Summary
我们描述了一种在无柄水滴上形成气体水合物的方法，以研究各种抑制剂，启动子和底物对水合物晶体形态的影响。
Abstract
本文描述了一种在水滴上形成甲烷水合物壳的方法。此外，它还提供了额定工作压力为10 MPa的压力传感器的蓝图，其中包含用于无柄液滴的阶段，用于可视化的蓝宝石窗口以及温度和压力传感器。连接到甲烷气瓶的压力泵用于将电池加压至5 MPa。冷却系统是一个10加仑（37.85升）的罐，含有50%的乙醇溶液，通过乙二醇通过铜盘管冷却。这种设置可以分别观察与冷却和减压期间与水合物形成和解离相关的温度变化，以及液滴形态变化的可视化和摄影。使用该方法，在~-6°C至-9°C下观察到水合物壳的快速形成。 在减压过程中，由于放热水合物解离，在压力/温度（P / T）稳定性曲线下观察到0.2°C至0.5°C的温度下降，通过在温度下降开始时的熔化视觉观察证实。在从2 MPa抑制到5 MPa后观察到"记忆效应"。这种实验设计允许监测液滴随时间推移的压力，温度和形态，使其成为测试水合物形态上的各种添加剂和底物的合适方法。
Introduction
天然气水合物是氢键水分子的笼子， 通过 范德华相互作用捕获客体气体分子。甲烷水合物在高压和低温条件下形成，这些条件发生在自然界中沿大陆边缘的地下沉积物中，北极永久冻土层下以及太阳系中的其他行星体1。天然气水合物储存了数千亿吨碳，对气候和能源具有重要意义2。天然气水合物在天然气工业中也可能是危险的，因为天然气管道中会出现有利于水合物的条件，这可能会堵塞管道，导致致命的爆炸和石油泄漏3。
由于原位研究天然气水合物的困难，实验室实验通常用于表征水合物的性质以及抑制剂和底物的影响4。这些实验室实验是通过在各种形状和大小的细胞中以高压生长气体水合物来进行的。防止天然气管道中天然气水合物形成的努力导致了几种化学和生物天然气水合物抑制剂的发现，包括防冻蛋白（AFP），表面活性剂，氨基酸和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5，6。为了确定这些化合物对天然气水合物性质的影响，这些实验采用了不同的容器设计，包括高压灭菌器，结晶器，搅拌反应器和摇摆池，其支持0.2至106立方厘米4的体积。
这里和以前的研究7，8，9，10，11，12中使用的无柄液滴方法涉及在压力池内的无柄水滴上形成气体水合物膜。 这些容器由不锈钢和蓝宝石制成，可承受高达10-20 MPa的压力。电池连接到甲烷气瓶。其中两项研究使用液滴方法测试AFPs作为气体水合物抑制剂与商业动能水合物抑制剂（KHI）相比，如PVP7，11。Bruusgard等人7专注于抑制剂的形态学影响，发现含有I型AFPs的液滴在高驱动力下具有比没有抑制剂的树突状液滴表面更光滑的玻璃状表面。
Udegbunam等人11使用在先前研究10中开发的评估KHI的方法，该方法允许分析形态/生长机制，水合物 - 液体 - 蒸汽平衡温度/压力以及动力学作为温度的函数。Jung等人研究了CH 4 -CO2在形成CH4水合物壳8后用CO2淹没细胞的替代物。Chen等人观察到奥斯特瓦尔德成熟，水合物壳形成9。Espinoza等人研究了各种矿物基质上的CO2水合物壳12。液滴法是一种相对简单和廉价的方法，用于确定各种化合物和底物对天然气水合物的形态效应，并且由于体积小而需要少量添加剂。本文描述了一种使用不锈钢电池在水滴上形成这种水合物壳的方法，该电池具有蓝宝石窗口进行可视化，额定工作压力高达10 MPa。
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Protocol
1. 设计、验证和加工压力池。
- 设计细胞以允许直接可视化水滴形成的水合物。确保电池具有带透明蓝宝石窗口的主腔室和四个用于流体/气体入口、出口、灯和电线的端口（图1）。在工程设计软件中创建最终设计（附图S1）。
- 要检查压力池在工作高压下是否安全，请使用仿真软件进行有限元分析。
- 将工程设计软件中的全尺寸压力单元模型输入仿真软件。
- 将 400 GPa 的杨氏模量和 0.29 的泊松比分配给蓝宝石窗口。
- 对于所有不锈钢零件，请指定杨氏模量为 190 GPa 且泊松比为 0.27 的不锈钢 316。
- 以分步方式，将0至1，2，3，4 5，6，7，8，9和10 MPa气压施加到电池内部（补充视频S1 和 补充视频S2）。通过忽略控制方程中的时间相关项，将每个加载步骤视为静态问题，并仅考虑加压过程中的弹性变形。
- 使用仿真软件中的直接线性方程求解器计算电池在各种压力条件下的应力分布和变形（补充表S1和补充表S2）。
- 一旦压力单元设计被验证为安全，就可以根据工程设计软件蓝图加工所有零件。
2. 组装压力池（图1）。
- 用水管工的胶带将四根国家管锥形（NPT）螺纹拧入压力单元上的相应端口。
- 使用蓝图设计（补充图 S1，C、D和 E 部分）组装照明端口，并连接到左上角的 NPT 螺钉。
- 使用分支三通接头和端口连接器接头将压力传感器连接到顶部端口 NPT。
- 使用端口连接器配件连接左侧 NPT 螺钉中的进气针阀。
- 将压力密封连接器安装到压力传感器的右侧端口中。通过压力密封连接器插入三根K型热电偶线，电池内部有3"的松弛度，电池外部有3'的松弛度。
- 用砂纸抛光载物台表面（附图S1，F部分）。
- 将热电偶插入载物台的相应孔中，以便尖端与载物台顶部齐平。在每个孔中使用一小滴胶水将热电偶固定到位并使其干燥。
- 将亚克力圆盘安装在压力池的后壁上，以增强光反射。将载物台安装在压力池中。
- 安装蓝宝石窗口。
- 将真空润滑脂涂在两个静态密封 O 形圈（一个 1" 和一个 1-1/5"）上。将O形圈安装到压力传感器上窗孔周围的凹槽中。
- 插入蓝宝石色窗口。用2-1/4英寸橡胶垫圈盖住蓝宝石窗口，并使用八个M8不锈钢螺钉（图2C）在不锈钢垫圈（附图S1，B部分）上拧紧。
3. 将设备组装在大型通风橱中（图2）。
注意：由于甲烷是压力下的易燃气体，因此请保持所有与甲烷相关的管道和容器远离热量，火花，明火和热表面。将所有设备设置在通风良好的区域（例如通风橱）内。在使用甲烷气体之前，请戴上安全眼镜和实验室外套。
- 小心地将压力泵提升到足够大的通风橱中，以便所有设备都适合（图2A）。将泵控制器放在泵底座的顶部。将泵控制器连接到泵，然后将其插入接线板。
- 从甲烷气瓶上的调节器到压力泵入口旁边的通风柜，运行高压额定1/4"铜管（图2A，B）。
- 将数据记录器放在压力泵旁边，然后将笔记本电脑设置在数据记录器上（图2A）。将两者插入接线板。通过数据记录仪 USB 将数据记录仪连接到笔记本电脑。
- 在笔记本电脑上，安装适当的软件来控制压力传感器上的数据记录仪、摄像头和压力传感器。
- 将水族箱放在数据记录器旁边，并在水族箱底部放置非浸出垫，以限制压力池的振动（图2C）。
- 使用新的1/4"铜管，将铜管盘绕成椭圆形以适合水族箱，为压力池内部留出空间（图2D）。确保线圈不会堵塞压力池中的蓝宝石窗口。抬高水族箱中的压力池以查看蓝宝石窗口。
- 将循环冷却器放在靠近通风橱的地板上（图2A）。用50/50 v/v乙二醇/水填充冷却器。
注意：由于乙二醇具有危险性，因此在倾倒时应穿着适当的安全着装，包括手套、实验室外套和护目镜。 - 切割两个长度的 3/8"（内径）塑料管，将冷却器入口和出口连接到水族箱中的铜管端。在切割之前，确保有足够的松弛度使泡沫管道绝缘材料适合。
- 将塑料管滑过泡沫管绝缘层。
- 将绝缘塑料管从循环冷却器上的入口和出口连接到水族箱内铜线圈的末端。通过将水管工的胶带缠绕在金属部件上并用蜗杆驱动软管夹紧连接来固定密封件。打开冷却器并将其设置为高速循环。确保没有泄漏。
- 在水族箱内的铜线圈/塑料管接头周围涂上水下密封剂。让密封剂固化。用胶带包裹密封剂。
- 安装压力泵管（图2E）。
注意：在使用工具之前，请务必手动拧紧连接，切勿用水管工的胶带拆下NPT连接，因为它们不会很好地重新密封。- 在压力泵的两侧安装一根1/8"不锈钢管，并使用水管工胶带与泵附带的公司配件一起安装（图2F）。
- 使用弯管机，将 1/8" 管向前弯曲 90° 角，距离泵约 2"，以避免在连接处弯曲。
- 使用弯管机，将 1/8" 管子向下弯曲 90° 角，距离第一个弯道约 2"。
- 将1/8"到1/4"适配器接头连接到两侧的1/8"管道（图2G）。
- 将 1/4" 管连接到两侧的适配器接头。
注：要将阀门固定在泵的侧面，请修剪1/4"管，使连接的阀门位于两个螺钉孔旁边。 - 安装1/4"针阀（图2H）。如果将阀门固定在压力泵上，则加工钢板或塑料板，钢板带有两个1/16"螺钉孔和一个1/2"孔，用于固定针阀连接之间。将板插入阀门连接之间，并将板拧到泵的侧面。
注意：确保针阀上的箭头指向从高压（压力泵内部）到低压（压力泵外部）。 - 将 1/4" 编织不锈钢柔性额定压力软管的一端连接到压力泵上的出口阀，另一端连接到压力传感器的侧阀。
- 使用数据记录器多通道将热电偶从压力池连接到数据记录器通道。连接一根额外的热电偶线来测量罐溶液的温度，并将另一端放入罐中。
- 将压力传感器上的压力传感器连接到笔记本电脑。
- 将压力池设置在靠近前部的水箱内，以获得更清晰的成像。
- 为了隔热水族箱，用箔衬里的玻璃纤维包裹水族箱的外部，并带有孔/狭缝，供相机查看压力池的蓝宝石窗口。用绝缘材料覆盖水族箱的顶部，以防止实验过程中蒸发。
注意：避免紧紧密封水族箱顶部，以避免光源产生的热量积聚。 - 为了防止水族箱正面潮湿空气的冷凝，请将塑料管从最近的空气阀运行到水族箱前部，相机将指向该位置，以便在照片中看不到管子。
- 将光源单元放在水族箱旁边，然后将其插入接线板。
- 将相机放在水族箱前，镜头指向蓝宝石窗口。将照相机插入笔记本电脑和接线板。
- 从罩表面抬起所有电子设备，以防止潜在的泄漏损坏。仔细检查电源是否已分配到插座的电源容量。
4. 用水对压力池进行泄漏测试。
注：为确保所有连接都正确密封，请在压力传感器重新组装时用水进行泄漏测试，尤其是在断开 NPT 螺钉后。在卸下蓝宝石窗或顶部阀门后，这不是必需的。水在压力下比气体更安全。
- 打开笔记本电脑上的压力传感器软件，以1秒的扫描间隔开始收集数据。
- 打开压力泵和控制器。按 压力泵 控制器上的泵 A 以监控压力。
- 如果泵中有压力，请在泵入口和出口阀仍然关闭的情况下，通过按压力泵控制器上的 Refill 来降低压力。
- 当两个压力单元阀都打开时，将泵出口阀稍微打开~1/16"，以缓慢释放剩余压力。
- 如果已连接，请断开 1/4" 铜管与压力泵上的进气阀的连接。
- 使用螺母和套圈将 1/4" 柔性管连接到泵进气阀。将管子的末端放入一加仑水中。
- 关闭泵的出口阀，打开泵的进气阀。
- 按压力泵控制器上的 "重新填充 "，使泵活塞充满水。
- 将压力池设置在水族箱外的浅空容器中。
- 将空气从压力池中吹出，直到水从顶部端口流出并完全充满压力池。
- 关闭泵的进气阀，打开泵的出水阀。
- 确保压力传感器上的阀门仍然打开。
- 将 最大（最大）流量 设置为 100 mL/min： 在压力泵控制器上，按 "极限";按 3 表示最大流量;按 1 设置最大流量;打入 100;按 回车键 。
- 按 D 键到达上一页。
- 将恒定流量设置为100 mL/min：在压力泵控制器上，按 Const Flow;按 A 表示流速;打入 100;按 回车键 。按 运行。
- 如果水没有流出或活塞中的体积不足，请通过关闭泵出口阀，打开带有水管的泵入口阀，然后按 "重新填充"来再次填充活塞。然后，通过关闭泵入口阀，打开泵出口阀，将流量设置为 100，然后按 Run键，将空气吹出。
- 一旦水从压力传感器的顶部端口流出，检查泄漏并拧紧任何泄漏连接。按 停止。关闭压力传感器出口（顶部）阀。
- 对压力池加压。
注意：在给压力池加压之前戴上安全眼镜。- 将最大流量限制设置为10 mL/min，以防止电池快速加压：在压力泵控制器上，按 极限;按 3 表示最大流量;按 1 设置最大流量;打入 10;按 回车键 。
- 将电池加压至100 kPa：在压力泵控制器上，按 Const Press;按 A;打入 100;按 回车键 。按 运行。
- 检查是否有泄漏。如果有泄漏，请按泵控制器上的 "停止 "，拧紧泄漏组件，按 "运行"，然后重复此步骤，直到 100 kPa 时没有泄漏。通过关闭泵出口阀并在压力传感器软件中监控压力传感器的压力，确保没有泄漏。
注意：如果压力持续下降并且由于室温变化而不是正常波动，则存在泄漏。 - 以 50 kPa 的增量将压力从 100 kPa 增加到 500 kPa，然后以 100 kPa 的增量从 500 kPa 增加到 1，000 kPa，最后以 ~1，000 kPa 的增量从 1，000 kPa 增加到 ~10，000 kPa。为此，请像以前一样更改 Const Press 设置。在压力设置之间，关闭泵出口阀并像以前一样监控电池的压力，以确保压力恒定。如果压力下降，请小心拧紧泄漏的组件。
- 达到10，000 kPa后，关闭泵出口阀，并根据压力传感器观察压力传感器保持压力的程度。由于压力持续下降表明存在泄漏，因此在较低压力（~1，000 kPa）下拧紧连接。
- 要减压，请打开泵出口阀并将压力设置为100 kPa。一旦压力稳定，稍微打开压力池出口阀。
- 要从压力泵中除去水，请关闭泵入口阀，将最大流量和 康斯特流量 设置更改为 100 mL/min，然后按 "运行" 直到泵为空。
- 断开 1/4" 柔性管道与泵入口的连接。断开编织不锈钢软管与压力传感器的连接。打开两个阀门并排干水。取下蓝宝石窗口，使细胞完全干燥。
5.在液滴表面形成甲烷水合物壳。
- 准备设备。
- 使用新的螺母和套圈套件，使用 1/4" 铜管将甲烷钢瓶调节器连接到泵。确保气瓶已关闭。
- 练习液滴插入技术。
- 粘上柔性尖端，如静脉输液管，以一定角度切到套管末端，以帮助将液滴引导至蓝宝石窗口。将1 mL注射器连接到插管上，并拉入所需体积的去离子水（〜50-300μL）。如果没有连接针阀或蓝宝石窗口，请将套管的末端插入顶部端口，然后练习将液滴排出到中心舞台上。练习液滴插入后，取出液滴并干燥载物台。
注意：在该协议中，将250μL去离子水带入注射器中。
- 粘上柔性尖端，如静脉输液管，以一定角度切到套管末端，以帮助将液滴引导至蓝宝石窗口。将1 mL注射器连接到插管上，并拉入所需体积的去离子水（〜50-300μL）。如果没有连接针阀或蓝宝石窗口，请将套管的末端插入顶部端口，然后练习将液滴排出到中心舞台上。练习液滴插入后，取出液滴并干燥载物台。
- 用 M8 螺钉重新连接蓝宝石色车窗和垫圈。将编织不锈钢软管从压力泵连接到压力传感器，并仔细检查从气瓶到压力传感器的所有连接是否紧密。打开压力池入口阀（侧阀），并在水族箱中设置压力池。将光纤光源电缆插入压力单元照明端口。
- 将50/50乙醇/水（v / v）添加到水族箱中，直到它与压力池的顶部水平，就在光源连接的正下方。确保罩流已打开。当溶液水平下降，在接下来的几周内进行未来试验之前，添加更多的乙醇。每月更换解决方案。
- 将冷却器设置为在电池内达到~0°C至3°C的温度（~-4°C），并开始通过盘管循环。打开水族箱前部的气流，以防止水族箱表面结露。
- 在数据记录仪软件中启动温度日志。将扫描间隔设置为 30 秒。等到压力池内的温度稳定在2°C（~6-24小时）。
- 使用笔记本电脑上的相机视图将水滴添加到压力池中。
- 将光源打开至~80%。打开相机软件。在实时取景中，将相机镜头对焦于细胞的内腔。调整光源以获得最佳成像效果。
- 以 1 秒的扫描间隔启动新的温度日志。
- 如果已连接，请卸下压力传感器顶部端口中的出口针阀。将1 mL注射器连接到插管上，并拉入所需体积的去离子水（〜50-300μL）。
注意：在该协议中，将250μL去离子水拉入注射器中。 - 将插管插入顶部端口，直到在实时取景模式下，在相机软件中可以看到尖端。将液滴从注射器中排出到中央热电偶上。重新连接针阀。
- 将相机聚焦在压力池中的液滴上。每 ~60 秒开始一次延时成像。
- 打开笔记本电脑上的压力传感器软件，以1秒的扫描间隔（与温度扫描间隔相同）开始收集图表和数据记录上的数据。等到液滴温度稳定在0-3°C之间。
- 将压力传感器加压至所需压力。
注意：在给电池加压之前戴上安全眼镜。- 打开泵和控制器。关闭压力泵的进气阀。
- 打开泵的出口阀和压力单元的阀门。
注意：压力池入口阀应始终打开。 - 通过按压力泵控制器上的 零 来去除泵的压力。在压力泵控制器上选择泵 A 以监视压力。
- 如果泵中存在除甲烷气体以外的其他流体，请确保压力泵是空的。为此，请将最大流量和 Const 流量 设置为 100 mL/min， 然后按 "运行"。让它保持运行，直到泵空了。关闭泵出口阀，打开泵入口阀。
- 打开气瓶并将气瓶调节器设置为 1，000 kPa。
- 按压力泵控制器上的 "重新填充"。 当泵充满且接近 1，000 kPa 时，关闭泵入口阀和气瓶。
- 微微打开（~1/16"转）泵出口阀到电池。在压力传感器软件中监控压力池压力，因为压力传感器中的温度相对较低，压力可能会降低。
- 将最大流量设置为 10 mL/min：在压力泵控制器上，按 限制;按 3 表示最大流量;按 1 设置最大流量;打入 10;按 回车键 。
- 将最大压力设置为 5，000 kPa：在压力泵控制器上，按 极限;按 1;打孔 5000;按 回车键 。
- 将恒压设置为 1，000 kPa：在压力泵控制器上，按 康斯特压榨机;按 A;打入 1000;按 回车键 。按 运行。
- 当达到 1，000 kPa 时，按泵控制器上的 "停止" 键并关闭泵的出口阀。监测压力池中的压力，以确保没有泄漏。如果压力下降，请使用液体检漏仪查找连接处的泄漏，并小心地拧紧泄漏组件。
- 如果电池稳定，请打开泵出口并将 Const Press 设置为 2，000 kPa。按 停止 并监视。如果稳定在 2，000 kPa，请将 Const Press 设置为 3，000 kPa。按 停止 并监视。如果稳定在 3，000 kPa，请将 Const Press 设置为 4，000 kPa。按 停止 并监视。如果稳定在 4，000 kPa，请将 Const Press 设置为 5，000 kPa。按 停止 并监视。
- 如果压力稳定，请关闭泵出口。
注：如果泵的容积用完，请关闭泵出口并稍微打开泵入口。慢慢打开气瓶，将气体调节器设置为1，000 kPa。按泵控制器上的 "重新填充"。 当泵重新加注时，关闭气瓶和泵入口。对泵加压以匹配压力池压力。 - 等待约12-24小时，让气体渗透到液滴中。
- 使用干冰使水合物壳成核。
- 将延时摄影切换为每 2-5 秒拍摄一次图像。
- 将干冰添加到细胞的顶部，直到在延时中看到水合物壳。如果干冰滑动，请在细胞顶部贴上胶带。
- 通过延时摄影观察甲烷水合物形成的进展约2-6小时。
- 通过打开泵出口并将 Const Press 设置为2，000 kPa，将电池减压至2，000 kPa。熔化发生时要注意。
注意：由于溶解气体的逸出，可能会发生无柄液滴中的气泡。 - 约30分钟后，将压力池再压至5，000 kPa以观察记忆效应。注意水合物壳何时开始改革。让壳形成约30分钟至2小时。
- 通过打开泵出口并将 Const Press 设置为0 kPa来减压电池。如果压力池中存在残余压力，请稍微打开压力池顶部阀门约1/16"。
- 将压力和温度数据保存为.csv文件。
- 通过像以前一样取出顶部压力细胞阀并用注射器/套管/IV管抽取液滴来去除液滴。如果试验之间担心污染，请取下蓝宝石窗口并消毒载物台并更换真空润滑脂。一旦压力池升温至室温，使用吸盘取出蓝宝石窗。
6. 分析数据。
- 打开温度和压力.csv文件。
- 制作新的电子表格。将压力.csv时间和压力列以及温度.csv文件中的时间和温度复制到新的电子表格中。
- 在x轴上绘制时间散点图，在温度和压力下绘制两个y轴散点图（补充图S2）。
- 再为水合物稳定性曲线制作两列。在第一列中，以 0.1 K 的间隔输入从 273.15 K 到 ~279.15 K 的温度。在第二列中，使用仕龙和 Koh 13 的公式（1）计算压力。
P [kPa] = exp（a+b/T [K]）， 其中 a = 38.98 且 b = -8533.80 （1） - 创建水合物稳定性边界的散点图，温度 （K） 在 x 轴上，压力 （kPa） 在 y 轴上。在散点图上添加第二个系列，分别在x轴和y轴上具有实验温度和压力（图4）。
- 请注意，根据延时成像，水合物壳变得可见的图表。
7.维护设备。
- 在每次试验之前，用乙醇填充罐溶液，以取代蒸发的乙醇。每月完全更换罐溶液。
- 定期使用每2个月更换一次O形圈和橡胶垫圈。
- 如果发生持续泄漏，而拧紧未修复，请更换端口连接。
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Representative Results
使用这种方法，可以通过压力池的蓝宝石窗口以及温度和压力传感器直观地监测液滴上的气体水合物壳。为了在加压至5 MPa后使水合物壳成核，可以将干冰添加到压力池的顶部以诱导热冲击以触发快速水合物结晶。干冰强制水合物壳形成时存在明显的形态差异。水滴从光滑的反射表面（图3A）过渡到具有轻微树突表面的不透明水合物壳（图3B）。添加100μgmL-1 I型AFP通过诱导沿着液滴顶部的脊状边缘和突起来改变水合物形态（图3C，D）。
水合物壳发育约1小时后，将细胞减压至2 MPa（补充视频S3）。在减压过程中，由于放热水合物解离，P/T稳定性曲线13（图4）附近的温度下降了0.2°C至0.5°C。水合物解离是通过温度下降开始时通过延时成像的视觉融化来确认的，如图4中的恒星所示。在完全水合物解离后，我们用"记忆效应"14重新压压细胞以观察形态和融化温度，在系统中已经形成水合物后水合物形成更快的现象（补充视频S4）。在重新加压时，水合物壳在达到5 MPa后的几分钟内重新形成，并且在解离过程中观察到在稳定性曲线处相同的温度下降。
阴性对照没有液滴，液滴没有形成水合物壳（图4，试验4和5）显示减压期间温度没有降低。在减压低于2 MPa时，我们观察到快速脱气引起的液滴内气体冒泡。由于每次温度下降的顶点高于先前建立的P/ T稳定性曲线13（ 图4中的水合物稳定性曲线 #1），因此根据这些试验的顶点P / T（P [kPa] = EXP（38.98 + -8533.8 / T [K]），水合物稳定性曲线 #2（图4中的水合物稳定性曲线#2）计算回归曲线。
图1：压力池。 通过移除蓝宝石窗口和覆盖的橡胶和钢垫圈，可以显示液滴所在的阶段和嵌入的热电偶。所有零件和连接都已标记。 左上角插图：从上方显示载物台，中央和侧载物台嵌入热电偶。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：甲烷水合物实验装置（A）实验装置所在的通风橱。（B） 气瓶通过铜线圈连接到压力泵。从面板（A）突出显示的是（C）组装的压力单元，（D）没有绝缘或溶液的10加仑（37.85升）罐，（E）压力泵和（F，G，H）加压泵连接的放大图像。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：甲烷水合物壳。在（A）之前和之后（B）形成的液滴的代表性图像在去离子水滴上形成甲烷水合物壳，在（C）之前和之后（D）在含有100μgmL-1 I型防冻蛋白的液滴上形成水合物壳。比例尺 = 5 mm。请单击此处查看此图的放大版本。
图4：压力-温度稳定性图。 减压过程中的压力和温度数据以甲烷水合物的P / T稳定性曲线显示（来自Sloan和Koh 2007的#1 13 和#2，通过从本研究中的水合物融化峰值的回归曲线计算）。在DI水滴上成功形成水合物壳的试验是试验1，2和3。试验4为阴性对照，舞台上没有飞沫。试验5中的液滴是另一种阴性对照，其中没有形成水合物壳。星星表示在减压期间视觉水合物融化开始的时间。试验1的分辨率为30秒（每30秒一个数据点）;其他试验的分辨率为1 s.缩写：T =试验;M.E.=记忆效应;P/T = 压力-温度;DI = 去离子;res = 分辨率。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充图S1：用于加工压力传感器的CAD图像。 压力传感器的零件 A-F 标有其零件字母和尺寸。缩写：CAD = 计算机辅助设计。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：试验2 - 4随时间变化的压力和温度数据。试验2和3是形成水合物壳的常规去离子水滴。试验4为阴性对照，无飞沫。试验在第一次减压时排成一行，该减压发生在零时间。由于气体与压力泵混合，在减压开始时会发生小幅温度下降。由于水合物在初始压降后融化，温度下降较大，如试验2和3所示。试验4结束时的温度波动是由于阀门的打开导致完全减压，这也发生在试验2和试验3结束时。请点击此处下载此文件。
补充表S1：机加工压力池的允许应力（MPa）。 缩写：FS = 安全系数。 请点击此处下载此表格。
补充表S2：机加工压力池的安全系数。 缩写：FS = 安全系数。 请点击此处下载此表格。
补充视频S1：应变。 机加工压力传感器上的应变模拟视频。 请点击此处下载此视频。
补充视频S2：压力。 机加工压力传感器上的应力模拟视频。 请点击此处下载此视频。
补充视频S3：水合物壳解离试验3。 以25倍速度解离水合物壳的延时视频。 请点击此处下载此视频。
补充视频S4：记忆效应成核试验3。 以10倍速度从2 MPa再压到5 MPa后，通过记忆效应形成水合物壳的延时视频。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
我们开发了一种在无柄水滴上安全地形成甲烷水合物壳的方法，并将该方法共享到额定工作压力为10 MPa的压力池以及加压和冷却系统。压力传感器配有一个包含嵌入式热电偶的液滴台，一个用于可视化液滴的蓝宝石窗口，以及一个固定在电池顶部的压力传感器。冷却系统包括冷却的乙二醇，通过带有50%乙醇溶液的罐中的铜线圈循环，其中放置了压力池。压力泵将气体从气缸加压到压力池。水合物壳在温度迅速下降时形成，在压力池的顶部加入干冰。我们允许壳形成2小时，在此期间，我们相信气体通过水合物壳的随机开裂渗透，并且Ostwald在更长的时间内成熟。事实上，这个装置可以用来研究这些现象。
该协议的关键步骤包括：1）在用水加压之前用水对压力池进行泄漏测试，2）在插入蓝宝石窗口之前练习将水滴添加到载物台上，3）在加压前冷却液滴以稳定在〜2°C，4）以1 MPa为增量的最大流速加压，最小值为1 mL-1 至5 MPa， 5）关闭压力泵（到电池）上的出口阀，以限制与压力泵的气体交换，6）设置温度，压力和延时软件分别记录每1秒，1秒和5秒（或更少），然后添加干冰，7）将干冰连续施加到电池顶部，直到在延时过程中观察到水合物壳， 8）让水合物壳形成至少1小时，9）以与加压相同的速度减压。
在方法开发过程中，我们优化了变量和技术，包括冷却、加压、减压、液滴大小和液滴插入技术的时间。使用此方法存在一些限制。一个限制是液滴成像的分辨率，这是由于相机分辨率和相机与液滴之间的材料（罐，乙醇溶液，厚蓝宝石窗口）。此外，虽然其他研究在微观尺度7，9，10上观察表面液滴，但这种方法只允许宏观尺度的观察。如果对微观观察感兴趣，可以安装显微镜镜头附件。
这种方法的另一个限制是无法精确测量水合物壳厚度。然而，水合物厚度可以通过减去水合物形成前后的横截面积并使用减压过程中的温度变化计算气体消耗量来确定形成的水合物体积来估计。另一个限制是无法以3D形式查看该液滴，因为压力池只有一侧包含蓝宝石窗口。相比之下，其他研究使用完全由蓝宝石制成的细胞从多个角度观察液滴7。我们也没有安装温度控制阶段10 或光谱技术;但是，这些当然可以使用此设置进行安装。
使用该方法，可以使用含有添加剂的液滴或替代阶段底物来观察水合物解离过程中的形态，解离压力和温度以及温度的变化。这种方法相对便宜，并且很少有用于形成气体水合物壳的彻底方案。由于高压系统可能很危险，因此我们提供了用于加压和泄漏测试的安全提示。此外，许多设置不允许可视化天然气水合物的形成，或者在更小或更大的尺度上这样做。实验室实验是了解天然存在的天然气水合物和可能导致致命气体管道爆炸的天然气水合物的主要贡献者。该方法可用于快速评估添加剂对解离温度和形态的影响以及添加剂消除记忆效应的能力。有效的添加剂可用作天然气管道中的抑制剂或研究深海细菌蛋白的生物活性6、15。
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Disclosures
没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
NASA外星生物学拨款80NSSC19K0477资助了这项研究。我们感谢威廉·韦特和尼古拉斯·埃斯皮诺萨的宝贵讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAMERA AND LAPTOP | |||
| Camera Body | Nikon | D7200 | Name in Protocol: camera |
| Camera Control Pro 2 Software | Nikon | Name in Protocol: camera software | |
| Laptop | HP Pavilion | hp-pavilion-laptop-14-ce0068st | Needs to be PC with plenty of storage (~ 1 Tb) Name in Protocol: laptop |
| Macrophotography Lens | Nikon | AF-S MICRO 105mm f/2.8G IF-ED Lens | Name in Protocol: lens |
| CONSUMABLES | |||
| Deionized water | Name in Protocol: DI water | ||
| Dry Ice | VWR or grocery store | Buy just before nucleation Name in Protocol: dry ice |
|
| Ethanol | Name in Protocol: ethanol | ||
| Ethylene Glycol | Name in Protocol: ethylene glycol | ||
| COOLING SYSTEM | |||
| 1/2 in. O.D. x 3/8 in. I.D. x 25 ft. Polyethylene Tubing | Everbilt | Model # 301844 | For circulating coolant from chiller to copper coils in aquarium Name in Protocol: 3/8” (inner diameter) plastic tubing |
| Circulating chiller | Polyscience | Name in Protocol: chiller | |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K162 | 3/4" thick wall; 1/2" inner diameter; R Value 3; 6' long Name in Protocol: foam pipe insulation |
| Plastic tubing | use any tubing that fits the airline connection in the lab and long enough to travel from the airline connection to the front of the aquarium | ||
| DATALOGGER | |||
| Armature Multiplexer Module for 34970A/ 34972A, 20-Channel |
Keysight Technologies | 34901A | Name in Protocol: datalogger multichannel |
| Benchvue or Benchlink software | Benchvue or Benchlink | Name in Protocol: temperature transducer software | |
| Data Acquisition/Switch Unit. GPIB, RS232 | Keysight Technologies | 34970A | Name in Protocol: datalogger |
| USB/GPIB interface | Keysight Technologies | 82357B | Name in Protocol: datalogger USB |
| datalogger multichannel | |||
| Schott Fostec -Llc 20510 Ace Fiber Optic Light Source | Schott Fostec | A20500 | 3115PS-12W-B20 115 V ~AC 50/60Hz 5/4.5 W Name in Protocol: light source unit |
| Schott Fostec light source guide - single bundle | Schott Fostec | A08031.40 | Name in Protocol: fiber optic light source cable |
| METHANE GAS AND REGULATOR | |||
| 1/4 OD in. x 20 ft. Copper Soft Refrigeration Coil | Everbilt | Model # D 04020PS | For pressurizing ISCO pressure pump. An additional pack is needed for coolant circulation, as listed below. Name in Protocol: high pressure-rated 1/4” copper pipe |
| Methane cylinder regulator | Airgas | Y11N114G350-AG | Name in Protocol: methane cylinder regulator |
| Methane gas cylinder | Airgas | ME UHP300 | Name in Protocol: methane gas cylinder |
| PRESSURE PUMP | |||
| 1/4 in. flexible tubing, ~ 3 ft. | Connect to pump inlet for leak test Name in Protocol: 1/4" flexible tubing |
||
| 260D Syringe Pump W/Controller | Teledyne Instruments Inc. | 67-1240-520 | Name in Protocol: pressure pump |
| Controller − Ethernet/USB | Teledyne Instruments Inc. | 62-1240-114 | Purchase if you would like to install Labview onto computer and control pressure pump remotely. We did not do this. |
| Smooth-Bore Seamless 316 Stainless Steel Tubing, 1/4" OD, 0.035" Wall Thickness, 1 Foot Long (x5) | McMaster-Carr | 89785K824 | Name in Protocol: 1/4" pipe |
| Smooth-Bore Seamless 316 Stainless Steel Tubing, 1/8" OD, 0.02" Wall Thickness, 1 Foot Long (x4) | McMaster-Carr | 89785K811 | Name in Protocol: 1/8" pipe |
| Stainless Steel Swagelok Tube Fitting, Reducing Union, 1/4 in. x 1/8 in. Tube OD (x4) | Swagelok | SS-400-6-2 | Name in Protocol: 1/8” to 1/4” adapter |
| PRESSURE CELL | |||
| 316 Stainless Steel Nut and Ferrule Set (1 Nut/1 Front Ferrule/1 Back Ferrule) for 1/4 in. Tube Fitting (20) | Swagelok | SS-400-NFSET | Used for fitting connections where necessary Name in Protocol: ferrule set |
| 316L Stainless Steel Convoluted (FM) Hose, 1/4 in., 316L Stainless Steel Braid, 1/4 in. Tube Adapters, 60 in. (1.5 m) Length | Swagelok | SS-FM4TA4TA4-60 | Connects pressure pump to pressure cell Name in Protocol: 1/4" braided stainless steel flexible pressure-rated hose |
| ABAQUS | ABAQUS FEA | Name in Protocol: simulation software | |
| Abrasion-Resistant Cushioning Washer for 7/8" Screw Size, 0.875" ID, 2.25" OD, packs of 10 (x1) | McMaster-Carr | 90131A107 | Name in Protocol: 2.25" rubber washer |
| Abrasion-Resistant Sealing Washer, Aramid Fabric/Buna-N Rubber, 3/8" Screw Size, 0.625" OD, packs of 10 (x1) | McMaster-Carr | 93303A105 | Used for illumination port |
| Acrylic Sheet | White 2447 / WRT31 Extruded Paper-Masked (Translucent 55% (0.118 x 12 x 12) |
Interstate Plastics | ACRW7EPSH | Machine a circle of acrylic to fit in the inner chamber of the pressure cell to serve as the background for imaging Name in Protocol: acrylic disc |
| AutoCAD | AutoCAD | Name in Protocol: engineering design software | |
| Conax fitting | Conax Technologies | 311401-011 | TG(PTM2/)-24-A6-T, OPTIONAL 1/4" NPT Name in Protocol: pressure seal connector |
| High Accuracy Oil Filled Pressure Transducers/Transmitters for General industrial applications (x2) |
Omega Engineering, Inc. | PX409-3.5KGUSBH | Buy two so there is a backup. Name in Protocol: pressure transducer |
| HIGH PRESSURE CHAMBER PARTS | Wither Tool, Die and Manufacturing Company | Machining for pressure cell parts as listed in CAD drawings (Figure S1) Name in Protocol: Part B = stainless steel washer |
|
| High-Strength 316 Stainless Steel Socket Head Screw, M5 x 0.80 mm Thread, 14 mm Long (x20) | McMaster-Carr | 90037A119 | Used for illumination port |
| High-Strength 316 Stainless Steel Socket Head Screw, M8 x 1.25 mm Thread, 25 mm Long (x20) | McMaster-Carr | 90037A133 | Name in Protocol: M8 stainless steel screws |
| Oil-Resistant Hard Buna-N O-Ring, 3/32 Fractional Width, Dash Number 120, packs of 50 (x1) | McMaster-Carr | 5308T178 | Name in Protocol: 1" o-ring |
| Oil-Resistant Hard Buna-N O-Ring, 3/32 Fractional Width, Dash Number 128, packs of 50 (x1) | McMaster-Carr | 5308T186 | Name in Protocol: 1.5" o-ring |
| Omega Inc. pressure transducer software | Omega Engineering, Inc. | Name in Protocol: pressure transducer software | |
| Polycarbonate Disc | McMaster-Carr | 8571K31 | Listed in CAD drawings for illumination port, Fig. S1 Part E |
| Sapphire windows (x3) | Guild Optical Associates, Inc. | Optical Grade Sapphire Window, C-Plane Diameter: 1.811” ±.005” Thickness: .590” ±.005” Surface Quality: 60/40 Edges ground and safety chamfered |
Buy three so there are two backups. Name in Protocol: sapphire window |
| Solid Thermocouple Wire FEP Insulation and Jacket, Type K, 24 Gauge, 50 ft. Length (x1) | McMaster-Carr | 3870K32 | Name in Protocol: thermocouples |
| Stainless Steel Integral Bonnet Needle Valve, 0.37 Cv, 1/4 in. Swagelok Tube Fitting, Regulating Stem (x4) | Swagelok | SS-1RS4 | Two will be used for the pressure pump as well. Name in Protocol: 1/4" needle valves |
| Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Nipple, 1/4 in. Male NPT (x2) | Swagelok | SS-4-HN | Used for illumination port |
| Stainless Steel Swagelok Tube Fitting, Female Branch Tee, 1/4 in. Tube OD x 1/4 in. Tube OD x 1/4 in. Female NPT (x2) | Swagelok | SS-400-3-4TTF | Used with pressure transducer Name in Protocol: branch tee fitting |
| Stainless Steel Swagelok Tube Fitting, Male Connector, 1/4 in. Tube OD x 1/4 in. Male NPT (x4) | Swagelok | SS-400-1-4 | Used on top port and side port leading to needle valves Name in Protocol: NPT screws |
| Stainless Steel Swagelok Tube Fitting, Port Connector, 1/4 in. Tube OD (x8) | Swagelok | SS-401-PC | Use as tube connections between NTP and valve connections Name in Protocol: port connector fitting |
| TANK | |||
| 1/4 OD in. x 20 ft. Copper Soft Refrigeration Coil | Everbilt | Model # D 04020PS | For circulating coolant Name in Protocol: 1/4" copper pipe |
| 10 gallon aquarium | Tetra | Name in Protocol: 10 gallon tank | |
| 2 oz. Waterweld | J-B Weld | Model # 8277 | Name in Protocol: underwater sealant |
| 3 in. x 25 ft. Foil Backed Fiberglass Pipe Wrap Insulation | Frost King | Model # SP42X/16 | For wrapping around aquarium Name in Protocol: foil-lined fiberglass |
| 3/8 7/8 in. Stainless Steel Hose Clamp (10 pack) | Everbilt | Model # 670655E | Name in Protocol: worm drive hose clamps |
| Styrofoam | Name in Protocol: insulating material | ||
| TOOLS | |||
| 1-1/8 in. Ratcheting Tube Cutter | Husky | Model # 86-036-0111 | |
| 1/2 in. to 1 in. Pipe Cutter | Apollo | Model # 69PTKC001 | |
| Adjustable wrench (x2) | Steel Core | Model # 31899 | Need two wrenches with jaw at least 1" |
| Allen wrench set | Home Depot | ||
| Duct tape | Name in Protocol: duct tape | ||
| Flexible tubing, like an IV line, to fit on the end of grainger probe (canula) | Name in Protocol: IV tube | ||
| Grainger 18 gauge probe | Grainger | For inserting droplet Name in Protocol: cannula |
|
| High Vacuum Grease | Dow corning | Apply to o-rings before inserting sapphire window Name in Protocol: vacuum grease |
|
| Klein Tools Professional 90 Degree 4-in-1 Tube Bender | Klein Tools | Model # 89030 | Name in Protocol: tube bender |
| Snoop liquid leak detector | Swagelok | MS-SNOOP-8OZ | To detect leaks when pressurized when methane Name in Protocol: liquid leak detector |
| Suction cup | Home Depot | For removing tight fitting sapphire window Name in Protocol: suction cup |
|
| Teflon Tape | Name in Protocol: plumber's tape | ||
| Temflex 3/4 in. x 60 ft. 1700 Electrical Tape Black | 3M | Model # 1700-1PK-BB40 | Name in Protocol: electrical tape |
References
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- Jung, J. W., Espinoza, D. N., Santamarina, J. C. Properties and phenomena relevant to CH4-CO2 replacement in hydrate-bearing sediments. Journal of Geophysical Research. 115 (10102), 1-16 (2010).
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