Summary
Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.
Abstract
Genetik kargonun transpoze edilebilir elementler kullanılarak böcek genomlarına istikrarlı bir şekilde yerleştirilmesi, fonksiyonel genomik çalışmalar ve genetik haşere yönetim stratejileri geliştirmek için güçlü bir araçtır. Böcek dönüşümünde en çok kullanılan transpoze edilebilir element piggyBacve piggyBactabanlı germline dönüşümü model böceklerde başarıyla gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu teknolojiyi tarım zararlılarını içeren model olmayan böceklerde çalıştırmak hala zordur. Bu makale, hiperaktif piggyBac transposase (hyPBase) kullanılarak küresel bir tarım zararlısının, sonbahar ordu kurdunun (FAW), Spodoptera frugiperda'nıngermline dönüşümini rapor ediyor.
Bu çalışmada hyPBase mRNA embriyo mikroenjeksiyonlarında yardımcı plazmid yerine üretilmiş ve kullanılmıştır. Bu değişiklik, transgenik FAW'ın başarılı bir şekilde üretilmesine yol açtı. Ayrıca transgenik hayvanların taranması, transgene yerleştirmenin PCR tabanlı hızlı tespiti ve entegrasyon sahasının termal asimetrik interlaced PCR (TAIL-PCR) tabanlı belirlenmesi yöntemleri de açıklanmıştır. Bu nedenle, bu makale FAW ve diğer lepidopteran böceklerde domuzbactabanlı transgenez kolaylaştıracak transgenik FAW üretmek için bir protokol sürmektedir.
Introduction
Sonbahar ordu kurdu (FAW), Spodoptera frugiperda, Amerika'nın tropikal ve subtropikal bölgelerine özgüdür. Şu anda, bu dünya çapında 100'den fazla ülkede yıkıcı bir böcek otobur1. FAW larvaları, bazı önemli temel gıda bitkileri de dahil olmak üzere 350'den fazla konak bitki ile beslenir2. FAW yetişkinlerinin güçlü göç yeteneği, Amerika'dan diğer yerlere hızla yayılmasına katkıda bulunur1,2. Sonuç olarak, bu böcek şimdi uluslararası gıda güvenliğini tehdit ediyor. Yeni teknolojilerin uygulanması FAW'da ileri çalışmaları kolaylaştırabilir ve bu zararlıyı yönetmek için yeni stratejiler sağlayabilir.
Böcek germline dönüşümü gen fonksiyonunu incelemek ve genetik kontrolde kullanılmak üzere transgenik böcekler üretmek için kullanılmıştır3,4. Böceklerde genetik dönüşümü sağlamak için kullanılan çeşitli yöntemler arasında, piggyBac element tabanlı yöntem en çok kullanılan yöntemdir5. Bununla birlikte, düşük transpozisyon oranı nedeniyle, model olmayan böceklerde transgenez yapmak hala zordur. Son zamanlarda, piggyBac transposase 'nin (hyPBase) hiperaktif bir sürümü geliştirildi6,7. Germline dönüşümü FAW'da yakın zamanda elde edildi8Lepidopteran böceklerinde hyPBase'i kullanan ilk rapordur. Bu raporda, transgenik FAW oluşturmada hyPBase mRNA kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi açıklanmıştır. Burada açıklanan yöntem, diğer lepidopteran böceklerinin dönüşümini sağlamak için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hyPBase mRNA'nın in vitro sentezi
NOT: HyPBase dizisinin tam kodlama dizisi sentezlendi ve bir pTD1-Cas9 vektörüne eklendi (bkz. Malzeme Tablosu)pTD1-hyPBase yapısı üretmek için, hyPBase ifade kaseti içeren, T7 promotörü: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polihedrin-3' UTR: poli (A). pTD1-hyPBase yapının tam sırası Tamamlayıcı Malzeme'de sağlanmıştır.
- In vitro sentez için şablonun hazırlanması
- İleri astar, 5'- atgcggtgtgaaataccgcagatgcg-3' ve ters astar 5'- tagaggccccaaggttatgctag-3', yüksek kaliteli polimeraz ve şablon olarak pTD1-hyPBase plasmid kullanarak hyPBase ifade kasetini yükseltmek için bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin.
NOT: PCR reaksiyonu (50 μL'lik son hacim) 5,0 μL 10x Reaksiyon tamponu içerir, 4,0 μL 10 mM deoksinükleozit trifosfat (dNTP), 1,0 μL plazmid (50 μg/μL), 1,0 μL yüksek kaliteli polimeraz, 10 μM ileri ve ters astarların her biri 1,0 μL, ve 33 μL çekirdeksiz su. Ayarlar şu şekildeydi: 3 dakika boyunca 95 °C'lik bir başlangıç inkübasyonu, ardından 10 s için 98 °C'lik 35 döngü, 15 s için 60 °C ve 2 dakika için 68 °C. - PCR ürününü taze Tris-asetat-etilenediamin tetraasetik asit (TAE) tamponunda 120 V'ta %1 agarose jel üzerinde 30 dakika boyunca kontrol edin ve jel ekstraksiyon kiti ile ürünü arındırın.
NOT: PCR ürün arıtma kitini kullanmayın. pTD1-hyPBase plazmidinin bir iz miktarı bile in vitro sentezin verimliliğini önemli ölçüde azaltır.
- İleri astar, 5'- atgcggtgtgaaataccgcagatgcg-3' ve ters astar 5'- tagaggccccaaggttatgctag-3', yüksek kaliteli polimeraz ve şablon olarak pTD1-hyPBase plasmid kullanarak hyPBase ifade kasetini yükseltmek için bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin.
-
Ticari bir kit kullanarak hyPBase mRNA'nın in vitro sentezi
- Donmuş reaktifleri tamamen çözün, enzimi ve 2x NTP/CAP çözeltisini buzda tutun ve çözülmüş 10x Reaksiyon tamponu oda sıcaklığında bırakın.
- Aşağıdaki bileşenleri ekleyerek reaksiyonun oda sıcaklığında bir araya getirilmiştir: 2x NTP/CAP çözeltisi: 10 μL; 10x Reaksiyon tamponu: 2 μL; Şablon DNA'sı: 0.1-0.2 μg; Enzim karışımı: 2 μL; 20 μL'ye kadar nükleaz içermeyen su.
- Karışımı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyarak reaktifleri iyice karıştırın ve 2-4 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Sentezlenmiş mRNA'nın lityum klorür çökeltimi ile geri kazanımı
- 30 μL LiCl Çökeltme Çözeltisi ekleyin, tüpü hafifçe vurarak iyice karıştırın ve ardından ≥ 30 dakika boyunca -20 ° C'de tutun.
- Maksimum hızda 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- Peletı bir kez% 70 etanol 1 mL ile yıkayın, yeniden santrifüjlayın ve üstnatantı dikkatlice çıkarın.
- Peletin oda sıcaklığında 1-2 dakika kurutun ve ardından peletin 20-40 μL çekirdeksiz su ile yeniden depolayın.
- 1 μL mRNA çözeltisi ile 9 μL çekirdeksiz su ile seyreltin. mRNA konsantrasyonu belirlemek için 2 μL alın ve 40 dakika boyunca taze TAE tamponunda 100 V'ta% 1 agarose jel üzerinde mRNA kalitesini kontrol etmek için 8 μL kullanın.
- mRNA çözeltisini aliquotlayın ve bir yıla kadar -70 °C'de dondurulmuş olarak saklayın.
NOT: mRNA peletini tamamen kurutmayın; suda eritmek daha zor olabilir.
2. Mikroenjeksiyon
- Yumurta koleksiyonu
- 15 cm x 15 cm x 10 cm'lik bir kutuya 12 erkek pupa ve 12 dişi pupa yerleştirin. Kutuyu kağıt havluyla kaplayın. Yetişkinleri beslemek için kutuya% 10 sakkaroz çözeltisi yerleştirin.
- 2. gün eklosyon sonrası, yetişkinleri bir gecede yoğun ışığa maruz bırakın.
- 3. gün eklosyon sonrası, yetişkinleri adım 2.1.2'den karanlık bir yere aktarın. Yumurtlamadan sonra embriyoları 2 saat içinde toplayın.
- Buz üzerinde bir Petri kabında tutulan taze yumurtalarla kağıt havlu parçasına damla su ekleyin. Yumurtaları ince bir fırça ile hafifçe cam bir kaydırağa aktarın ve cam bir kaydırağa tek tek hizalayın. Mikroenjeksiyondan önce cam slaytları hizalanmış yumurtalarla buz üzerinde tutun.
- Mikroenjeksiyon kurulumu
- Transgenik gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ifade edici plazmid (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) karışımı enjekte edin ve otomatik mikroenjektörün kompanzasyon basıncını kullanarak yumurtalara steril damıtılmış su enjekte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Enjekte edilen yumurtaları yumurtadan çıkana kadar 27 ± 1 °C, 60 ± % 10 bağıl nemde tutun.
- Yumurtadan çıkan larvaları yapay bir diyetle besleyin ve her larvayı erken 3rd başlangıç aşamasında (~ 6 mm uzunluğunda ve vücut rengi siyaha döner) küçük bir kaba aktarın.
3. Floresan tarama ve genetik geçiş
- Pupaları toplayın ve ~150 dişi pupa ve ~150 erkek pupayı 35 cm x 35 cm x 35 cm kafese yerleştirin. Yumurtaları toplamak için kafese birkaç parça kağıt havlu (~30 cm x 15 cm) asın.
- Kağıt havluları günlük yumurtalarla toplayın ve yumurtaları yumurtadan çıkana kadar 27 ± 1 °C, 60 ±% 10 bağıl nemde tutun.
- Yenidoğan larvalarını hareketsiz hale getirmek için 5 dakika boyunca 4 °C'de tutun ve ardından buz gibi bir tabağa aktarın.
- Hareketsiz yenidoğan larvalarını floresan stereomikroskop altında tarayın. EGFP pozitif yenidoğanları seçin, 27 ± 1 ° C'de ~ 2 hafta içinde pupal aşamasına yükseltin ve ventral karın segmentlerindeki fenotip farklılıklarına göre cinsiyete göre ayırın.
NOT: Dişi pupa sekizinci karın segmentinde yarık benzeri bir genital açıklığa ve dokuzuncu ve onuncu segmentlerin sefalik kenar boşlukları genital açıklığa doğru kıvrılır. Erkek pupanın genital açıklığı dokuzuncu karın segmentinde hafif bir yüksekliğe sahiptir. - EGFP pozitif pupaları ve karşı cinsin vahşi tip pupalarını bir erkeğe yerleştirin: bir kafese 1:1 kadın oranı. Sib- sonraki nesilleri üretmek için EGFP ifade yetişkinleri çapraz.
4. Transgenik yerleştirmenin PCR tespiti
- Üreticinin talimatlarını takip eden herhangi bir ticari genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak vahşi tip ve EGFP pozitif bireysel larvalardan genomik DNA çıkarın.
- Genomik DNA'yı şablon olarak kullanarak pcr reaksiyoni gerçekleştirin; ie1 organizatör bölgesinde bulunan 5'- acgtacgctcctcggttccgttcc-3' ileri astar; ve dönüşüm vektörün EGFP bölgesinde bulunan 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' ters astar.
- Her PCR reaksiyonu (40 μL'lik son hacim) 20 μL polimeraz karışımı, 1,0 μL genomik DNA (40 μg/μL), 10 μM ileri ve ters astarın her biri 1,0 μL ve 17 μL çekirdeksiz su içerecek şekilde ayarlayın. Aşağıdaki ayarları kullanın: 3 dakika boyunca 95 °C'lik bir başlangıç inkübasyonu, ardından 20 s için 95 °C,20 s için 56 °C ve 40 s ayar için 68 °C'lik 35 döngü.
- PCR ürünlerini 30 dakika boyunca 120 V'te% 1 agarose jel üzerinde kontrol edin.
5. Transgenik ekleme bölgesinin belirlenmesi
- EGFP pozitif böceklerde transgene eklemenin entegrasyon alanını belirlemek için şablon olarak genomik DNA kullanarak yüksek verimli TAIL-PCR gerçekleştirin.
- PCR reaksiyonlarını başka bir yerde açıklanan adımları izleyerekgerçekleştirin 9.
- Üç astar kullanın, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', ve P3: 5'-atgtcctaaatgcagcgacggattcgcgct-3', piggyBac vektörüne özgü, 3 tur PCR reaksiyonunda.
- PCR reaksiyonlarını başka bir yerde açıklanan adımları izleyerekgerçekleştirin 9.
- Tümleştirme sitesini belirlemek için son PCR ürünlerini sıralayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HyPBase içeren T7 promotörünün ifadesi için bir yapı: polihedrin-5'UTR: hyPBase: polihedrin-3'UTR: poli (A) sinyali oluşturuldu (Şekil 1A) ve hyPBase mRNA in vitro sentezlemek için ~2.2 kb PCR parçası olarak yükseltildi (Şekil 1B). Daha sonra hyPBase mRNA üretildi ve agarose jel elektroforezise tabi tutuldu. Beklenen boyuttaki mRNA (~1,1 kb bant) %1 agarose jel üzerinde tespit edildi (Şekil 1C).
Daha sonra, piggyBac tabanlıbir EGFP ifade yapısı hazırlanmıştır (Şekil 2A). Bu plazmid ve hyPBase mRNA veya PBS çözeltisinin bir karışımı, yumurtlamadan sonra 2 saat içinde embriyolara enjekte edildi. Enjeksiyondan 24 saat sonra, enjekte edilen embriyolarda geçici egfp ekspresyasyonu sinyali gözlendi. PBS enjekte edilen embriyolarda EGFP sinyali (Şekil 2B) görülmezken, EGFP ekspresyonlu plazmid ve hyPBase mRNA enjekte edilen embriyolarda EGFP floresan (Şekil 2C)gösterilmiş ve bu da piggyBac konstrüksiyonun başarılı olduğunu göstermiştir. Böylece, hr5ie1 promotörü erken embriyonik gelişim sırasında çalışabilir.
Yaklaşık 2.000 yumurta enjekte edildi ve bunların ~700'ü pupa haline getirildi. G0 yetişkinleri kendi kendilerine geçti ve yumurtalar toplandı. Bu yumurtalardan çıkan G1 larvaları floresan stereomikroskop altında EGFP sinyali için incelendi. Şekil 3A'dagösterildiği gibi, transgenik larvalar güçlü bir EGFP sinyali gösterdi. EGFP ekspresyon kasetinin EGFP pozitif böceklerin genomlarına yerleştirilmesini test etmek için, organizatör ve EGFP parçasını içeren bir parça, EGFP pozitif larvalardan izole edilmiş genomik DNA kullanılarak şablon olarak yükseltildi (Şekil 3B). Genomik DNA şablon olarak vahşi tip larvalardan izole edildiğinde bu parça tespit edilmedi (Şekil 3B). Yüksek verimli TAIL-PCR ve PCR ürünlerinin dizilimi yapılarak transgene yerleştirmenin entegrasyon yeri belirlendi. Şekil 4'tegösterildiği gibi, transgene entegrasyon bölgesi kromozom 26'daki Twinchin benzeri genin 81st intronunda yat almaktadır.
Şekil 1: HyPBase mRNA üretimi. (A) T7 promotörünü içeren hyPBase ifade kaseti: polihedrin-5'UTR: hyPBase: polihedrin-3'UTR: poli (A) sinyali yapıldı. (B) HyPBase mRNA sentezlemek için ~2.2 kb DNA şablonu hyPBase yapısından yükseltildi. Sol şerit aynı jel üzerinde 1 kb merdiven çalışmasını gösterir. (C) Bir ~1.1 kb hyPBase mRNA, güçlendirilmiş DNA şablonundan sentezlendi. Sol şerit aynı jel üzerinde 1 kb merdiven çalışmasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Enjekte edilen embriyolarda EGFP ekspresyasyonu. (A) Bu çalışmada kullanılan piggyBac vektörün şematik diyagramı. (B) 1x PBS enjekte edilen embriyolarda EGFP sinyali saptanmedi. (C) PiggyBac vektörü ve hyPBase mRNA enjekte edilen embriyolarda EGFP sinyali saptandı. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein ve PBS = fosfat tamponlu salin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Transgenik FAW'ın karakterizasyonu. (A) EGFP ekspresyasyonu transgenik ancak vahşi tip FAW larvalarında değil. Ölçek çubukları = 0,5 mm. (B) Transgenes genomik yerleştirme PCR analizi. Organizatör ve EGFP bölgelerini hedefleyen bir çift astar, şablon olarak transgenik veya vahşi tip FAW larvalarından izole edilen genomik DNA'yı kullanarak ~0,5 kb'lık bir parçayı yükseltmek için kullanıldı. Kısaltmalar: EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein ve FAW = Sonbahar ordu kurdu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: PiggyBac yapının genomik yerleştirilmesi. Transgenik FAW'da piggyBac yapının genomik olarak yerleştirilmesi TAIL-PCR ve dizileme ile belirlendi. Kromozom lokalizasyonu ve piggyBac yapının sınırlarını kuşatan kısmi genomik DNA dizileri gösterilmiştir. Kısaltmalar: FAW = Güz ordu kurdu ve TAIL-PCR = termal asimetrik interlaced PCR. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Malzeme. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transpozisyon oranının düşük olması ve transgenik bileşenleri taze embriyolara ulaştırmanın zorluğu, özellikle sipariş olan Lepidoptera'dan gelen birçok model olmayan böcekte germline dönüşümünün başarısını sınırlar. Germline dönüşüm oranını artırmak için, en yaygın kullanılan piggyBac transposase'nin (hyPBase) hiperaktif bir sürümü geliştirildi7,10. Bugüne kadar, lepidopteran böceklerde başarılı germline dönüşümü esas olarak model böcek ipekböceği, Bombyx mori11. Bununla birlikte, bazı büyük tarım zararlıları da dahil olmak üzere diğer lepidopteran böceklerde transgenez çalışması yapmak hala zordur.
Bu protokolü kullanarak transgenik bir FAW hattı oluşturmanın başlıca sınırlamaları ve temel adımları, yüksek kaliteli hyPBase mRNA sentezlemek ve piggyBac transpozisyon bileşenlerini erken embriyolara teslim etmektir. Geleneksel piggyBac sisteminin iki temel bileşeni, genoma yerleştirilecek yükü içeren bir donör plazmid ve transposaz12sağlayan bir yardımcı plazmiddir. Dönüşüm verimliliğini artırmak için, transposaz13,14ifadesini yönlendirmek için yardımcı plazmidde son derece aktif organizatörler kullanılır. Bu organizatörler genellikle model böceklerden elde edildiği için, diğer böceklerdeki aktiviteleri organizatörün tanımlandığı türlerde olduğu gibi yüksek olmayabilir. Bu nedenle, transposase mRNA, çoğu model olmayan böcekte germline dönüşümunu artırabilecek yardımcı plazmidden daha etkilidir.
Bu protokolde hyPBase mRNA, hyPBase ifade kasetini içeren bir plazmid inşa ederek in vitro olarak hazırlanmıştır (T7 promotörü: polihedrin-5'UTR: hyPBase: polihedrin-3'UTR: poli (A) sinyali). T7 promotörü, piyasada bulunan mRNA sentez kitlerini kullanarak mRNA'nın in vitro sentezine izin verir. Hem polihedrin-5'UTR hem de polihedrin-3'UTR, hyPBase mRNA in vitro transkripsiyonunun iyileştirilmesine ve hyPBase proteininin in vivoçevirisine yardımcı olabilir. Poli (A) sinyalinin varlığı hyPBase mRNA in vivo15 stabilitesiniartırmaya yardımcı olur. Ek olarak, piggyBac bileşenlerinin sınırlı sayıda bölünen hücreye sahip çok erken embriyolara enjeksiyonu, germline hücrelerinin piggyBac sistem bileşeni progenitörlerinin teslim etme şansını artırmak için de kritik öneme sahiptir. Germline hücrelerinde meydana gelen transpozisyon olayları kalıtsal olabilir. Bu protokolde, enjeksiyondan önce gelişimlerini yavaşlatmak için 2 saatten daha eski FAW embriyoları toplandı ve buzda tutuldu. Çoğu böcek için embriyoları mümkün olduğunca erken toplamak ve gelişimlerini yavaşlatmanın bir yolunu bulmak da başarılı mikrop çizgisi dönüşümüne yardımcı olabilir.
Böcek transgenezinde floresan proteinlerin kullanılması transgenezin tanımlanmasına yardımcı olur. Bu protokolde, Lepidopteran böcekler 11'de verimli ve her yerde bulunan bir organizatör olduğu bildirilenIE1promotörü Autographa california multicapsid nükleer polihedroz virüsünden (AcNPV) hemen erken genden türetilmiş, EGFP'nin ifadesini yönlendirmek için hr5 arttırıcı ile kaynaştırılmıştır. EGFP'nin FAW genomuna yerleştirildiği transgenik bireylerde EGFP sinyali her aşamada gözlenebilirdi (veriler gösterilmedi). PiggyBacaracılı yerleştirmenin moleküler onayı genellikle güney lekesi veya ters PCR ve dizileme ile gerçekleştirildi. Bu protokolde transgenik yükün bir parçasının PCR amplifikasyonu transgenik yerleştirmeyi hızlı bir şekilde doğrulamak için kullanılmıştır. Ek olarak, transgenik ekleme9entegrasyon sitesini tanımlamak için PCR tabanlı yüksek verimli bir TAIL-PCR yöntemi kullanılmıştır Yaygın olarak kullanılan ters PCR yöntemine kıyasla manipüle edilmesi kolaydır. Yüksek verimli TAIL-PCR yöntemi, bitkilerdeki transgenik entegrasyon alanlarını tanımlamak için geliştirilmiştir. Bu çalışmada, bu yöntem böceklerde ilk kez kullanılmaktadır. Sunulan protokol transgenik FAW oluşturmak için etkili bir yol sağlar ve diğer birçok model ve model olmayan böceklere de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Rapor edilen araştırma Ulusal Bilim Vakfı I/UCRC tarafından desteklenmektedir, Eklembacaklı Yönetim Teknolojileri Merkezi, Grant No IIP-1821936 ve endüstri ortakları tarafından, Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi Rekabetçi Hibe No. 2019-67013-29351 ve Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, ABD Tarım Bakanlığı (2019-67013-29351 ve 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
