Summary
פרוטוקול זה מתווה את השלבים לגרימת אוטם שריר הלב בעכברים תוך שמירה על קרום הלב ותכולתו.
Abstract
פרוטוקול זה הראה כי קרום הלב ותכולתו ממלאים תפקיד אנטי-פיברוטי חיוני במודל המכרסם האיסכמי (קשירה כלילית לגרימת פגיעה בשריר הלב). רוב המודלים הפרה-קליניים של אוטם שריר הלב דורשים הפרעה של שלמות קרום הלב עם אובדן הסביבה התאית ההומיאוסטטית. עם זאת, לאחרונה פותחה על ידינו מתודולוגיה כדי לגרום לאוטם שריר הלב, אשר ממזער נזק קרום הלב ושומר על אוכלוסיית תאי החיסון של הלב. נצפתה התאוששות תפקודית לבבית משופרת בעכברים עם חלל קרום הלב שלם לאחר קשירה כלילית. שיטה זו מספקת הזדמנות לחקור תגובות דלקתיות בחלל קרום הלב לאחר אוטם שריר הלב. פיתוח נוסף של טכניקות התיוג יכול להיות משולב עם מודל זה כדי להבין את גורלם ותפקודם של תאי מערכת החיסון קרום הלב בוויסות המנגנונים הדלקתיים המניעים שיפוץ בלב, כולל פיברוזיס.
Introduction
עד היום, מחלות לב וכלי דם (CVD) מוכרות כגורם המוות המוביל בעולם, וכתוצאה מכך נטל כלכלי משמעותי וירידה באיכות החיים של המטופלים1. מחלת עורקים כליליים (CAD) היא תת-סוג של CVD וממלאת תפקיד חיוני בהתפתחות אוטם שריר הלב (MI), התורם העיקרי לתמותה. בהגדרה, MI נובע מפגיעה בלתי הפיכה ברקמת שריר הלב עקב תנאים ממושכים של איסכמיה והיפוקסיה. רקמת שריר הלב חסרה יכולת התחדשות, ולכן הפציעות הן קבועות וגורמות להחלפת שריר הלב בצלקת פיברוטית שיכולה להגן בתחילה אך בסופו של דבר תורמת לשיפוץ לב שלילי ובסופו של דבר לאי ספיקת לב2.
למרות שהטיפול בחולים עם CAD השתפר באופן דרמטי בעשורים האחרונים, אי ספיקת לב כרונית (CHF) משנית לאיסכמיה משפיעה על חולים רבים ברחבי העולם. כדי למנוע ולנהל מגיפה זו, יש צורך להבין את המנגנונים הבסיסיים באופן נרחב יותר ולפתח גישות טיפוליות חדשות. יתר על כן, ממצאי העבר מדגישים את מגבלות הטיפול המערכתי ואת הצורך בפיתוח חלופות מדויקות. בהתחשב בכך שחקירת ההמשך המולקולרי של MI בבני אדם מושפעת מהיכולת לגשת לרקמות אוטמות, מודלים של בעלי חיים המסכמים את המאפיינים וההתפתחות של MI אנושי ו- CHF הקשורים ל- CVD הם הכרחיים.
מכיוון שמודלים אידיאליים של בעלי חיים דומים מאוד להפרעה אנושית עבור מאפיינים מבניים ותפקודיים, אטיולוגיה של מחלות צריכה להנחות את תפיסתם. ב- CAD, זוהי היצרות טרשת עורקים כרונית של עורקים כליליים או חסימה טרומבוטית חריפה. שיטות שונות פותחו ויושמו במינים שונים של חיות מעבדה כדי לגרום להיצרות או חסימה של עורקים כליליים. ניתן לסווג אסטרטגיות כאלה באופן נרחב לשתי קבוצות: (1) מניפולציה מכנית של עורק כלילי כדי לגרום ל- MI ו- (2) זירוז טרשת עורקים כדי להקל על היצרות כלילית המובילה ל- MI. האסטרטגיה הראשונה כוללת בדרך כלל קשירת עורק כלילי או מיקום של סטנט בתוך העורק. הגישה השנייה נוטה להסתמך על שינוי התזונה של בעל החיים כך שתכלול מזון עתיר שומן/כולסטרול. חלק מהמגבלות של גישה אחרונה זו כוללות את חוסר השליטה על העיתוי והאתר של חסימות כליליות.
לעומת זאת, לאינדוקציה כירורגית של MI או איסכמיה במודל של בעלי חיים יש מספר יתרונות, כגון מיקום, תזמון מדויק והיקף האירוע הכלילי, מה שמוביל לתוצאות הניתנות לשחזור יותר. השיטה הנפוצה ביותר היא קשירה כירורגית של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי (LAD). מודלים אלה משחזרים תגובות אנושיות לפגיעה איסכמית חריפה, כמו גם את ההתקדמות ל- CHF3. ניתוח LAD בבעלי חיים קטנים כמו מכרסמים, שפותח בתחילה בבעלי חיים גדולים יותר, הפך אפשרי יותר עם התקדמות הטכנולוגיה4. בהקמת מודלים כאלה, עכברים הועדפו מסיבות שונות, כולל הזמינות היחסית שלהם, הוצאות נמוכות בדיור, ויכולתם למניפולציה גנטית.
מודלים כירורגיים עכשוויים של מחלת לב איסכמית באמצעות חסימת LAD מחייבים את החוקר לפתוח את קרום הלב כדי ללקות את העורק5 באופן זמני או קבוע. אסטרטגיות כאלה גורמות לשיבוש החלל הקרדיותי, הממלא פונקציה מכנית ושימון במהותה כדי להבטיח תפקוד לב תקין. חסרון נוסף בפתיחת קרום הלב הוא אובדן הנוזל הפריקרדיאלי הטבעי של החיה על מרכיביו התאיים והחלבונים השונים 6,7. בתגובה, פותחה שיטה להשראת MI תוך שמירה על קרום הלב שלם. בנוסף למזעור ההפרעה לסביבה הומאוסטטית זו, גישה זו מאפשרת תיוג ומעקב אחר תאים ספציפיים לאחר גרימת MI. בנוסף, גישה זו מייצגת טוב יותר פגיעה איסכמית שריר הלב בסביבה האנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברי C57BL/6J זכרים ונקבות בגילאי 8-14 שבועות שימשו לניסויים אלה. פרוטוקול זה קיבל אישור אתי מוועדת הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קלגרי ועוקב אחר כל ההנחיות לטיפול בבעלי חיים.
1. הכנת עכבר וניתוח
- לעקר כלי ניתוח (באמצעות מעקר חרוזים או אוטוקלב).
- שקול עכבר למשקל טרום ניתוחי ומינון משכך כאבים.
- הניחו את העכבר בקופסת אינדוקציה עם 4% איזופלוראן ו-800 מ"ל/דקה של חמצן. אשר את מישור ההרדמה על ידי צביטה בהונות והתבוננות בבעל החיים מחוסר רפלקס.
- להזריק משכך כאבים תת עורית (0.1 מ"ג / ק"ג של Buprenorphine) (ראה טבלת חומרים).
- הניחו את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במהלך הניתוח ושמרו על הרדמה עם 3% איזופלוראן המועבר דרך חרוט האף. יש למרוח משחה אופטלמית כדי למנוע יובש בעיניים בכל עין.
- לגלח את השיער מאזורי הניתוח של החזה והצוואר.
- רסנו את כפות העכבר והניחו אותן על שולחן הניתוחים.
- אינטובציה של העכבר על ידי החדרת קטטר חלק של 23 גרם לתוך קנה הנשימה דרך הפה והלוע.
- לאוורר את העכבר לאחר אינטובציה עם 2% איזופלוראן ו-100% חמצן כגז נשא באמצעות מכונת הנשמה מסחרית (ראו טבלת חומרים) בקצב של 110 נשימות לדקה, נפח גאות של 250 μL, ולחץ סופי חיובי (PEEP) של 4 מ"מ כספית.
- גלגלו את העכבר 30% על צדו הימני כדי למקם את הצד השמאלי של החזה לניתוח.
- נקו את אזור הניתוח עם 3 פילינגים מתחלפים של 70% אתנול ובטאדין בתנועה מעגלית (ראוטבלת חומרים). הניחו וילונות כירורגיים סטריליים סביב אזור הניתוח.
- בצע חתך רוחבי של 2-3 ס"מ בעור החזה כדי לדמיין את שרירי החזה בצד שמאל. חותכים את החזה מז'ור ומינור באמצעות חתך של 1 ס"מ מקו האמצע כלפי חוץ כדי לדמיין את השרירים הבין-קוסטליים בין הצלעות השלישית והרביעית.
הערה: יש להקפיד על מניעת דימום עודף משריר החזה באמצעות צריבה של כלי דם מדממים. - בצע חתך של 2 ס"מ בשריר האינטרקוסטלי השמאלי כדי להכניס אוויר (על ידי תנועת אוויר פסיבית) לחלל החזה כדי לאפשר ללב ולריאות ליפול מהחתך הניתוחי. יתר על כן, להרחיב את הפתח בעזרת מכשיר צריבה (ראה טבלת חומרים) כדי להחדיר את intercostal ולמנוע דימום
הערה: יש להפסיק את מכונת ההנשמה באופן זמני במהלך תקופת הצריבה כדי למנוע תגובות נפיצות עם חמצן. נזהרים שלא לפגוע בשק קרום הלב. - באמצעות retractors, לסגת את הצלעות כדי לחשוף את הלב.
- התבונן בקרום הלב ובלב הבסיסי תחת סטריאומיקרוסקופ.
הערה: קרום הלב של העכבר דק מספיק כדי לדמיין את כלי הדם של הלב. - מניחים בעדינות מלקחיים על פני קרום הלב כדי להפחית את תנועתו ואת זו של הלב שמתחתיו.
- ציון חזותי של העורק הכלילי הקדמי השמאלי (LAD) על ידי התחקות אחר הופעתו מתחת לתוספת השמאלית.
- באמצעות דרייבר המיקרו-מחט, יש להנחות תפר מתאים (ראו טבלת חומרים) דרך קרום הלב, מתחת ל-LAD, כאשר התפר מופיע בצד השני של ה-LAD וקרום הלב. קשרו את התפר כדי להגביל את זרימת הדם דרך העורק הכלילי וחתכו את התפר העודף בעזרת מספריים (איור 1A).
הערה: עם הגבלת זרימת הדם לעורק הכלילי, יש לראות את החלק הקדמי של החדר השמאלי. הליך זה מייצג מודל קשירת קבוע. עם זאת, ניתן ליישם בשלב זה גם גישת קשירה חולפת עם תקופות איסכמיה שונות. - מתחת לאתר החתך בתוך האזור הסטרילי, יש להכניס קטטר 24 גרם מלעורי לחזה (להסיר את מחט המדריך לאחר הכניסה לחלל החזה). לאחר מכן, סגרו את הצלעות ואחריהן את שכבות השרירים והעור באמצעות תפר מתאים (מחט מחודדת לשריר, מחט חיתוך קונבנציונלית לעור).
- לאחר סגירת החזה, יש לפנות את האוויר שנותר מחלל החזה באמצעות קטטר 24 גרם באמצעות שאיבה עדינה עם מזרק 3 מ"ל ולחיצות חזה. לאחר הסרת האוויר, למשוך את קטטר 24 גרם.
- הפחיתו את האיזופלוראן ל-1%.
- כבה את האיזופלורן תוך שמירה על אוורור עם חמצן כדי לאפשר לעכבר להתאושש מההרדמה. ברגע שהחיה מראה סימני נשימה באופן עצמאי, הסר את צינור קנה הנשימה 23 G מהפה והנח את העכבר בכלוב התאוששות כדי להיות במעקב לחידוש הנשימה הרגילה.
- אפשרו לעכבר להתאושש בכלוב כאשר חלק מהכלוב מונח על כרית חימום כדי לספק מקור חום חיצוני.
- לספק זריקות תחזוקה של משכך כאבים (Buprenorphine 0.1 מ"ג / ק"ג, תת עורית) כל 12 שעות במשך 72 שעות לאחר הניתוח.
- עקוב אחר מצבם הבריאותי של עכברים מדי יום במשך 7 ימים, הכולל הערכת חתכים ואי נוחות של בעלי חיים.
הערה: בשל הפולשנות של הליך זה (thoracotomy), הממשל של אנטיביוטיקה עשוי להיות נחוץ.
2. הערכה תפקודית של תפקוד הלב על ידי אקוקרדיוגרפיה (ECG)
- השרה ותחזק את העכבר תחת הרדמה כללית עם 1.5-2% איזופלוראן ו-800 מ"ל/דקה של חמצן.
- הניחו את העכבר במצב שכיבה על משטח במה מחומם וחברו את הכפות למוליכי האק"ג.
- לגלח את החזה של העכבר.
- קבל תמונות אקוקרדיוגרפיה באמצעות בדיקה מתמר ליניארית של 40 MHz וג'ל מגע ונתח באמצעות התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים).
- כבו את האיזופלוראן ואפשרו לעכבר להתאושש על משטח החימום לפני החזרת הכלוב למצב פעיל.
הערה: הערכת אקוקרדיוגרפיה אינה פולשנית ולכן ניתן לבצע אותה לאורך כל הניסוי כדי לקבוע שינויים לפני ואחרי קשירת הכליליה.
3. איסוף רקמות לב לצביעת פיברוזיס
- הקריבו את העכברים בשאיפה של 100% CO2 ונתחו בזהירות את הלב.
הערה: באמצעות מספריים ומלקחיים, זה מושג על ידי חיתוך דרך כלי הדם הגדולים הנכנסים (vena cava, וריד ריאתי) ויציאה (עורק ריאתי, אבי העורקים) את הלב כדי לשחרר אותו ממערכת הדם בחלל החזה. - לקבע את הלב ב-10% פורמלין למשך 24 שעות לפחות.
- חתכו דגימות באמצעות סכין גילוח ישר דרך החדר הימני, המחיצה הבין-חדרית והחדר השמאלי, כדי להבטיח שהחתך יעבור דרך מרכז אזור האוטם. לאחר מכן נשלחות דגימות למתקן הליבה להטמעת פרפין.
- חותכים חלקי רקמה בעובי 5 מיקרומטר עם מיקרוטום ומניחים אותם על שקופיות זכוכית להכתמה.
- יש לבצע דה-פראפין באמצעות שטיפות קסילן מסחריות ואלכוהול מדורג (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) עם מים שעברו דה-יוניזציה, ולאחר מכן לייבש מחדש.
- כתם עם 0.1% סיריוס אדום בחומצה פיקרית למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף חלקים עם 0.5% חומצה אצטית במשך 3 דקות ולשטוף עם 70% אתנול במשך דקה אחת.
- ייבשו את החלקים באמצעות הסדר ההפוך של שטיפות המתוארות ב-3.4, כאשר ריכוזי האתנול עולים ומדורגים ואז הקסילן.
- מקטעי רקמת הרכבה עם תמיסת הרכבה (ראה טבלת חומרים) להערכה מיקרוסקופית.
4. זרימה ציטומטריה של שטיפת לב וחלל קרום הלב
- הקריבו את העכברים בשאיפה של 100% CO2 כדי להשפיע.
- הנח את העכבר על גבו וקבע את הידיים והרגליים ללוח ניתוח באמצעות סרט הדבקה.
- פותחים בזהירות את הצד השמאלי (צד ימין מנקודת המבט של הנסיין) של חלל בית החזה, החל מחיתוך הסרעפת לנקודת האמצע ולאחר מכן חותכים דרך הצלעות החיצוניות לכיוון עצם החזה.
הערה: הימנעו מניקור של כלי דם גדולים, במיוחד אלה הפועלים במקביל לעצם החזה. - החזירו את הצלעות באמצעות המוסטאט כדי לחשוף את הלב התחתון ואת קרום הלב.
הערה: קרום הלב שביר מאוד, אז הקפד לא לתפוס אותו עם מספריים במהלך החיתוך. - באמצעות צינור PE-10 (ראו טבלת חומרים) קטטר המוחדר לחלל קרום הלב בסמוך לצומת האטריום השמאלי והחדר השמאלי, מזריק 100 μL של מי מלח סטריליים לתוך חלל קרום הלב.
- אפשר מלח כדי בריכה לאסוף מן הצד האחורי של הלב, נזהר לא לנקב או לקרוע את קרום הלב בתהליך. חזור על שלב זה פעמיים והניח נוזל שטיפה על קרח תוך כדי עיבוד הלב.
- כריתת הלב על ידי חיתוך כלי הדם העיקריים (אבי העורקים, עורק הריאה, הווריד והווריד הוורידי) הנכנסים ויוצאים מהלב. הסר את האטריה הימנית והשמאלית ושקול את רקמת הלב החדרית.
- טחנו את הרקמה בחתיכות קטנות של 1 מ"מ2 באמצעות מספריים והניחו 10 מ"ל של חיץ עיכול המכיל 450 U/mL של קולגן I, 125 U/mL של קולגן XI, 60 U/mL של DNase I, ו-60 U/mL של היאלורונידאז ב-PBS למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי.
- מעבירים הומוגניות של רקמת לב דרך מסננת תאים בקוטר 70 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) ומסתובבים כלפי מטה ב-60 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר תאים פרנכימליים לבביים.
- אספו את הסופר-נטנט, עברו דרך מסננת תאים בקוטר 40 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) לתרחיף של תא בודד, והסתובבו מטה בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לזרוק את התאים.
- לבצע חסימת קולטן גבישית (Fc) והכתמה של סמנים תאיים על תאי קרום הלב ותאי הלב כפי שתואר קודםלכן 8.
- הפעל דגימות על ציטומטר זרימה.
5. תיוג מקרופאגים פריקרדיאליים בשיטת הגישה הבין-קוסטלית למרחב הפלאורלי (ICAPS)9
- יש לחטא כלי ניתוח (באמצעות מעקר חרוזים או אוטוקלב) ולרסס 70% אתנול לפני ההתחלה.
- השרה ותחזק את העכבר תחת הרדמה כללית עם 1.5-2% איזופלוראן ו-800 מ"ל/דקה של חמצן. אשר את מישור ההרדמה על ידי צביטה בהונות והתבוננות בבעל החיים מחוסר רפלקס.
- להזריק משכך כאבים תת עורית (Buprenorphine 0.1 מ"ג / ק"ג).
- הנח את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במהלך הניתוח.
- לגלח את אזור החזה האנטרולטרלי הימני.
- נקו את אזור הניתוח עם אתנול ובטאדין.
- לעשות חתך באורך 3 ס"מ בעור, ועם מלקחיים לחשוף את כלוב הצלעות.
- טען 5 μL של חרוזים פלואורסצנטיים (מיקרוספרות פלואורסצנטיות זמינות מסחרית, 1 מיקרומטר, ראו טבלת חומרים) ו-45 μL של מלח לתוך קטטר מזרק צינורות PE-10 עם קצה משופע.
- יש להנחות את הצנתר לתוך החלל הבין-קוסטלי כפי שתואר קודםלכן 9, להזריק באיטיות את תמיסת החרוז ולהוציא את הצנתר בתנועה אחת.
- סגור את העור באמצעות סיכות.
הערה: סיכות משמשות במקום תפרים כדי למזער פתיחה מחדש פוטנציאלית של החתך. - כבה את האיזופלורן, הנח את העכבר בכלוב ההתאוששות ועקוב אחר סיבוכים במהלך 24 השעות הראשונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל קשירה כלילית שונה זה עבר אופטימיזציה כדי להשיג יכולת שכפול והישרדות בעלי חיים. עם זאת, בשל הפגיעה המשמעותית הנגרמת בלב, חלק מהתמותה התוך-ניתוחית והפוסט-ניתוחית הצפויה קשורה להליך. התמותה הסטנדרטית בדרך כלל גבוהה יותר אצל זכרים (~25-35%) מאשר אצל נקבות (~ 10-15%).
אינדוקציה מוצלחת של MI עם קשירת הכליליה המתוקנת צריכה להיות ניכרת על ידי שינויים בפרמטרים התפקודיים של הלב ובתכונות המבניות. עבור תפקוד, ירידה בפרמטרים כגון שבר פליטה של חדר שמאל (LV) כפי שהוערך על ידי אקוקרדיוגרפיה תורגש תוך 3-4 שבועות לאחר MI (איור 1A). השינויים התפקודיים האלה צריכים להיות מלווים בפיברוזיס משמעותי של הדופן החופשית של ה-LV כפי שהוערך על-ידי צביעה היסטולוגית כגון פיקרוסריוס אדום (PR) (איור 1B). לצורך ניתוח זה, השימוש בחתכים אורכיים דרך אוטם צריך לאפשר ייצוג של אזור אוטם, פרי-אוטם ואזורים מרוחקים של הלב.
שמירה על קרום הלב שלם לאורך כל ההליך מספקת הזדמנות לחקור את התגובה הדלקתית בו זמנית בחלל קרום הלב. היא גם מאפשרת לקבוע כיצד תאי מערכת החיסון בתוך תא זה יכולים לתרום לתהליכי שיפוץ מתמשכים. שילוב שיטת תיוג החרוזים הפלואורסצנטיים עם ניתוח ציטומטריה של זרימה מספק גישה אחת למעקב עם מקרופאגים פריקרדיאליים (GPCMs) בעלי סלקטיביות גבוהה. הליך זה כרוך בהזרקת חרוזים ישירות לתוך החלל pleural. אלה נקלטים באותה מידה על ידי מקרופאגים תושבים מסוג Gata6 הן בחלל הצדר והן בחלל קרום הלב (איור 2A) עקב תקשורת בין שני חלליםאלה 10. חשוב לציין שאין כמעט תיוג בלב או בדם (איור 2A). לאחר התווית, ניתן לעקוב אחר מיקום מחדש של התאים בעקבות אתגרים דלקתיים כגון MI על-ידי ציטומטריה של זרימה (איור 2B) ו/או הדמיה. כדי למנוע השפעות דלקתיות פוטנציאליות מהליך ICAPS, תיוג זה צריך להתבצע שבוע לפני ההתערבויות הבאות.
איור 1: מודל קשירה כלילית קרום הלב שלם גורם לשינויים תפקודיים ומבניים בלב. (A) ציר זמן סכמטי וכימות שברים של פליטת LV בנקודת ההתחלה או 4 שבועות לאחר קשירה כלילית עבור בעלי חיים עם קרום הלב משובש או שלם. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD. ***= p < 0.001, *= p < 0.05 לעומת ANOVA בסיסי, חד-כיווני. הותאם מ-Deniset JF, et al., באישור Elsevier8. (B) תמונות מייצגות וכימות של פיברוזיס אדום פיקרוסיריוס מכתים בחתכי לב עכבר ב-4 שבועות לאחר אוטם עם מודלים של קשירת קרום הלב הכלילית משובשת או שלמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תיוג ומעקב אחר מקרופאגים של חלל קרום הלב בעקבות MI . (A) חלקות ציטומטריה של זרימה מייצגת של חרוז פלואורסצנטי המכילות תאים מיאלואידים מחלל הצדר, חלל קרום הלב, רקמת הלב ודם בנקודת ההתחלה או 7 ימים לאחר הזרקה מקומית של חרוזים פלואורסצנטיים בשיטת ICAPS. פאנלים תחתונים- אפיון חרוזים ותאים בחלל קרום הלב בעיקר מקרופאגים פריקרדיאליים Gata6+ (GPCMs). (B) ניתוח ציטומטריה של זרימה וכימות של חרוזים פלואורסצנטיים המסומנים בתאים מיאלואידים קרום הלב בחלל קרום הלב ובלב עם או בלי MI. *= p < 0.05, ** = p < 0.01. הותאם מ-Deniset JF, et al., באישור Elsevier8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גרימת MI בקרום לב סגור במכרסמים היא ייחודית ויכולה להיות בעלת יישומים משמעותיים פוטנציאליים. ההליך מסתמך במידה רבה על היכרותו של המנתח עם דגם המכרסם ועם אנטומיית הלב של המכרסמים. ההצלחה תלויה גם בטיפול שניתן במהלך שלושה שלבים קריטיים: חתך שריר אינטרקוסטלי ונסיגת צלעות (שלבים 1.11-1.13), יצירת אוטם (שלב 1.17 ), והתאוששות בעלי חיים (שלבים 1.22-1.24).
בית החזה חייב להיעשות בחריצות כדי למנוע ניקוב או שרוך קרום הלב. השלב המכריע ביותר בפרוטוקול זה הוא תפירת ה-LAD כדי לגרום לאוטם. כמו בכל מודלי הקשירה של LAD, מיקום מתאים של תפר הקשירה על ה-LAD הוא קריטי: קשירת פרוקסימלית עלולה לגרום ל-MI קטלני, בעוד שקשירת דיסטלי עלולה שלא לגרום ל-MI רלוונטי מבחינה תפקודית. ציון ה-LAD במרכז המשוער של הלב מונע בעיות אלה. מכיוון שקשירת LAD מבוצעת עם פעימות הלב, ייצוב עדין של הלב עם מלקחיים יכול לעזור למזער את התנועה, ולאפשר לתפור את ה-LAD מבלי לפגוע בו. חתך כלי קטן על האפיקרדיום יכול להתרחש במהלך הליך זה. דימומים קלים ייפתרו במשך 2-3 ימים ולא יזהמו את נוזל קרום הלב. קרום הלב, במיוחד בעכברים, הוא דק מאוד וניתן לקרוע אותו בקלות אם המנתח אינו נוקט זהירות. לבסוף, על המפעיל לשים לב לבעל החיים בשלב שלאחר ההליך (כלומר, התאוששות). התזמון של עצירת איזופלורן והסרת הצינור האנדוטרכאלי חייב להיעשות באופן שיטתי כדי להבטיח שהמכרסם יוכל לאוורר את עצמו. כמו כן, יש לעקוב אחר העכבר לאחר ההחלמה כדי להבטיח שסיבוכים לאחר הניתוח לא יחייבו התערבות מיידית לפני הכנסתו למתקני דיור לבעלי חיים. דוגמאות לסיבוכים אלה כוללות המותורקס, פנאומוטורקס, וחוסר היכולת לחזור להכרה לאחר הרדמה.
רוב דגמי העכברים הנוכחיים של MI דורשים לפתוח את קרום הלב כדי לנפח את ה-LAD, וכתוצאה מכך קרום הלב אינו שלם. המודל הנוכחי הוא ייחודי שכן הוא משמר את ההיבט ההומאוסטטי של החלל קרום הלב במהלך אוטם, ומכאן מספק ייצוג רלוונטי יותר מבחינה קלינית של MI. שמירה על המרחב קרום הלב מביאה למאפיינים תפקודיים משופרים של לב העכבר בהשוואה להליכים המחלקים את קרום הלב. שימור נוזל קרום הלב המקומי מספק גם יתרונות משמעותיים לאפשרויות מחקר, כמו גם לריפוי אוטם. לחץ תוך-קרום הלב הואמשמעותי 11,12, בעוד שנוזל קרום הלב מכיל חלבונים המקדמים מסלולי ריפוי לא-פיברוטיים 13. מחקרים אחרונים גילו כי מקרופאגים השוכנים בנוזל קרום הלב ממלאים גם הם תפקיד חיוני בתיקון רקמות הלבובריפוי 8. הפרוטוקול הנוכחי מספק שיטת תיוג ספציפית כדי לעקוב אחר גורלם של מקרופאגים אלה בעקבות MI. תאים אחרים בחלל קרום הלב יכולים להיות מסומנים באופן דומה כדי להעריך את תפקידם בעיצוב מחדש של הלב. מודלים של בעלי חיים המתחזקים את קרום הלב עשויים לשמר טוב יותר את המסלולים החיוניים הללו, ולהפוך אותם לייצוג מדויק יותר של הפתופיזיולוגיה של המטופלים ושל תהליכי הריפוי.
מודל זה מאפשר למשתמש לחקור ולתפעל את כל המרחב קרום הלב, תוך שהוא חוקר את מסלולי הריפוי והדלקת המורכבים המתווכים על ידי תאי קרום הלב. מודל זה מספק גם מודל אוטם מכרסמים משופר למחקר שאינו מתמקד במרחב קרום הלב. מסלולי הפגיעה של קרום הלב המשומרים מאפשרים לאוטמים להיות רלוונטיים יותר לבני אדם. המגבלות המשמעותיות של מודל זה נעוצות במיומנות המשתמש בשל אופיו הטכני. אם המנתח אינו בקיא בטיפול ברקמות ובטכניקות כירורגיות, טעויות עלולות לגרום לקרע קרום הלב או לתמותה. לבסוף, כדי למנף את היתרונות של פרוטוקול זה, משתמשים צריכים להיות מסוגלים להשתמש בשיטות הדמיה מבוססות ומתקדמות, כגון אקוקרדיוגרפיה ומיקרוסקופיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים לחשוף.
Acknowledgments
ללא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141, 139 (2020).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. 52, 2581 (2011).
- De Villiers, C., Riley, P. R. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).
- Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment. JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).
- Pfaller, M. R., et al. The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).
- Deniset, J. F., et al. Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis. Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).
- Weber, G. F. Immune targeting of the pleural space by intercostal approach. BMC Pulmonary Medicine. 15, 14 (2015).
- Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities. The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).
- Tyberg, J. V., et al. The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study. Circulation. 73, 428-432 (1986).
- Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study. The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).
- Park, D. S. J., et al. Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).
