Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مفرط piggyBac Transposase بوساطة التحول Germline في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda

Published: September 23, 2021 doi: 10.3791/62714
Automatic Translation
1, 1
1Department of Entomology, College of Agriculture, Food and Environment, University of Kentucky

Summary

تم تحقيق التحول الجرثومي الناجح في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda، باستخدام مرنا من نقل piggyBac مفرط النشاط.

Abstract

إن الإدراج المستقر للشحن الجيني في جينوم الحشرات باستخدام عناصر قابلة للانتقال هو أداة قوية للدراسات الجينومية الوظيفية ووضع استراتيجيات إدارة الآفات الوراثية. العنصر الأكثر استخداما القابلة للتحويل في تحول الحشرات هو piggyBac، وقد تم إجراء تحويل الجرثومة المستندة إلى piggyBacبنجاح في الحشرات النموذجية. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب استخدام هذه التكنولوجيا في الحشرات غير النموذجية التي تشمل الآفات الزراعية. هذه الورقة تقارير عن التحول الجرثومي من الآفات الزراعية العالمية، ودودة الجيش الخريف (FAW)، Spodoptera frugiperda،وذلك باستخدام نقل piggyBac مفرط النشاط (hyPBase).

في هذا العمل، تم إنتاج الحمض النووي الريبي hyPBase واستخدامه بدلا من البلازميد المساعد في عمليات التجريب الدقيق للجنين. وأدى هذا التغيير إلى نجاح جيل من FAW المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، فإن أساليب فحص الحيوانات المعدلة وراثيا، والكشف السريع القائم على PCR من إدخال المتحولين جنسيا، وتحديد موقع التكامل القائم على PCR المتشابكة الحرارية (TAIL-PCR). وهكذا، تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنتاج FAW المعدلة وراثيا، والتي سوف تسهل نقل النسل piggyBacالقائم في FAW وغيرها من الحشرات lepidopteran.

Introduction

دودة الجيش الخريف (FAW), Spodoptera frugiperda, هو الأصلي إلى المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية في أمريكا. حاليا ، هذا هو عشب الحشرات المدمرة في أكثر من 100 دولة في جميع أنحاء العالم1. تتغذى يرقات FAW على أكثر من 350 مصنعا مضيفا ، بما في ذلك بعض المحاصيل الغذائية الأساسية الهامة2. قدرة الهجرة القوية للبالغين FAW يساهم في انتشاره السريع مؤخرا من الأمريكتين إلى أماكن أخرى1،2. ونتيجة لذلك ، تهدد هذه الحشرة الآن الأمن الغذائي على الصعيد الدولي. وقد ييسر تطبيق التكنولوجيات الجديدة إجراء دراسات متقدمة في FAW ويوفر استراتيجيات جديدة لإدارة هذه الآفة.

وقد استخدم التحول الجرثومي الحشري لدراسة وظيفة الجينات وتوليد الحشرات المعدلة وراثيا لاستخدامها في السيطرة الوراثية3،4. من بين الطرق المختلفة المستخدمة لتحقيق التحول الجيني في الحشرات ، فإن الطريقة المستندة إلى عنصر piggyBac هي الطريقة الأكثر استخداما5. ومع ذلك ، نظرا لانخفاض معدل النقل ، لا يزال من الصعب إجراء تولد في الحشرات غير النموذجية. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نسخة مفرطة النشاط من نقل piggyBac (hyPBase)6،7. تم تحقيق التحول Germline في FAW مؤخرا8، وهو أول تقرير يستخدم hyPBase في الحشرات lepidopteran. في هذا التقرير، يتم وصف معلومات مفصلة عن استخدام الحمض النووي الريبي hyPBase في توليد FAW المعدلة وراثيا. يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة هنا لتحقيق تحول الحشرات lepidopteran الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. في تركيب المختبر من الحمض النووي الريبي hyPBase

ملاحظة: تم توليف تسلسل الترميز الكامل لتسلسل hyPBase وإدراجه في ناقل pTD1-Cas9 (انظر جدول المواد)لإنتاج بناء pTD1-hyPBase ، والذي يحتوي على كاسيت التعبير عن hyPBase ، T7 المروج: polyhedrin-5 ' UTR: hyPBase: البوليهيدرين-3' UTR: بولي (A). يتم توفير التسلسل الكامل للبناء pTD1-hyPBase في المواد التكميلية.

  1. إعداد القالب لتركيب في المختبر
    1. أداء رد فعل PCR لتضخيم كاسيت التعبير عن hyPBase باستخدام التمهيدي إلى الأمام، 5'- atgcggtgtgaagacagcacagatgcg-3'، والتمهيدي العكسي 5'- tagaggccaggtgctag-3'، البوليمرات عالية الدقة، وpTD1-hyPBase plasmid كقالب.
      ملاحظة: يحتوي تفاعل PCR (الحجم النهائي 50 ميكرولتر) على 5.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل 10x، 4.0 ميكرولتر من 10 م ديوكسينوكليوسيد ثلاثي الفوسفات (dNTP)، 1.0 ميكرولتر من البلازميد (50 ميكروغرام/ميكرولتر)، 1.0 ميكرولتر من البوليميراز عالي الدقة، 1.0 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومترات إلى الأمام وعكس التمهيديات، و 33 ميكروغرام من المياه الخالية من النيوكليز. وكانت الإعدادات كما يلي: حضانة أولية من 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، و 60 درجة مئوية لمدة 15 s، و 68 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    2. تحقق من منتج PCR على هلام الآغاروز 1٪ في 120 V في الطازجة تريس خلات إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك (TAE) العازلة لمدة 30 دقيقة وتنقية المنتج مع عدة استخراج هلام.
      ملاحظة: لا تستخدم مجموعة تنقية المنتج PCR. حتى كمية ضئيلة من pTD1-hyPBase plasmid يقلل بشكل كبير من كفاءة التوليف في المختبر.
  2. في تركيب المختبر من الحمض النووي الريبي hyPBase باستخدام عدة تجارية
    1. إذابة الكواشف المجمدة تماما، والحفاظ على الإنزيم و2x NTP / CAP الحل على الجليد، وترك المذاب 10x رد فعل العازلة في درجة حرارة الغرفة.
    2. تجميع رد الفعل في درجة حرارة الغرفة بإضافة المكونات التالية: 2x NTP/CAP الحل: 10 ميكرولتر; 10x رد فعل العازلة: 2 ميكرولتر; الحمض النووي القالب: 0.1-0.2 ميكروغرام; مزيج الانزيم: 2 ميكرولتر; مياه خالية من النيوكليز إلى 20 ميكرولتر.
    3. خلط الكواشف جيدا عن طريق الأنابيب بلطف الخليط صعودا وهبوطا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة.
  3. استعادة مرنا توليفها من قبل كلوريد الليثيوم هطول الأمطار
    1. إضافة 30 ميكرولتر من محلول هطول الأمطار LiCl، مزيج جيدا عن طريق النقر على الأنبوب، ومن ثم تبقى في -20 درجة مئوية لمدة ≥ 30 دقيقة.
    2. جهاز الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة بأقصى سرعة، وإزالة supernatant بعناية.
    3. غسل بيليه مرة واحدة مع 1 مل من الإيثانول 70٪، وإعادة الطرد المركزي، وإزالة supernatant بعناية.
    4. جفف الكريات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة، ثم أعيد إنفاق بيليه مع 20-40 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز.
    5. تمييع 1 ميكرولتر من محلول مرنا مع 9 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز. خذ 2 ميكرولتر لتحديد تركيز مرنا واستخدام 8 ميكرولتر للتحقق من جودة مرنا على هلام الآغاروز 1٪ في 100 V في العازلة TAE الطازجة لمدة 40 دقيقة.
    6. Aliquot الحل مرنا وتخزين المجمدة في -70 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
      ملاحظة: لا تجف تماما بيليه مرنا; قد يكون من الصعب حله في الماء.

2. الميكرويكشن

  1. جمع البيض
    1. ضع 12 جروا ذكرا و12 جروة أنثى في صندوق 15 سم × 15 سم × 10 سم. غطي الصندوق بمنشفة ورقية. ضع محلول السكروز بنسبة 10٪ في الصندوق لإطعام البالغين.
    2. في اليوم 2 بعد انهيار، يعرض البالغين للضوء الشديد بين عشية وضحاها.
    3. في اليوم الثالث بعد الانفجار، قم بنقل البالغين من الخطوة 2.1.2 إلى مكان مظلم. جمع الأجنة في غضون 2 ساعة بعد oviposition.
    4. أضف قطرات من الماء إلى قطعة من منشفة ورقية مع البيض الطازج المحفوظة في طبق بيتري على الجليد. نقل البيض بلطف إلى شريحة زجاجية مع فرشاة ناعمة ومحاذاتها واحدا تلو الآخر على شريحة زجاجية. الحفاظ على الشرائح الزجاجية مع البيض المنحازة على الجليد قبل microinjection.
  2. إعداد الميكرويكشن
    1. حقن خليط من البروتين الفلوري الأخضر المحسن المعدلة وراثيا (EGFP) - التعبير عن البلازميد (200 نانوغرام / ميكرولتر) ، pBac: hr5ie1 - EGFP - SV40 ، hyPBase mRNA (200 نانوغرام / ميكرولتر) ، والماء المقطر العقيم في البيض ، وذلك باستخدام ضغط التعويض من microinjector الآلي (انظر جدول المواد).
    2. حافظي على البيض المحقون عند 27 ± 1 درجة مئوية، 60 ± رطوبة نسبية بنسبة 10٪ حتى الفقس.
    3. تغذية اليرقات فقست على نظام غذائي اصطناعي، ونقل كل يرقة إلى كوب واحد صغير في مرحلة 3 في وقت مبكرمن نجمة (~ 6 ملم في الطول، ولون الجسم يتحول الأسود).

3. فحص الفلورسينس وعبور الجينية

  1. جمع الخوادر ومكان ~ 150 أنثى الخوادر و ~ 150 جروا الذكور في قفص 35 سم × 35 سم × 35 سم. شنق عدة قطع من المناشف الورقية (~ 30 سم × 15 سم) في القفص لجمع البيض.
  2. جمع المناشف الورقية مع البيض يوميا، والحفاظ على البيض في 27 ± 1 درجة مئوية، 60 ± 10٪ الرطوبة النسبية حتى الفقس.
  3. احتفظ بيرقات الولدان عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لشل حركتها ، ثم نقلها إلى صفيحة باردة الجليد.
  4. فحص يرقات حديثي الولادة المشلول تحت منظار مجسم مفلور. حدد الأطفال حديثي الولادة الإيجابية EGFP، ورفعها إلى مرحلة pupal في ~ 2 أسابيع في 27 ± 1 درجة مئوية، وفصلها حسب الجنس وفقا للاختلافات النمط الظاهري في شرائح البطن البطني.
    ملاحظة: تحتوي الجراء الأنثوية على فتحة تناسلية تشبه الشق على الجزء الثامن من البطن والهوامش الدماغية للجزأين التاسع والعاشر المنحني نحو فتحة الأعضاء التناسلية. الفتحة التناسلية للجرو الذكر لديها ارتفاع طفيف على الجزء البطني التاسع.
  5. ضع الخوادر الإيجابية ل EGFP والجرو البري من الجنس الآخر في الذكور: نسبة الإناث من 1:1 في القفص. سيب عبر الكبار التعبير عن EGFP لإنتاج الأجيال التالية.

4. PCR الكشف عن الإدراج المعدلة وراثيا

  1. استخراج الحمض النووي الجينومي من النوع البري واليرقات الفردية الإيجابية EGFP باستخدام أي مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي التجاري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. إجراء تفاعل PCR باستخدام الحمض النووي الجينومي كقالب؛ التمهيدي إلى الأمام، 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3'يقع في منطقة المروج ie1؛ و التمهيدي العكسي، 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' الموجود في منطقة EGFP من متجه التحول.
  3. إعداد كل تفاعل PCR (الحجم النهائي من 40 ميكرولتر) لاحتواء 20 ميكرولتر من خليط البوليميراز، 1.0 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي (40 ميكروغرام/ ميكرولتر)، 1.0 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيديات، و 17 ميكروغرام من المياه الخالية من النيوكليز. استخدم الإعدادات التالية: حضانة أولية تبلغ 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 20 s، و 56 درجة مئوية لمدة 20 s، و 68 درجة مئوية لإعدادات 40 s.
  4. تحقق من منتجات PCR على هلام agarose 1٪ في 120 V لمدة 30 دقيقة.

5. تحديد موقع الإدراج المعدل وراثيا

  1. قم بإجراء TAIL-PCR عالي الكفاءة باستخدام الحمض النووي الجينومي كنموذج لتحديد موقع تكامل إدخال المتحولين جنسيا في الحشرات الإيجابية ل EGFP.
    1. تنفيذ ردود الفعل PCR باتباع الخطوات الموضحة في مكان آخر9.
      1. استخدام ثلاثة التمهيديات، P1: 5'-atcagtgacacttaccgcgacagcc-3'، P2: 5'-tcacgggagctccagcggcgactg-3'، وP3: 5'-atgtcctaagcgcgcgacggggcgct-3'، والتي هي محددة لنقل piggyBac، في 3 جولات من رد فعل PCR، على التوالي.
  2. تسلسل منتجات PCR النهائي لتحديد موقع التكامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بناء للتعبير عن المروج T7 التي تحتوي على hyPBase: بوليهيدرين-5'UTR: hyPBase: بوليهيدرين-3'UTR: بولي (A) تم إنشاءإشارة (الشكل 1A)وتضخيمها على أنها جزء PCR ~ 2.2 kb لتجميع الحمض النووي الريبي hyPBase في المختبر (الشكل 1B). ثم، تم إنتاج الحمض النووي الريبي hyPBase وتعرض لكهروفورسيس هلام agarose. تم الكشف عن مرنا من الحجم المتوقع (~ 1.1 كيلوبايت الفرقة) على هلام agarose 1٪ (الشكل 1C).

ثم، تم إعداد بناء التعبير EGFP piggyBac-علىأساس (الشكل 2A). تم حقن خليط من هذا الحمض النووي الريبي البلازميد وhyPBase ، أو محلول PBS ، في الأجنة في غضون 2 ساعة بعد oviposition. في 24 ساعة بعد الحقن، لوحظت إشارة عابرة للتعبير EGFP في الأجنة المحقونة. لم تظهر الأجنة التي حقنها برنامج تلفزيوني إشارة EGFP(الشكل 2B)،في حين أظهرت الأجنة التي تم حقنها من قبل EGFP و HYPBase mRNA مضان EGFP(الشكل 2C)،مما يشير إلى أن بناء piggyBac كان ناجحا. وهكذا، يمكن للمروج hr5ie1 تعمل خلال التطور الجنيني المبكر.

تم حقن ما يقرب من 2000 بيضة ، وتطورت حوالي 700 منها إلى جرو. كان البالغون في مجموعة العشرين يعبرون أنفسهم، وتم جمع البيض. تم فحص يرقات G1 التي فقست من هذه البيضات لإشارة EGFP تحت منظار مجسم مفلور. كما هو موضح في الشكل 3A، أظهرت اليرقات المعدلة وراثيا إشارة EGFP قوية. لاختبار إدخال كاسيت التعبير EGFP في جينوم الحشرات الإيجابية EGFP ، تم تضخيم جزء يحتوي على المروج وجزء EGFP باستخدام الحمض النووي الجينومي المعزول عن اليرقات الإيجابية EGFP كنموذج(الشكل 3B). لم يتم اكتشاف هذا الجزء عندما تم عزل الحمض النووي الجينومي من اليرقات البرية مثل القالب(الشكل 3B). من خلال إجراء عالية الكفاءة TAIL-PCR وتسلسل المنتجات PCR، تم تحديد موقع التكامل من إدراج المتحولين جنسيا. كما هو مبين في الشكل 4، فإن موقع التكامل transgene يكمن في 81st intron من الجين الشبيه Twinchin في الكروموسوم 26.

Figure 1
الشكل 1: إنتاج غشاء الرنا hyPBase. (أ) كاسيت التعبير عن hyPBase التي تحتوي على المروج T7: بوليهيدرين-5'UTR: hyPBase: بوليهيدرين-3'UTR: تم بناء إشارة بولي (A). (ب) تم تضخيم قالب الحمض النووي ~ 2.2 كيلوبايت لتجميع الحمض النووي الريبي hyPBase من بناء hyPBase. يظهر الممر الأيسر سلم 1 كيلوبايت يعمل على نفس الجل. (ج)تم تصنيعها ~ 1.1 كيلو بايت hyPBase مرنا من قالب الحمض النووي تضخيمها. يظهر الممر الأيسر سلم 1 كيلوبايت يعمل على نفس الجل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التعبير عن EGFP في الأجنة المحقونة. (أ) مخطط تخطيطي لنقل piggyBac المستخدم في هذه الدراسة. (ب)لم يتم الكشف عن أي إشارة EGFP في الأجنة حقن مع برنامج تلفزيوني 1x. (ج)تم الكشف عن إشارة EGFP في الأجنة حقن مع ناقل piggyBac وناقل hyPBase. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: EGFP = بروتين فلوري أخضر محسن وPBS = ملحي عازل بالفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توصيف FAW المعدلة وراثيا. (أ) التعبير EGFP في المعدلة وراثيا ولكن ليس في يرقات FAW البرية من نوع. أشرطة المقياس = 0.5 مم (B) تحليل PCR من الإدراج الجينومي للمتحولات. تم استخدام زوج من المبرمجين الذين يستهدفون مناطق المروج وEGFP لتضخيم جزء ~ 0.5 kb باستخدام الحمض النووي الجينومي المعزول عن يرقات FAW المعدلة وراثيا أو البرية كنموذج. الاختصارات: EGFP = البروتين الفلوري الأخضر المحسن وFAW = دودة الجيش الخريف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الإدراج الجينومي لبناء piggyBac. تم تحديد الإدراج الجينومي لبناء piggyBac في FAW المعدلة وراثيا من قبل TAIL-PCR والتسلسل. يتم عرض توطين الكروموسوم وتسلسلات الحمض النووي الجينومي الجزئية التي تحيط بحدود بناء piggyBac. الاختصارات: FAW = دودة الجيش الخريف وTAIL-PCR = PCR الحرارية المتشابكة غير المتماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المواد التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يحد المعدل المنخفض للتحويل وصعوبة توصيل المكونات المعدلة وراثيا إلى أجنة جديدة من نجاح التحول الجرثومي في العديد من الحشرات غير النموذجية ، وخاصة تلك الموجودة من أجل ، Lepidoptera. لزيادة معدل التحول الجرثومي، تم تطوير نسخة مفرطة النشاط من نقل piggyBac الأكثر استخداما (hyPBase)7،10. حتى الآن ، يتم الإبلاغ عن التحول الجرثومي الناجح في حشرات lepidopteran بشكل رئيسي في دودة القز الحشرية النموذجية ، بومبيك موري11. ومع ذلك ، لا يزال إجراء أعمال الترانسجينيسيس في الحشرات الجعبدوبتران الأخرى ، بما في ذلك بعض الآفات الزراعية الرئيسية ، يمثل تحديا.

القيود الرئيسية والخطوات الرئيسية لإنشاء خط FAW المعدلة وراثيا باستخدام هذا البروتوكول هي توليف عالية الجودة hyPBase مرنا وتقديم مكونات نقل piggyBac في الأجنة في وقت مبكر. المكونان الأساسيان لنظام piggyBac التقليدي هما بلازميد متبرع يحتوي على الشحنة التي سيتم إدخالها في الجينوم وبلازميد مساعد يوفر النقل12. لزيادة كفاءة التحول ، يتم استخدام المروجين النشطين للغاية في المساعد plasmid لدفع التعبير عن النقل13،14. وبما أن هؤلاء المروجين عادة ما يتم الحصول عليهم من الحشرات النموذجية ، فقد لا يكون نشاطهم في الحشرات الأخرى مرتفعا كما هو الحال في الأنواع التي تم التعرف على المروج منها. وبالتالي ، فإن الحمض النووي الريبي المنقول أكثر فعالية من البلازميد المساعد ، مما قد يحسن التحول الجرثومي في معظم الحشرات غير النموذجية.

في هذا البروتوكول، تم إعداد الحمض النووي الريبي hyPBase في المختبر عن طريق بناء البلازميد التي تحتوي على كاسيت التعبير عن hyPBase (T7 المروج: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: بولي (A) إشارة). يسمح المروج T7 في التوليف المختبري من مرنا باستخدام مجموعات توليف ميرنا المتاحة تجاريا. يمكن أن يساعد كل من البوليهيدرين-5'UTR وpolyhedrin-3'UTR في تحسين نسخ الحمض النووي الريبي hyPBase في المختبر وترجمة بروتين hyPBase في الجسم الحي. وجود إشارة بولي (A) يساعد على تعزيز استقرار الحمض النووي الريبي hyPBase في الجسم الحي15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حقن مكونات piggyBac في الأجنة المبكرة جدا مع عدد محدود من الخلايا المقسمة أمر بالغ الأهمية أيضا لتحسين فرص تقديم أسلاف مكونات نظام piggyBac للخلايا الجرثومية. يمكن أن تكون أحداث النقل التي تحدث في الخلايا الجرثومية موروثة. في هذا البروتوكول، تم جمع أجنة FAW أقل من 2 ساعة من العمر وأبقى على الجليد لإبطاء تطورها قبل الحقن. بالنسبة لمعظم الحشرات ، يمكن أن يساعد جمع الأجنة في أقرب وقت ممكن وإيجاد طريقة لإبطاء نموها أيضا في تحويل الجرثومة الناجح.

استخدام البروتينات الفلورية في ترجيخي الحشرات يساعد في تحديد الحيوانات المعدلة وراثيا. في هذا البروتوكول ، تم دمج مروج IE1 ، الذي تم الإبلاغ عنه كمروج فعال وفي كل مكان في الحشرات lepidopteran11، المستمدة من فيروس أوتوجرافا كاليفورنيا متعدد الكبسولات النووي polyhedrosis (AcNPV) في وقت مبكر مباشرة ، مع محسن hr5 لدفع التعبير عن EGFP. في الأفراد المعدلة وراثيا التي تم إدراج EGFP في الجينوم FAW، يمكن ملاحظة إشارة EGFP في جميع المراحل (البيانات غير مبينة). عادة ما يتم التأكيد الجزيئي للعملية الإدراج بوساطة piggyBacبواسطة لطخة جنوبية أو PCR عكسي وتسلسل. وفي هذا البروتوكول، استخدم تضخيم الفينول الخماسي الكلور لشظايا في الشحنة المعدلة وراثيا لتأكيد الإدراج المعدل وراثيا بسرعة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت طريقة TAIL-PCR عالية الكفاءة القائمة على PCR لتحديد موقع تكامل الإدخال المعدل وراثيا9، والذي يسهل التلاعب به مقارنة بطريقة PCR العكسية المستخدمة على نطاق واسع. وقد وضعت طريقة TAIL-PCR عالية الكفاءة لتحديد مواقع التكامل المعدلة وراثيا في النباتات. في هذه الدراسة ، يتم استخدام هذه الطريقة لأول مرة في الحشرات. ويوفر البروتوكول المقدم طريقة فعالة لتوليد الفاو المعدل وراثيا ويمكن تطبيقه أيضا على العديد من الحشرات النموذجية وغير النموذجية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ويدعم البحث المبلغ عنه المؤسسة الوطنية للعلوم I/UCRC، مركز تقنيات إدارة المفصليات، تحت المنحة رقم IIP-1821936 ومن قبل شركاء الصناعة، منحة تنافسية لمبادرة الزراعة والبحوث الغذائية رقم 2019-67013-29351 والمعهد الوطني للأغذية والزراعة، وزارة الزراعة الأمريكية (2019-67013-29351 2353057000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5" Dental Cotton Rolls PlastCare USA 8542025591 REARING
1 oz Souffle Cup Lids DART PL1N
1 oz Souffle Cups DART P100N REARING
48 oz Plastic Deli Containers Genpack AD48 REARING
Add-on Filter Set (Green) NightSea LLC SFA-BLFS-GR SCREENING
Borosilicate Glass Sutter Instruments BF100-50-10 INJECTION
Borosilicate Glass SUTTER INSTRUMENT BF-100-50-10
Dissecting Scope Nikon SMZ745T SCREENING
Featherweight Forceps BioQuip 4750 REARING
Gutter Guard ThermWell Products VX620 REARING
Inverted Microscope Olympus IX71 INJECTION
Microinjector Narishige IM-300 INJECTION
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000 INJECTION
Microscope Slides VWR 16004-22 INJECTION
NightSea Full System NightSea LLC SFA-RB-DIM SCREENING
Nitrogen Gas AWG/Scott-Gross NI 225 INJECTION
Paper Towels Bounty  43217-45074 REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet Southland Products, Inc N/A [Request Species/Quantity] REARING
Spodoptera frugiperda Eggs Benzon Research, Inc N/A [Request Species/Quantity] REARING
Taq MasterMix polymerase mixture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
  2. Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
  3. Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
  4. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
  5. Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
  6. Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
  7. Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
  8. Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
  9. Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
  10. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  11. Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
  12. Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  13. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
  14. Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
  15. Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).

Tags

علم الأحياء، العدد 175، الترانسجينيسيس، نقل piggyBac مفرط النشاط، ميرنا، الميكرويكشن الجنين، Spodoptera frugiperda
مفرط <em>piggyBac</em> Transposase بوساطة التحول Germline في دودة الجيش الخريف، <em>Spodoptera frugiperda</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, X., Palli, S. R. Hyperactive… More

Chen, X., Palli, S. R. Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda. J. Vis. Exp. (175), e62714, doi:10.3791/62714 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter