Summary
이 프로토콜은 심낭과 그 내용물을 보존하면서 마우스에서 심근 경색을 유도하는 단계를 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 심낭과 그 내용물이 허혈성 설치류 모델 (심근 손상을 유도하는 관상 동맥 결찰)에서 필수적인 항 섬유화 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 전임상 심근 경색 모델의 대부분은 항상성 세포 환경의 손실과 함께 심낭 완전성의 파괴를 필요로합니다. 그러나 최근에는 심낭 손상을 최소화하고 심장의 상주 면역 세포 집단을 유지하는 심근 경색을 유도하는 방법론이 개발되었습니다. 관상 동맥 결찰 후 손상되지 않은 심낭 공간을 가진 마우스에서 개선 된 심장 기능 회복이 관찰되었습니다. 이 방법은 심근 경색 후 심낭 공간에서 염증 반응을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 라벨링 기술의 추가 개발은이 모델과 결합하여 섬유증을 포함하여 심장에서 리모델링을 유도하는 염증 메커니즘을 조절하는 심낭 면역 세포의 운명과 기능을 이해할 수 있습니다.
Introduction
오늘날까지 심혈관 질환(CVD)은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 인식되어 상당한 재정적 부담과환자의 삶의 질 저하를 초래합니다1. 관상 동맥 질환 (CAD)은 CVD의 하위 유형이며 사망률의 주요 원인 인 심근 경색 (MI)의 발병에 필수적인 역할을합니다. 정의에 따르면, MI는 허혈 및 저산소증의 장기간의 상태로 인한 심근 조직의 돌이킬 수없는 손상으로 인해 발생합니다. 심근 조직은 재생 능력이 부족하므로 부상은 영구적이며 처음에는 보호 할 수 있지만 궁극적으로 불리한 심장 리모델링 및 궁극적 인 심부전2에 기여하는 섬유 성 흉터로 심장 근육을 대체합니다.
CAD 환자의 관리가 지난 수십 년 동안 극적으로 개선되었지만 허혈에 이차적인 만성 심부전(CHF)은 전 세계적으로 많은 환자에게 영향을 미칩니다. 이 전염병을 예방하고 관리하기 위해서는 기본 메커니즘을보다 광범위하게 이해하고 새로운 치료법을 개발해야합니다. 또한 과거의 연구 결과는 전신 요법의 한계와 정확한 대안 개발의 필요성을 강조합니다. 인간에서 MI의 분자 후유증을 조사하는 것은 경색 조직에 접근하는 능력에 의해 영향을 받는다는 점을 감안할 때, CVD와 관련된 인간 MI 및 CHF의 특성 및 발달을 요약하는 동물 모델은 필수 불가결합니다.
이상적인 동물 모델은 구조적 및 기능적 특성에 대해 인간 장애와 매우 유사하므로 질병 병인학이 개념을 안내해야 합니다. CAD에서는 관상 동맥의 만성 죽상 경화성 협착증 또는 급성 혈전 성 폐색입니다. 관상 동맥 협착 또는 폐색을 유도하기 위해 다양한 종의 실험실 동물에서 다양한 방법이 개발되고 적용되었습니다. 이러한 전략은 크게 두 그룹으로 분류 할 수 있습니다 : (1) MI를 유도하기위한 관상 동맥의 기계적 조작 및 (2) MI로 이어지는 관상 동맥 협착을 촉진하기위한 죽상 동맥 경화증을 촉진합니다. 첫 번째 전략은 일반적으로 관상 동맥의 결찰 또는 동맥 내 스텐트 배치를 포함합니다. 두 번째 접근법은 고지방 / 콜레스테롤 식품을 포함하도록 동물의 식단을 수정하는 데 의존하는 경향이 있습니다. 이 후자의 접근법의 한계 중 일부는 관상 동맥 폐색의시기와 부위에 대한 통제력 부족을 포함합니다.
대조적으로, 동물 모델에서 MI 또는 허혈의 외과적 유도는 위치, 정확한 타이밍 및 관상동맥 사건의 범위와 같은 몇 가지 이점을 가지고 있어 보다 재현 가능한 결과를 유도합니다. 가장 널리 사용되는 방법은 왼쪽 전방 하행 관상 동맥 (LAD)의 외과 적 결찰입니다. 이러한 모델은 급성 허혈성 손상에 대한 인간의 반응과 CHF3로의 진행을 요약합니다. 처음에는 더 큰 동물에서 개발되었지만 설치류와 같은 작은 동물에 대한 LAD 수술은 기술의 발전으로 더욱 실현 가능해졌습니다4. 이러한 모델을 확립 할 때, 마우스는 상대적 가용성, 낮은 주택 비용 및 유전자 조작 능력을 포함하여 다양한 이유로 선호되었습니다.
LAD 폐색을 이용한 허혈성 심장 질환의 현대 수술 모델은 연구자가 동맥을 일시적 또는 영구적으로 결찰하기 위해 심낭을 열도록 요구합니다5. 이러한 전략은 적절한 심장 기능을 보장하기 위해 본질적으로 기계적 및 윤활 기능을 수행하는 심낭 공간의 파괴를 초래합니다. 심낭을 여는 또 다른 단점은 다양한 세포 및 단백질 성분 6,7과 함께 동물의 고유 심낭액을 잃는 것입니다. 이에 대응하여 심낭을 온전하게 유지하면서 MI를 유도하는 방법이 우리에 의해 개발되었습니다. 이러한 항상성 환경의 섭동을 최소화하는 것 외에도, 이 접근법은 MI를 유발한 후 특정 세포에 태깅하고 추적할 수 있게 한다. 또한, 이 접근법은 인간 환경에서 심근 허혈성 손상을 더 잘 나타낸다.
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Protocol
8-14주령의 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스를 이들 실험에 사용하였다. 이 프로토콜은 캘거리 대학의 동물 관리위원회로부터 윤리적 승인을 받았으며 모든 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 마우스 준비 및 수술
- 수술 도구를 소독합니다(비드 멸균기 또는 오토클레이브를 통해).
- 수술 전 체중과 진통제 용량에 대해 마우스의 무게를 잰다.
- 마우스를 4% 이소플루란과 800mL/분의 산소가 포함된 유도 상자에 넣습니다. 발가락을 꼬집고 반사가 부족한 동물을 관찰하여 마취면을 확인하십시오.
- 진통제를 피하 주사 (부 프레 노르 핀 0.1mg / kg) ( 재료 표 참조).
- 수술 중 가열된 수술 패드에 마우스를 놓고 코뿔을 통해 전달되는 3% 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 각 눈에 건조한 눈을 피하기 위해 안과 연고를 바르십시오.
- 가슴과 목 수술 부위에서 머리카락을 면도하십시오.
- 마우스의 발을 제지하고 수술대 위에 놓습니다.
- 끝이 부드러운 23G 카테터를 입과 인두를 통해 기관에 삽입하여 마우스를 삽관합니다.
- 삽관 후 110회 호흡/분의 속도, 250μL의 일회 호흡량, 4mmHg의 호기말 양압(PEEP)으로 설정된 상업용 인공호흡기( 재료 표 참조)를 사용하여 2% 이소플루란 및 100% 산소를 운반 가스로 환기시킵니다.
- 마우스를 오른쪽으로 30% 굴려 수술을 위해 가슴의 왼쪽을 배치합니다.
- 70 % 에탄올과 베타 딘을 3 번 번갈아 가며 원을 그리며 수술 부위를 청소하십시오 (재료 표 참조). 수술 부위 주위에 멸균 수술 커튼을 놓습니다.
- 가슴 피부에 2-3cm의 측면 절개를하여 왼쪽의 가슴 근육을 시각화하십시오. 정중선에서 바깥쪽으로 1cm 절개를 사용하여 대흉근과 소흉근을 절단하여 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이의 늑간근을 시각화합니다.
알림: 출혈 혈관의 소작을 통해 가슴근에서 과도한 출혈을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. - 왼쪽 늑간근을 2cm 절개하여 흉강에 공기를 도입하여 (수동 공기 이동에 의해) 심장과 폐가 수술 절개에서 떨어지도록합니다. 또한 늑간을 절개하고 출혈을 예방하기 위해 소작 장치 ( 재료 표 참조)를 사용하여 개구부를 확장하십시오.
알림: 산소와의 폭발성 반응을 피하기 위해 소작 기간 동안 인공 호흡기를 일시적으로 중단해야합니다. 심낭을 손상시키지 않도록주의하십시오. - 견인기를 사용하여 갈비뼈를 수축시켜 심장을 노출시킵니다.
- 실체 현미경으로 심낭과 밑에있는 심장을 관찰하십시오.
참고: 마우스 심낭은 심장의 혈관구조를 시각화할 수 있을 만큼 얇습니다. - 심낭 표면에 집게를 부드럽게 놓아 심낭의 움직임과 밑에있는 심장의 움직임을 줄입니다.
- 왼쪽 부속기 아래에서 출현을 추적하여 왼쪽 전방 하행 (LAD) 관상 동맥을 시각적으로 랜드 마크합니다.
- 마이크로 니들 드라이버를 사용하여 LAD 아래의 심낭을 통해 적절한 봉합사 ( 재료 표 참조)를 안내하고 봉합사는 LAD와 심낭의 다른쪽에서 나옵니다. 봉합사를 묶어 관상 동맥을 통한 혈류를 제한하고 가위를 사용하여 과도한 봉합사를 다듬습니다 (그림 1A).
알림: 관상 동맥으로의 혈류를 제한 할 때 좌심실 앞쪽 부분의 희게가 보일 것입니다. 이 절차는 영구 결찰 모델을 나타냅니다. 그러나 허혈 기간이 다른 일시적인 결찰 접근법도이 단계에서 적용될 수 있습니다. - 멸균 부위 내의 절개 부위 아래에서 24G 카테터를 가슴에 경피적으로 삽입합니다 (흉강에 들어간 후 가이드 바늘을 제거하십시오). 그런 다음 갈비뼈를 닫은 다음 적절한 봉합사 (근육을위한 테이퍼 바늘, 피부를위한 기존의 절단 바늘)를 사용하여 근육층과 피부를 닫습니다.
- 가슴이 닫히면 3mL 주사기로 부드럽게 흡입하고 흉부 압박을 사용하여 24G 카테터를 통해 흉강에서 남은 공기를 배출합니다. 공기가 제거되면 24G 카테터를 빼냅니다.
- 이소 플루 란을 1 %로 줄입니다.
- 마우스가 마취에서 회복 될 수 있도록 산소로 환기를 유지하면서 이소 플루 란을 끄십시오. 동물이 독립적으로 호흡의 징후를 보이면 입에서 23G 기관 튜브를 제거하고 마우스를 회복 케이지에 넣어 정상적인 호흡 재개를 모니터링합니다.
- 케이지의 일부를 온난화 패드에 올려 외부 열원을 제공하여 마우스가 케이지에서 회복되도록합니다.
- 수술 후 72 시간 동안 12 시간마다 진통제 (부 프레 노르 핀 0.1 mg / kg, 피하)의 유지 주사를 제공하십시오.
- 절개 및 동물의 불편 함 평가를 포함하여 7 일 동안 매일 마우스의 건강 상태를 모니터링하십시오.
참고: 이 절차(개흉술)의 침습성으로 인해 항생제 투여가 필요할 수 있습니다.
2. 심 초음파 (ECG)에 의한 심장 기능의 기능 평가
- 1.5-2% 이소플루란과 800mL/분의 산소로 전신 마취 하에 마우스를 유도하고 유지합니다.
- 가열 된 무대 플랫폼의 앙와위 위치에 마우스를 놓고 발을 ECG 리드에 부착하십시오.
- 마우스의 가슴을 면도하십시오.
- 40MHz 선형 트랜스듀서 프로브와 접촉 젤을 사용하여 심초음파 이미지를 획득하고 적절한 소프트웨어로 분석합니다( 재료 표 참조).
- 케이지를 활성 상태로 되돌리기 전에 isoflurane을 끄고 마우스가 가열 플랫폼에서 회복되도록하십시오.
참고: 심 초음파 평가는 비 침습적이므로 관상 동맥 결찰 전후의 변화를 결정하기 위해 실험 전반에 걸쳐 종단으로 수행 할 수 있습니다.
3. 섬유증 염색을 위한 심장 조직 수집
- 100 % CO2 의 흡입으로 마우스를 희생시키고 조심스럽게 심장을 해부하십시오.
알림: 가위와 집게를 사용하여 심장으로 들어가고 (대정맥, 폐정맥) 나가는 큰 혈관을 절단하여 흉강의 순환계에서 방출함으로써 달성됩니다. - 심장을 10 % 포르말린으로 최소 24 시간 동안 고정하십시오.
- 우심실, 심실 중격 및 좌심실을 통해 직선 면도날을 사용하여 샘플을 절단하여 절개가 경색 영역의 중심을 통과했는지 확인합니다. 그런 다음 샘플은 파라핀 포매를 위해 핵심 시설로 보내집니다.
- 마이크로톰으로 5μm 두께의 조직 절편을 자르고 염색을 위해 유리 슬라이드에 놓습니다.
- 상업용 크실렌과 등급이 매겨진 알코올 세척(2x 99%, 1x 95%, 1x 70%)을 탈이온수로 사용하여 탈파라핀화한 다음 재수화합니다.
- 실온에서 0.1 시간 동안 피크린산에서 2 % 시리우스 레드로 염색합니다.
- 0.5 % 아세트산으로 3 분 동안 섹션을 씻고 70 % 에탄올로 1 분 동안 헹굽니다.
- 3.4에 설명 된 세척의 역순을 사용하여 섹션을 탈수하고 에탄올 농도를 증가시키고 등급이 매겨진 다음 크실렌을 만듭니다.
- 현미경 평가를 위해 장착 용액( 재료 표 참조)으로 조직 섹션을 장착합니다.
4. 심장 및 심낭강 세척의 유세포 분석
- 효과를 내기 위해 마우스를 100%CO2 의 흡입으로 희생시켰다.
- 마우스를 등에 대고 테이프를 사용하여 팔과 다리를 수술 보드에 고정합니다.
- 흉강의 왼쪽 (실험자보기에서 오른쪽)을 조심스럽게 열고 횡격막을 중간 지점까지 절단 한 다음 흉골쪽으로 바깥 쪽 갈비뼈를 절단합니다.
알림: 큰 혈관, 특히 흉골과 평행하게 움직이는 혈관에 흠집이 생기지 않도록 하십시오. - 지혈제를 사용하여 갈비뼈를 수축시켜 밑에있는 심장과 심낭을 노출시킵니다.
알림: 심낭은 매우 약하므로 절단하는 동안 가위로 잡지 마십시오. - 좌심방과 좌심실의 교차점 근처의 심낭 공간에 삽입 된 PE-10 튜브 ( 재료 표 참조) 카테터를 사용하여 100μL의 멸균 식염수를 심낭에 주입합니다.
- 식염수가 고여서 심장의 뒤쪽에서 수집되도록하고 그 과정에서 심낭에 구멍을 뚫거나 찢어지지 않도록주의하십시오. 이 단계를 두 번 반복하고 심장을 처리하는 동안 세척액을 얼음에 놓습니다.
- 심장에 들어오고 나가는 주요 혈관(대동맥, 폐동맥, 정맥, 대정맥)을 절단하여 심장을 절제합니다. 오른쪽과 왼쪽 심방을 제거하고 심실 심장 조직의 무게를 잰다.
- 가위를 사용하여 조직을 1mm2 개의 작은 조각으로 다진 다음 450U/mL의 콜라게나제 I, 125U/mL의 콜라게나제 XI, 60U/mL의 DNase I 및 60U/mL의 히알루로니다아제를 포함하는 10mL의 소화 완충액에 37°C에서 37°C에서 1시간 동안 PBS에 넣습니다.
- 심장 조직 균질액을 70μm 세포 스트레이너( 재료 표 참조)에 통과시키고 4°C에서 5분 동안 60 x g 으로 스핀다운하여 심장 실질 세포를 제거합니다.
- 상청액을 수집하고, 단일 세포 현탁액에 대해 40μm 세포 스트레이너( 재료 표 참조)를 통과하고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 스핀다운하여 세포를 펠렛화합니다.
- 단편 결정화 가능 (Fc) 수용체 차단 및 심낭 및 심장 세포에 대한 세포 마커의 염색을 이전에 설명한 바와 같이 수행한다8.
- 유세포분석기에서 샘플을 실행합니다.
5. 흉막 공간에 대한 늑간 접근법 (ICAPS) 방법을 사용한 심낭 대 식세포 표지9
- 시작하기 전에 수술 도구(비드 멸균기 또는 오토클레이브를 통해)를 소독하고 70% 에탄올을 분사합니다.
- 1.5-2% 이소플루란과 800mL/분의 산소로 전신 마취 하에 마우스를 유도하고 유지합니다. 발가락을 꼬집고 반사가 부족한 동물을 관찰하여 마취면을 확인하십시오.
- 진통제를 피하 주사하십시오 (부 프레 노르 핀 0.1 mg / Kg).
- 수술 중 가열된 수술 패드에 마우스를 놓습니다.
- 오른쪽 전외측 흉부 부위를 면도하십시오.
- 에탄올과 베타 딘으로 수술 부위를 청소하십시오.
- 피부에 3cm 길이의 절개를하고 집게로 흉곽을 노출시킵니다.
- 5μL의 형광 비드(시중에서 판매되는 형광 마이크로스피어, 1μm, 재료 표 참조)와 45μL의 식염수를 비스듬한 팁이 있는 PE-10 튜브 주사기 카테터에 넣습니다.
- 앞서 도9와 같이 카테터를 늑간 공간으로 안내하고, 비드 용액을 천천히 주입하고 카테터를 한 동작으로 제거한다.
- 스테이플을 사용하여 피부를 닫습니다.
알림: 절개 부위의 잠재적 인 재 개방을 최소화하기 위해 봉합사 대신 스테이플이 사용됩니다. - 이소 플루 란을 끄고 마우스를 회복 케이지에 넣고 처음 24 시간 동안 합병증을 모니터링하십시오.
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Representative Results
이 수정된 관상동맥 결찰 모델은 재현성과 동물 생존을 달성하도록 최적화되었습니다. 그러나 심장에 유발 된 심각한 손상으로 인해 일부 예상 수술 중 및 수술 후 사망률이 절차와 관련이 있습니다. 표준 사망률은 일반적으로 여성 (~ 10-15 %)보다 남성 (~ 25-35 %)에서 더 높습니다.
수정 된 관상 동맥 결찰로 MI를 성공적으로 유도하는 것은 심장의 기능적 매개 변수 및 구조적 특징의 변화에 의해 분명해야합니다. 기능의 경우, 심 초음파로 평가 된 좌심실 (LV) 박출률과 같은 매개 변수의 감소는 MI 후 3-4 주 이내에 눈에 띄게됩니다 (그림 1A). 이러한 기능적 변화는 피크로시리우스 레드(PR)와 같은 조직학적 염색에 의해 평가된 바와 같이 LV의 자유벽의 현저한 섬유증을 동반해야 한다(도 1B). 이 분석을 위해, 경색을 통한 세로 단면의 사용은 경색 된 영역, 경색 주위 및 심장의 원격 영역을 표현할 수 있어야합니다.
절차 전반에 걸쳐 손상되지 않은 심낭을 유지하면 심낭에서 동시 염증 반응을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한이 구획 내의 면역 세포가 지속적인 리모델링 과정에 어떻게 기여할 수 있는지 결정할 수 있습니다. 형광 비드 라벨링 방법과 유세포 분석 분석을 결합하면 선택성이 높은 상주 Gata6+ 심낭 대식세포(GPCM)를 추적하는 한 가지 접근 방식을 제공합니다. 이 절차는 구슬을 흉막 공간에 직접 주입하는 것을 포함합니다. 이들은 흉막 및 심낭 충치 (도 2A) 모두에서 상주 Gata6 대 식세포에 의해 동등하게 흡수되는데,이 두 충치 사이의 통신으로 인해 (그림 2A). 중요한 것은 심장이나 혈액에서 라벨링이 거의 또는 전혀 감지되지 않아야 한다는 것입니다(그림 2A). 일단 표지되면, MI와 같은 염증 문제에 따른 세포의 재배치는 유세포 분석 (그림 2B) 및 / 또는 영상에 의해 추적 될 수있다. ICAPS 절차로 인한 잠재적 인 염증 효과를 피하기 위해이 라벨링은 후속 개입 1 주일 전에 수행해야합니다.
그림 1: 온전한 심낭 관상동맥 결찰 모델은 심장의 기능적 및 구조적 변화를 유도합니다. (A) 심낭이 파괴되거나 손상되지 않은 동물에 대한 기준선 또는 관상 동맥 결찰 후 4 주에서의 개략적 타임 라인 및 LV 박출 분율 정량화. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. ***= p < 0.001, *= p < 0.05 대 기준선, 일원 분산 분석. Deniset JF, et al.에서 Elsevier8의 허가를 받아 발췌. (b) 파쇄되거나 손상되지 않은 심낭 관상동맥 결찰 모델을 사용한 경색 후 4주에 마우스 심장 단면에서 picrosirius 적색 섬유증 염색의 대표적인 이미지 및 정량화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MI 후 심낭 대식세포의 표지 및 추적 . (A) ICAPS 방법을 사용하여 형광 비드를 국소 주사한 후 기준선 또는 7일째에 흉강, 심낭강, 심장 조직 및 혈액의 골수성 세포를 포함하는 형광 비드의 대표적인 유세포분석 플롯. 하단 패널- 심낭의 비드와 세포를 주로 Gata6+ 심낭 대식세포(GPCM)로 특성화합니다. (B) MI가 있거나 없는 심낭 및 심장에서 형광 비드 표지된 심낭 골수 세포의 유세포분석 및 정량화. *= p < 0.05, ** = p < 0.01. Deniset JF, et al.에서 Elsevier8의 허가를 받아 발췌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설치류의 닫힌 심낭에서 MI를 유도하는 것은 독특하며 잠재적으로 중요한 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. 이 절차는 설치류 모델과 설치류 심장 해부학에 대한 외과 의사의 친숙함에 크게 의존합니다. 성공은 또한 늑간 근육 절개 및 갈비뼈 수축 (1.11-1.13 단계), 경색 생성 (1.17 단계) 및 동물 회복 (1.22-1.24 단계)의 세 가지 중요한 단계에서 제공되는 치료에 달려 있습니다.
개흉술은 심낭에 구멍을 뚫거나 찢어지지 않도록 부지런히 수행해야합니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 경색을 유도하기 위해 LAD를 봉합하는 것입니다. 모든 LAD 결찰 모델의 경우와 마찬가지로, LAD에 결찰 봉합사의 적절한 배치가 중요합니다: 근위 결찰은 치명적인 MI를 초래할 수 있는 반면, 원위 결찰은 기능적으로 관련된 MI를 유발하지 않을 수 있습니다. 심장의 대략적인 중심에 LAD를 표시하면 이러한 문제를 피할 수 있습니다. LAD 결찰은 심장 박동과 함께 수행되므로 집게로 심장을 부드럽게 안정화하면 움직임을 최소화하여 LAD를 손상시키지 않고 봉합할 수 있습니다. 심 외막의 작은 혈관 열상은이 과정에서 발생할 수 있습니다. 경미한 출혈은 2-3 일에 걸쳐 해결되며 심낭액을 오염시키지 않습니다. 설치류 심낭, 특히 생쥐의 경우 매우 얇으며 외과 의사가주의를 기울이지 않으면 쉽게 찢어 질 수 있습니다. 마지막으로, 작업자는 시술 후 (즉, 회복) 단계에서 동물에 세심한주의를 기울여야합니다. 이소 플루 란을 멈추고 기관 내 튜브를 제거하는시기는 설치류가자가 환기 할 수 있도록 체계적으로 수행되어야합니다. 또한 회복 후 마우스를 모니터링하여 수술 후 합병증으로 인해 동물 사육 시설에 투입되기 전에 즉각적인 개입이 필요하지 않은지 확인해야 합니다. 이러한 합병증의 예로는 혈흉, 기흉 및 마취 후 의식을 회복 할 수 없음이 있습니다.
MI의 대부분의 현재 마우스 모델은 LAD를 결찰하기 위해 심낭을 열어야 하므로 손상되지 않은 심낭이 됩니다. 본 모델은 경색 동안 심낭 공간의 항상성 측면을 보존하기 때문에 독특하며, 따라서 MI의 보다 임상적으로 관련성이 높은 표현을 제공한다. 심낭 공간을 유지하는 것은 심낭을 분할하는 절차에 비해 마우스 심장의 기능적 특성을 개선시킨다. 천연 심낭액의 보존은 또한 경색 치유뿐만 아니라 연구 가능성에 상당한 이점을 제공합니다. 심낭 내 압력은 유의한반면11,12, 심낭액에는 비 섬유 성 치유 경로 13을 촉진하는 단백질이 포함되어 있습니다. 최근 연구에 따르면 심낭액에 상주하는 대식세포도 심장 조직 복구및 치유에 필수적인 역할을 합니다8. 현재 프로토콜은 MI 후 이러한 대식세포의 운명을 추적하기 위한 특정 라벨링 방법을 제공합니다. 심낭 공간 내의 다른 세포는 심장 리모델링에서 그들의 역할을 평가하기 위해 유사하게 표지 될 수있다. 심낭을 유지하는 동물 모델은 이러한 중요한 경로를 더 잘 보존하여 환자의 병태생리학 및 치유 과정을 보다 정확하게 표현할 수 있습니다.
이 모델을 통해 사용자는 전체 심낭 공간을 연구하고 조작 할 수 있으므로 심낭 세포에 의해 매개되는 복잡한 치유 및 염증 경로를 탐구하는 연구를 강화할 수 있습니다. 이 모델은 또한 심낭 공간에 초점을 맞추지 않은 연구를 위해 개선된 설치류 경색 모델을 제공한다. 보존 된 심낭 손상 경로는 경색이 더 많은 인간 관련성을 가질 수있게합니다. 이 모델의 중요한 한계는 기술적 특성으로 인해 사용자 기술에 있습니다. 외과의가 조직 취급 및 수술 기술에 능숙하지 않으면 오류로 인해 심낭이 찢어지거나 사망할 수 있습니다. 마지막으로, 이 프로토콜의 장점을 활용하려면 사용자는 심초음파 및 현미경과 같은 확립된 고급 이미징 방식을 사용할 수 있어야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
References
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