre la lecture.
5. Collecte de la tumeur et du ganglion lymphatique inguinal et préparation de la suspension unicellulaire
- Anesthésier les souris avec un mélange kétamine/xylazine. Pour assurer une sédation complète, utilisez le réflexe de pédale (pincement ferme des orteils). Si les souris ne répondent pas, euthanasiez-les par luxation cervicale.
- Posez chaque souris sur son dos et vaporisez de l’éthanol à 70% sur la peau de la région abdominale. Utilisez des pinces et des ciseaux pour couper la tumeur du côté gauche des souris et le ganglion lymphatique du côté droit. Si la tumeur est grosse, coupez en petits morceaux et prenez 500-600 mg de tissu. Pour le ganglion lymphatique, prélever tout l’organe.
NOTE: Il y a deux ganglions lymphatiques des deux côtés de la région inguinale. Selon les objectifs expérimentaux, le ganglion lymphatique et la tumeur peuvent être isolés du même côté. Cependant, si la tumeur devient très grande, il ne sera pas facile de recueillir le ganglion lymphatique du même côté. - Placez les tissus sur les tubes dissociateurs respectifs contenant 3 à 5 ml de milieu RPMI. Homogénéiser le tissu à l’aide d’un dissociateur automatisé.
REMARQUE: D’autres homogénéisateurs automatisés ou portables peuvent être utilisés. - Après homogénéisation, transférer la suspension cellulaire à travers un filtre de 70 μm dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger à 277 x g pendant 5 min à 25 °C pour retirer le média. Lavez et remettez en suspension les cellules dans 1-2 mL de PBS froid.
6. Coloration FACS de la suspension unicellulaire
- Utilisez une coloration au bleu trypan à 0,4% pour compter les cellules viables dans un hémocytomètre. Calculez le volume nécessaire pour obtenir 2 à 3 millions de cellules et transférez-les dans le tube FACS respectif.
- Utiliser un colorant de viabilité pour fermer sur les cellules vivantes; Sinon, une liaison non spécifique de l’anticorps avec des cellules mortes peut se produire, ce qui peut donner un résultat faussement positif.
REMARQUE: Le colorant zombie a été utilisé pour la coloration des cellules vivantes et mortes dans cette expérience. Plusieurs colorants réparables et non réparables (p. ex. iodure de propidium) sont disponibles dans le commerce. - Centrifuger (277 x g pendant 5 min à 25 °C) les cellules comptées. Décanter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 300 μL de PBS. Ajouter 0,5-1 μL de colorant/tube zombie. Incuber à température ambiante pendant 20 min dans l’obscurité.
- Centrifuger (277 x g pendant 5 min à 25 °C) et laver les cellules avec 1-2 mL de tampon FACS et les remettre en suspension dans 200 μL de tampon FACS.
- Ajouter un bloqueur des récepteurs Fc (2 μL par 200 μL ou selon le protocole du fabricant) et incuber les cellules pendant 10 min.
- Centrifuger (277 x g pendant 5 min à 25 °C) et laver les cellules avec 1-2 ml de tampon FACS. Ajouter le cocktail d’anticorps et incuber pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
- Après l’incubation, centrifuger (277 x g pendant 5 min à 25 °C) et laver les cellules avec un tampon FACS de 1 à 2 mL. Ajouter 300-400 μL de solution de paraformaldéhyde à 2% et remettre en suspension pour la fixation. Conservez les cellules à cette étape pendant quelques jours à 4 °C ou analysez-les immédiatement par cytomètre en flux multicolore.
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Representative Results
Dans cette étude, l’activité antitumorale du polyanhydride IL-1α dans un modèle murin syngénique de HNSCC a été étudiée. L’IL-1α recombinante (rIL-1α) a significativement ralenti la croissance tumorale de mEERL (Figure 1A), bien qu’une perte de poids ait été observée chez les souris traitées, qui a été restaurée après l’arrêt du traitement (Figure 1B). Les IL-1α-NPs n’ont pas induit d’effet antitumoral significatif par rapport aux NP salines ou vierges (Figure 1A) et se sont accompagnées d’une certaine perte de poids, bien que pas aussi importante que la rIL-1α (Figure 1B). Les souris traitées avec rIL-1α ont survécu significativement plus longtemps que les autres groupes de traitement (Figure 1C). De plus, les concentrations circulantes d’IL-1α, d’IL-1β et d’IFN-γ étaient plus élevées chez les souris traitées à la rIL-1α que chez les autres groupes de traitement (Figure 2A-C). Ces résultats suggèrent que des améliorations de l’IL-1α-NP en ce qui concerne l’efficacité antitumorale sont justifiées.
Figure 1: Effet de rIL-1α sur la croissance tumorale, la survie et le poids corporel. Des souris mâles C57BL/6J (n = 10-11 souris/groupe de traitement) porteuses de tumeurs mEERL HNSCC ont été traitées i.p. le jour 1 et le jour 5 avec du rIL-1α (3,75 μg de rIL-1α), de l’IL-1α-NP (0,25 mg de NP contenant 3,75 μg de rIL-1α), du Blank-NP (0,25 mg de NP) et de 100 μL de solution saline (CON). Les changements dans le volume tumoral moyen (A), le poids corporel normalisé (B) et les courbes de survie (C) sont montrés. Les barres d’erreur représentent l’erreur type de la moyenne. *p < 0,05 par rapport aux autres groupes de traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effet de la rIL-1α sur les cytokines circulantes. Des échantillons de sang ont été prélevés sur un sous-ensemble de souris (n = 4 souris / groupe de traitement) après la deuxième administration du médicament et analysés pour les niveaux de cytokines circulantes par test multiplex. Les niveaux circulants d’IL-1α (A), d’IL-1β (B) et d’IFN-γ (C) sont indiqués. Les barres d’erreur représentent l’erreur type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole permettra à tout chercheur d’étudier l’activité antitumorale et certains des mécanismes sous-jacents des médicaments immunomodulateurs dans un système modèle murin tumoral in vivo . Ici, un modèle de tumeur sous-cutanée syngénique a été utilisé, qui présente plusieurs avantages par rapport aux modèles orthotopiques, notamment son protocole techniquement simple, une surveillance facile de la croissance tumorale, une morbidité animale moindre et une productivité plus élevée. Les modèles tumoraux sous-cutanés peuvent également être modifiés en un modèle tumoral bilatéral en injectant des cellules tumorales sur les flancs gauche et droit. Dans ce modèle tumoral bilatéral, la radiothérapie ou des médicaments peuvent être administrés à une tumeur intratumoralement, et les réponses abscopales peuvent être surveillées. Les modèles murins orthotopiques HNSCC, bien que plus pertinents sur le plan clinique, sont techniquement difficiles à générer, difficiles à surveiller la croissance tumorale, et la charge tumorale dans la cavité buccale entraîne souvent une euthanasie prématurée en raison de l’incapacité des souris à manger et à boire.
La préparation des cellules est une étape importante pour la formation de tumeurs symétriques et de taille similaire chez toutes les souris. Une mauvaise préparation des cellules entraîne une réduction de la viabilité cellulaire et affecte grandement la génération de tumeurs chez la souris. Il est recommandé que les cellules tumorales soient à un nombre de passage précoce et à 80% à 90% de confluence. Un nombre de passages et une confluence plus élevés affectent la viabilité cellulaire et donc la génération de tumeurs. Les cellules doivent également être injectées dès que possible après la préparation, car la viabilité est réduite si elle est conservée dans le PBS au-delà de 20-30 minutes. Si un grand nombre de souris doivent être implantées avec des tumeurs, il est recommandé de fabriquer une solution mère de cellules conservées dans des milieux et de préparer des suspensions cellulaires injectables dans du PBS pour un plus petit groupe d’animaux.
Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole qui doivent être soigneusement maintenues après la préparation des cellules tumorales pour l’injection. L’injection de cellules tumorales dans l’espace sous-cutané pourrait produire des modèles et des tailles de croissance tumorale différents par rapport à l’espace sous-cutané. Par conséquent, une attention particulière doit être accordée au placement de l’aiguille pour une formation tumorale cohérente. Le choix des aiguilles est également important. Si l’aiguille est plus petite que la cellule cancéreuse, des aiguilles plus petites pourraient stresser les cellules, ce qui réduirait la viabilité. Si l’aiguille est très grosse, elle pourrait blesser l’animal et entraîner une fuite cellulaire du site injecté. Même pour les chercheurs expérimentés avec la bonne taille d’aiguille, il peut y avoir une fuite cellulaire au site injecté entraînant une petite tumeur ou pas de tumeur. Il est important que les chercheurs utilisent la bonne technique pour l’injection tumorale et la taille optimale de l’aiguille afin de réduire la perte de cellules tumorales et d’augmenter l’exactitude et la précision lors de l’implantation des cellules tumorales. Les mesures tumorales doivent être effectuées avec soin à l’aide d’étriers Vernier (manuels ou électroniques). La meilleure pratique consiste à être cohérent avec la direction de la mesure de la longueur et de la largeur de la tumeur afin de réduire la variabilité. La mesure de la tumeur par le même chercheur tout au long de l’étude peut réduire la variabilité.
Comme prévu, les souris recevant rIL-1α ont perdu du poids pendant le traitement, ce qui confirme les résultats précédents15,16. Bien que la perte de poids soit un moyen simple et direct d’évaluer la toxicité, il existe d’autres paramètres toxicologiques qui peuvent être utilisés. L’évaluation du nombre de cellules sanguines (globules blancs, globules rouges et numération plaquettaire) et des taux d’enzymes hépatiques (aspartate transaminase, alanine aminotransférase et phosphatase alcaline) fournit des informations précieuses sur la toxicité des médicaments. De plus, un sous-ensemble de souris peut être sacrifié et une analyse histopathologique des organes (foie, reins, pancréas, poumon, etc.) peut être effectuée. L’inflammation systémique est souvent utilisée comme indicateur de toxicité. Ici, un certain nombre de cytokines pro-inflammatoires circulantes ont été analysées chez les souris après traitement médicamenteux par ponction veineuse sous-maxillaire à l’aide d’une aiguille de 18 G. La ponction veineuse sous-maxillaire sur la souris nécessite une compétence qui provient de nombreuses répétitions de la procédure. Si la ponction est trop profonde, elle peut provoquer des saignements de l’oreille et des lésions tissulaires internes. Alors que, si l’aiguille n’est pas pénétrée assez loin, une quantité insuffisante de sang peut être recueillie. Les alternatives aux aiguilles sont l’utilisation de lancettes saignantes jetables. Il existe différents types de lancettes saignantes disponibles dans le commerce qui diffèrent par leur longueur. Les chercheurs devraient utiliser une taille de lancette appropriée pour assurer une collecte sanguine optimale et un traitement sans cruauté des animaux. Pour cette procédure, les résultats pour trois cytokines sont présentés (Figure 2A-C). Il est probable qu’une augmentation des cytokines pro-inflammatoires circulantes, y compris l’IL-1α, l’IL-1β et l’IFN-γ observée chez les souris traitées à la rIL-1α, puisse être associée à une perte de poids aiguë (Figure 1B) observée dans ce groupe de traitement.
Enfin, un protocole d’isolement et de préparation de suspensions unicellulaires de tumeurs et de ganglions lymphatiques de souris est décrit. Cette méthode est utile pour ceux qui cherchent à détecter les changements dans l’activation et le recrutement des cellules immunitaires dus au traitement médicamenteux. Lors de la dissection des tumeurs, le tissu adipeux, la peau, les cheveux et autres débris doivent être éliminés autant que possible. Habituellement, le volume tumoral doit être supérieur à 30 mm3 pour avoir suffisamment de cellules pour la cytométrie en flux. Cependant, si la tumeur est très grande, il peut être difficile de préparer des suspensions unicellulaires. Les grosses tumeurs doivent être coupées en petits morceaux avant d’être placées dans le tube dissociateur. Le processus doit être fait rapidement pour obtenir des cellules viables optimales. De plus, les grosses tumeurs rendent difficile la recherche du ganglion lymphatique inguinal du côté de la tumeur. Dans ce cas, le ganglion lymphatique inguinal peut être prélevé à partir du site opposé. Une fois les suspensions unicellulaires obtenues, elles peuvent être colorées avec différents anticorps et analysées par cytométrie en flux multicolore.
Dans l’ensemble, ces protocoles fournissent un moyen efficace d’étudier l’activité antitumorale des médicaments immunomodulateurs et les changements associés dans les cytokines circulantes et les populations de cellules immunitaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par le Merit Review Award #I01BX004829 des États-Unis (É.-U.) Département des anciens combattants, Service de recherche et de développement en laboratoire biomédical et soutenu par le programme de prix Mezhir par l’intermédiaire du Holden Comprehensive Cancer Center de l’Université de l’Iowa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
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