Summary
Este protocolo describe los pasos para inducir el infarto de miocardio en ratones mientras se preserva el pericardio y su contenido.
Abstract
Este protocolo ha demostrado que el pericardio y su contenido juegan un papel antifibrótico esencial en el modelo de roedor isquémico (ligadura coronaria para inducir lesión miocárdica). La mayoría de los modelos preclínicos de infarto de miocardio requieren la interrupción de la integridad pericárdica con pérdida del medio celular homeostático. Sin embargo, recientemente hemos desarrollado una metodología para inducir el infarto de miocardio, que minimiza el daño pericárdico y retiene la población de células inmunes residentes del corazón. Se ha observado una mejor recuperación funcional cardíaca en ratones con un espacio pericárdico intacto después de la ligadura coronaria. Este método proporciona una oportunidad para estudiar las respuestas inflamatorias en el espacio pericárdico después del infarto de miocardio. El desarrollo adicional de las técnicas de etiquetado se puede combinar con este modelo para comprender el destino y la función de las células inmunes pericárdicas en la regulación de los mecanismos inflamatorios que impulsan la remodelación en el corazón, incluida la fibrosis.
Introduction
Hasta el día de hoy, la enfermedad cardiovascular (ECV) es reconocida como la principal causa de muerte a nivel mundial, lo que resulta en una carga financiera significativa y una reducción en la calidad de vida del paciente1. La enfermedad arterial coronaria (EAC) es un subtipo de ECV y desempeña un papel esencial en el desarrollo del infarto de miocardio (IM), que es un contribuyente principal a la mortalidad. Por definición, el IM resulta de una lesión irreversible en el tejido miocárdico debido a condiciones prolongadas de isquemia e hipoxia. El tejido miocárdico carece de capacidad de regeneración, por lo que las lesiones son permanentes y resultan en el reemplazo del músculo cardíaco con una cicatriz fibrótica que puede ser inicialmente protectora, pero que finalmente contribuye a la remodelación cardíaca adversa y eventual insuficiencia cardíaca2.
Aunque el tratamiento de los pacientes con EAC ha mejorado drásticamente en las últimas décadas, la insuficiencia cardíaca crónica (ICC) secundaria a la isquemia afecta a muchos pacientes en todo el mundo. Para prevenir y manejar esta epidemia, es necesario comprender los mecanismos subyacentes más ampliamente y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. Además, los hallazgos anteriores destacan las limitaciones de la terapia sistémica y la necesidad de desarrollar alternativas precisas. Dado que la investigación de las secuelas moleculares del IM en humanos se ve afectada por la capacidad de acceder al tejido infartado, los modelos animales que recapitulan las características y el desarrollo del IM humano y la ICC relacionados con la ECV son indispensables.
Como los modelos animales ideales se parecen mucho a un trastorno humano por sus características estructurales y funcionales, la etiología de la enfermedad debe guiar su concepción. En la EAC, es la estenosis aterosclerótica crónica de las arterias coronarias u oclusión trombótica aguda. Se han desarrollado y aplicado diferentes métodos en varias especies de animales de laboratorio para inducir el estrechamiento u oclusión de la arteria coronaria. Tales estrategias se pueden clasificar ampliamente en dos grupos: (1) manipulación mecánica de una arteria coronaria para inducir un IM y (2) aterosclerosis acelerada para facilitar el estrechamiento coronario que conduce a un IM. La primera estrategia generalmente implica la ligadura de una arteria coronaria o la colocación de un stent dentro de la arteria. El segundo enfoque tiende a depender de la modificación de la dieta del animal para incluir alimentos altos en grasa / colesterol. Algunas de las limitaciones de este último enfoque incluyen la falta de control sobre el momento y el sitio de las oclusiones coronarias.
Por el contrario, la inducción quirúrgica de IM o isquemia en un modelo animal tiene varias ventajas, como la ubicación, el momento preciso y la extensión del evento coronario, lo que lleva a resultados más reproducibles. El método más utilizado es la ligadura quirúrgica de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Tales modelos recapitulan las respuestas humanas a la lesión isquémica aguda, así como la progresión a CHF3. Inicialmente desarrollada en animales más grandes, la cirugía LAD en animales pequeños como roedores se ha vuelto más factible con los avances en la tecnología4. Al establecer tales modelos, los ratones han sido favorecidos por varias razones, incluida su disponibilidad relativa, bajo costo en vivienda y su capacidad de manipulación genética.
Los modelos quirúrgicos contemporáneos de cardiopatía isquémica que utilizan la oclusión LAD requieren que el investigador abra el pericardio para ligar temporal o permanentemente la arteria5. Tales estrategias resultan en la interrupción del espacio pericárdico, que desempeña una función esencialmente mecánica y lubricante para garantizar una función cardíaca adecuada. Otra desventaja de abrir el pericardio es perder el líquido pericárdico nativo del animal con sus diversos componentes celulares y proteicos 6,7. En respuesta, desarrollamos un método para inducir IM mientras mantenemos intacto el pericardio. Además de minimizar la perturbación de este entorno homeostático, este enfoque permite etiquetar y rastrear células específicas después de causar un IM. Además, este enfoque representa mejor la lesión isquémica miocárdica en el entorno humano.
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Protocol
Para estos experimentos se utilizaron ratones machos y hembras C57BL / 6J entre 8-14 semanas de edad. Este protocolo ha recibido la aprobación ética del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Calgary y sigue todas las pautas de cuidado de los animales.
1. Preparación y cirugía del ratón
- Esterilice las herramientas quirúrgicas (a través del esterilizador de cuentas o autoclave).
- Pesar el peso prequirúrgico del ratón y la dosis analgésica.
- Coloque el ratón en una caja de inducción con 4% de isoflurano y 800 mL/min de oxígeno. Confirme el plano anestésico pellizcando los dedos de los pies y observando al animal por falta de reflejo.
- Inyecte analgésico por vía subcutánea (0,1 mg/kg de buprenorfina) (ver Tabla de materiales).
- Coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica calentada durante la cirugía y mantenga la anestesia con isoflurano al 3% administrado a través del cono de la nariz. Aplique ungüento oftálmico para evitar la sequedad de los ojos en cada ojo.
- Afeite el cabello de las áreas quirúrgicas del pecho y el cuello.
- Sujete las patas del ratón y colóquelas en la mesa quirúrgica.
- Intubar al ratón insertando un catéter 23 G de punta lisa en la tráquea a través de la boca y la faringe.
- Ventile el ratón después de la intubación con isoflurano al 2% y oxígeno al 100% como gas portador utilizando un ventilador comercial (consulte la Tabla de materiales) ajustado a una velocidad de 110 respiraciones/min, un volumen corriente de 250 μL y una presión espiratoria final positiva (PEEP) de 4 mmHg.
- Haga rodar el ratón 30% sobre su lado derecho para colocar el lado izquierdo del pecho para la cirugía.
- Limpie el área quirúrgica con 3 exfoliantes alternos de etanol al 70% y betadina con movimientos circulares (verTabla de materiales). Coloque cortinas quirúrgicas estériles alrededor del área quirúrgica.
- Haga una incisión lateral de 2-3 cm en la piel del tórax para visualizar los músculos pectorales en el lado izquierdo. Corte el pectoral mayor y menor usando una incisión de 1 cm desde la línea media hacia afuera para visualizar los músculos intercostales entre la tercera y cuarta costilla.
NOTA: Se debe tener cuidado para evitar el sangrado excesivo del músculo pectoral a través de la cauterización de los vasos sangrantes. - Haga una incisión de 2 cm en el músculo intercostal izquierdo para introducir aire (por movimiento pasivo de aire) en la cavidad torácica para permitir que el corazón y los pulmones se desprendan de la incisión quirúrgica. Además, expanda la abertura con la ayuda de un dispositivo de cauterio (ver Tabla de materiales) para incidir el intercostal y prevenir el sangrado.
NOTA: El ventilador debe detenerse temporalmente durante el período de cauterización para evitar reacciones explosivas con oxígeno. Se tiene cuidado de no dañar el saco pericárdico. - Usando retractores, retraiga las costillas para exponer el corazón.
- Observe el pericardio y el corazón subyacente bajo un microscopio estereoscópico.
NOTA: El pericardio del ratón es lo suficientemente delgado como para visualizar la vasculatura del corazón. - Coloque suavemente fórceps en la superficie del pericardio para reducir su movimiento y el del corazón subyacente.
- Visualmente marca la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) al rastrear su emergencia desde debajo del apéndice izquierdo.
- Usando el controlador de microagujas, guíe una sutura apropiada (ver Tabla de materiales) a través del pericardio, debajo del LAD, con la sutura emergiendo en el otro lado de la LAD y el pericardio. Ate la sutura para restringir el flujo sanguíneo a través de la arteria coronaria y recorte el exceso de sutura con la ayuda de tijeras (Figura 1A).
NOTA: Al restringir el flujo sanguíneo a la arteria coronaria, el escaldado de la porción anterior del ventrículo izquierdo debe ser visible. Este procedimiento representa un modelo de ligadura permanente. Sin embargo, también se podría aplicar un enfoque de ligadura transitoria con diferentes períodos de isquemia en esta etapa. - Debajo del sitio de la incisión dentro del área estéril, introduzca un catéter de 24 G por vía percutánea en el tórax (retire la aguja guía después de ingresar a la cavidad torácica). Luego, cierre las costillas seguidas de las capas musculares y la piel con una sutura adecuada (una aguja cónica para el músculo, una aguja de corte convencional para la piel).
- Una vez cerrado el tórax, evacuar el aire restante de la cavidad torácica a través del catéter 24 G mediante una succión suave con una jeringa de 3 ml y compresiones torácicas. Una vez retirado el aire, retire el catéter 24 G.
- Reducir el isoflurano al 1%.
- Apague el isoflurano mientras mantiene la ventilación con oxígeno para permitir que el ratón se recupere de la anestesia. Una vez que el animal muestre signos de respiración independiente, retire el tubo traqueal de 23 G de la boca y coloque al ratón en una jaula de recuperación para ser monitoreado para la reanudación de la respiración normal.
- Permita que el ratón se recupere en la jaula con una parte de la jaula colocada en una almohadilla de calentamiento para proporcionar una fuente de calor externa.
- Proporcionar inyecciones de mantenimiento de analgésico (Buprenorfina 0,1 mg/kg, por vía subcutánea) cada 12 h durante 72 h después de la cirugía.
- Controle el estado de salud de los ratones diariamente durante 7 días, lo que incluye evaluar las incisiones y las molestias de los animales.
NOTA: Debido a la invasividad de este procedimiento (toracotomía), puede ser necesaria la administración de antibióticos.
2. Evaluación funcional de la función cardíaca mediante ecocardiografía (ECG)
- Inducir y mantener al ratón bajo anestesia general con isoflurano al 1,5-2% y 800 mL/min de oxígeno.
- Coloque el ratón en posición supina en una plataforma de escenario calentada y fije las patas a los cables del ECG.
- Afeite el pecho del ratón.
- Adquiera imágenes de ecocardiografía utilizando una sonda de transductor lineal de 40 MHz y un gel de contacto y analícelas con el software apropiado (consulte la Tabla de materiales).
- Apague el isoflurano y permita que el ratón se recupere en la plataforma de calefacción antes de devolver la jaula a un estado activo.
NOTA: La evaluación ecocardiográfica no es invasiva y, por lo tanto, se puede realizar longitudinalmente durante todo el experimento para determinar cambios antes y después de la ligadura coronaria.
3. Recolección de tejido cardíaco para la tinción de fibrosis
- Sacrificar los ratones con inhalación de 100% deCO2 y diseccionar cuidadosamente el corazón.
NOTA: Usando tijeras y fórceps, esto se logra cortando a través de los grandes vasos que entran (vena cava, vena pulmonar) y salen (arteria pulmonar, aorta) del corazón para liberarlo del sistema circulatorio en la cavidad torácica. - Fijar el corazón en formalina al 10% durante al menos 24 h.
- Cortar muestras con una cuchilla de afeitar recta a través del ventrículo derecho, el tabique interventricular y el ventrículo izquierdo, asegurándose de que la incisión pasara por el centro de la zona del infarto. Luego, las muestras se envían a la instalación central para la incrustación de parafina.
- Corte secciones de tejido de 5 μm de espesor con un micrótomo y colóquelas en portaobjetos de vidrio para teñir.
- Deparafinar usando xileno comercial y lavados con alcohol clasificados (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) con agua desionizada, luego rehidratar.
- Tinción con rojo Sirius al 0,1% en ácido pícrico durante 2 h a temperatura ambiente.
- Lave las secciones con ácido acético al 0,5% durante 3 min y enjuague con etanol al 70% durante 1 min.
- Deshidratar las secciones utilizando el orden inverso de los lavados descritos en 3.4, con concentraciones de etanol crecientes y graduadas y luego xileno.
- Monte secciones de tejido con una solución de montaje (consulte la Tabla de materiales) para su evaluación microscópica.
4. Citometría de flujo del corazón y lavado de la cavidad pericárdica
- Sacrificar los ratones con inhalación de 100% deCO2 para que surta efecto.
- Coloque el ratón sobre su espalda y fije los brazos y las piernas a una tabla quirúrgica con cinta adhesiva.
- Abra cuidadosamente el lado izquierdo (lado derecho desde la vista del experimentador) de la cavidad torácica, comenzando cortando el diafragma hasta aproximadamente el punto medio y posteriormente cortando a través de las costillas externas hacia el esternón.
NOTA: Evite cortar los vasos sanguíneos grandes, particularmente aquellos que corren paralelos al esternón. - Retraiga las costillas usando un hemostático para exponer el corazón subyacente y el pericardio.
NOTA: El pericardio es muy frágil, así que asegúrese de no atraparlo con tijeras durante el corte. - Usando un tubo PE-10 (consulte la Tabla de materiales) insertado en el espacio pericárdico cerca de la unión de la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo, inyecte 100 μL de solución salina estéril en la cavidad pericárdica.
- Permita que la solución salina se acumule y se acumule desde el lado posterior del corazón, teniendo cuidado de no perforar o desgarrar el pericardio en el proceso. Repita este paso dos veces y coloque líquido de lavado en hielo mientras procesa el corazón.
- Extirpe el corazón cortando los vasos principales (aorta, arteria pulmonar, vena y vena cava) que entran y salen del corazón. Retire las aurículas derecha e izquierda y pese el tejido cardíaco ventricular.
- Picar el tejido en piezas pequeñas de 1 mm2 con tijeras y colocar en 10 ml de tampón de digestión que contenga 450 U/ml de colagenasa I, 125 U/ml de colagenasa XI, 60 U/ml de DNasa I y 60 U/ml de hialuronidasa en PBS durante 1 h a 37 °C en un agitador orbital.
- Pasar los homogeneizados del tejido cardíaco a través de un filtro celular de 70 μm (consulte la Tabla de materiales) y girar hacia abajo a 60 x g durante 5 minutos a 4 °C para eliminar las células del parénquima cardíaco.
- Recoger el sobrenadante, pasar a través de un filtro de células de 40 μm (ver Tabla de materiales) para una suspensión de una sola celda, y girar hacia abajo a 400 x g durante 5 min a 4 °C para granular las células.
- Realizar el bloqueo del receptor cristalizable de fragmentos (Fc) y la tinción de marcadores celulares en células pericárdicas y cardíacas como se describió anteriormente8.
- Ejecute muestras en un citómetro de flujo.
5. Etiquetado de macrófagos pericárdicos utilizando el método Intercostal Approach to the Pleural Space (ICAPS)9
- Esterilice las herramientas quirúrgicas (a través de un esterilizador de cuentas o autoclave) y rocíe etanol al 70% antes de comenzar.
- Inducir y mantener al ratón bajo anestesia general con isoflurano al 1,5-2% y 800 mL/min de oxígeno. Confirme el plano anestésico pellizcando los dedos de los pies y observando al animal por falta de reflejo.
- Inyectar analgésico por vía subcutánea (Buprenorfina 0,1 mg/Kg).
- Coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica caliente durante la cirugía.
- Afeitar el área torácica anterolateral derecha.
- Limpie el área quirúrgica con etanol y betadina.
- Haga una incisión de 3 cm de largo en la piel y, con fórceps, exponga la caja torácica.
- Cargue 5 μL de perlas fluorescentes (microesferas fluorescentes disponibles comercialmente, 1 μm, consulte la Tabla de materiales) y 45 μL de solución salina en un catéter de jeringa de tubo PE-10 con una punta biselada.
- Guíe el catéter hacia el espacio intercostal como se describió anteriormente9, inyecte lentamente la solución de perlas y retire el catéter con un solo movimiento.
- Cierre la piel con grapas.
NOTA: Se utilizan grapas en lugar de suturas para minimizar la posible reapertura de la incisión. - Apague el isoflurano, coloque el ratón en la jaula de recuperación y controle las complicaciones durante las primeras 24 h.
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Representative Results
Este modelo de ligadura coronaria modificado ha sido optimizado para lograr la reproducibilidad y la supervivencia animal. Sin embargo, debido a la lesión significativa inducida en el corazón, se asocia cierta mortalidad intraoperatoria y postoperatoria esperada con el procedimiento. La mortalidad estándar es típicamente mayor en hombres (~ 25-35%) que en mujeres (~ 10-15%).
La inducción exitosa de un IM con la ligadura coronaria modificada debe ser evidente por cambios en los parámetros funcionales del corazón y las características estructurales. Para la función, las disminuciones en parámetros como la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (VI) según lo evaluado por ecocardiografía serán notables dentro de las 3-4 semanas posteriores al IM (Figura 1A). Estos cambios funcionales deben ir acompañados de fibrosis significativa de la pared libre del VI evaluada por tinción histológica como el rojo de picrosirius (PR) (Figura 1B). Para este análisis, el uso de cortes transversales longitudinales a través del infartado debe permitir la representación del área infartada, periinfarto y zonas remotas del corazón.
Mantener un pericardio intacto durante todo el procedimiento brinda la oportunidad de estudiar la respuesta inflamatoria concurrente en la cavidad pericárdica. También permite determinar cómo las células inmunes dentro de este compartimento pueden contribuir a los procesos de remodelación en curso. La combinación del método de marcado de perlas fluorescentes con el análisis de citometría de flujo proporciona un enfoque para rastrear con macrófagos pericárdicos (GPCM) Gata6+ residentes de alta selectividad. Este procedimiento consiste en inyectar perlas directamente en el espacio pleural. Estos son igualmente absorbidos por macrófagos residentes de Gata6 tanto en la cavidad pleural como pericárdica (Figura 2A) debido a la comunicación entre estas dos cavidades10. Es importante destacar que se debe detectar poco o ningún etiquetado en el corazón o la sangre (Figura 2A). Una vez marcadas, la reubicación de las células después de desafíos inflamatorios como el IM se puede rastrear mediante citometría de flujo (Figura 2B) y / o imágenes. Para evitar cualquier posible efecto inflamatorio del procedimiento ICAPS, este etiquetado debe realizarse una semana antes de las intervenciones posteriores.
Figura 1: El modelo de ligadura coronaria pericárdica intacta induce alteraciones funcionales y estructurales en el corazón. (A) Línea de tiempo esquemática y cuantificación de la fracción de eyección del VI al inicio o 4 semanas después de la ligadura coronaria para animales con pericardio interrumpido o intacto. Los datos se representan como media ± DE. ***= p < 0,001, *= p < 0,05 vs línea de base, ANOVA unidireccional. Adaptado de Deniset JF, et al., con permiso de Elsevier8. (B) Imágenes representativas y cuantificación de la tinción de fibrosis roja picrosirius en cortes transversales de corazón de ratón a las 4 semanas después del infarto con los modelos de ligadura coronaria pericárdica interrumpida o intacta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Etiquetado y seguimiento de macrófagos de la cavidad pericárdica después de IM. (A) Gráficos de citometría de flujo representativos de perlas fluorescentes que contienen células mieloides de la cavidad pleural, la cavidad pericárdica, el tejido cardíaco y la sangre al inicio o 7 días después de la inyección local de perlas fluorescentes utilizando el método ICAPS. Paneles inferiores- Caracterización de perlas y células en la cavidad pericárdica como macrófagos pericárdicos (GPCM) predominantemente Gata6+. (B) Análisis de citometría de flujo y cuantificación de células mieloides pericárdicas marcadas con perlas fluorescentes en cavidad pericárdica y corazón con o sin IM. *= p < 0,05, ** = p < 0,01. Adaptado de Deniset JF, et al., con permiso de Elsevier8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Inducir un IM en un pericardio cerrado en roedores es único y puede tener aplicaciones potencialmente significativas. El procedimiento depende en gran medida de la familiaridad del cirujano con el modelo de roedor y la anatomía cardíaca del roedor. El éxito también depende de la atención brindada durante tres pasos críticos: incisión del músculo intercostal y retracción de las costillas (Pasos 1.11-1.13), creación del infarto (Paso 1.17) y recuperación animal (Pasos 1.22-1.24).
La toracotomía debe hacerse diligentemente para evitar perforar o lacerar el pericardio. El paso más crucial de este protocolo es la sutura del LAD para inducir un infarto. Como es el caso con todos los modelos de ligadura de LAD, la colocación adecuada de la sutura de ligadura en la LAD es crítica: la ligadura proximal puede resultar en un IM fatal, mientras que la ligadura distal puede no causar un IM funcionalmente relevante. Marcar el LAD en el centro aproximado del corazón evita estos problemas. Como la ligadura de LAD se realiza con el corazón latiendo, estabilizar suavemente el corazón con fórceps puede ayudar a minimizar el movimiento, permitiendo que el LAD se suture sin dañarlo. La laceración de vasos pequeños en el epicardio puede ocurrir durante este procedimiento. Las hemorragias menores se resolverán en 2-3 días y no contaminarán el líquido pericárdico. El pericardio del roedor, especialmente en ratones, es muy delgado y puede romperse fácilmente si el cirujano no tiene precaución. Por último, el operador debe prestar mucha atención al animal en la fase posterior al procedimiento (es decir, la recuperación). El momento de detener el isoflurano y retirar el tubo endotraqueal debe hacerse metódicamente para garantizar que el roedor pueda autoventilarse. El ratón también debe ser monitoreado después de la recuperación para garantizar que no haya complicaciones postoperatorias que requieran una intervención inmediata antes de ser colocado en instalaciones de alojamiento de animales. Los ejemplos de estas complicaciones incluyen hemotórax, neumotórax y la incapacidad de recuperar la conciencia después de la anestesia.
La mayoría de los modelos actuales de ratón de IM requieren abrir el pericardio para ligar el LAD, lo que resulta en un pericardio no intacto. El presente modelo es único ya que preserva el aspecto homeostático del espacio pericárdico durante el infarto, proporcionando así una representación clínicamente más relevante de un IM. El mantenimiento del espacio pericárdico da como resultado mejores características funcionales del corazón del ratón en comparación con los procedimientos que dividen el pericardio. La preservación del líquido pericárdico nativo también proporciona beneficios significativos a las posibilidades de investigación, así como a la curación del infarto. La presión intrapericárdica es significativa11,12, mientras que el líquido pericárdico contiene proteínas que promueven vías de cicatrización no fibróticas 13. Investigaciones recientes han revelado que los macrófagos que residen en el líquido pericárdico también juegan un papel esencial en la reparación y curación del tejido cardíaco8. El protocolo actual proporciona un método de etiquetado específico para rastrear el destino de estos macrófagos después de IM. Otras células dentro del espacio pericárdico pueden etiquetarse de manera similar para evaluar su papel en la remodelación cardíaca. Los modelos animales que mantienen el pericardio pueden preservar mejor estas vías cruciales, lo que las convierte en una representación más precisa de la fisiopatología de los pacientes y los procesos de curación.
Este modelo permite al usuario estudiar y manipular todo el espacio pericárdico, potenciando la investigación que explora las complejas vías de curación e inflamación mediadas por las células pericárdicas. Este modelo también proporciona un modelo mejorado de infarto de roedores para la investigación no centrada en el espacio pericárdico. Las vías de lesión pericárdica preservadas permiten que los infartos tengan más relevancia humana. Las limitaciones significativas de este modelo radican en la habilidad del usuario debido a su naturaleza técnica. Si el cirujano no es competente en el manejo de tejidos y técnicas quirúrgicas, los errores pueden resultar en un pericardio desgarrado o mortalidad. Finalmente, para aprovechar las ventajas de este protocolo, los usuarios deben poder utilizar modalidades de imagen establecidas y avanzadas, como la ecocardiografía y la microscopía.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steri-350 Bead Sterilizer | Inotech | NC9449759 | |
| 10% Formalin | Millipore Sigma | HT501128-4L | |
| 40 µm Cell strainer | VWR | CA21008-949 | Falcon, 352340 |
| 70 µm Cell strainer | VWR | CA21008-952 | Falcon, 352350 |
| ACK Lysis Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4" | CDMV Inc | 108778 | |
| Betadine (10% povidone-iodine topical solution) | CDMV Inc | 104826 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11000-12 | |
| BNP Ophthalmic Ointment | CDMV Inc | 17909 | |
| Castroviejo Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12061-01 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| Collagenase I | Millipore Sigma | SCR103 | |
| Collagenase XI | Millipore Sigma | C7657 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle | Medtronic Canada | GL-890 | |
| Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle | Medtronic Canada | SL-1659 | |
| Curved Blunt Forceps | Fine Science Tools | FST 11009-13 | |
| Dako Mounting Medium | Agilen | CS70330-2 | |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| Ethanol, 100% | Millipore Sigma | MFCD00003568 | |
| Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle | Johnson & Johnson Inc. | 2815G | |
| Fiber-Optic Light | Nikon | 2208502 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | FST 11150-10 | |
| Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm | Polysciences, Inc. | 15702 | |
| Geiger Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments | 501293 | Model 150-ST |
| Hyaluronidase | Millipore Sigma | H4272 | |
| Isofluorane Vaporizer | Harvard Apparatus | 75-0951 | |
| Isoflurane USP, 250 mL | CDMV Inc | 108737 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-20 | |
| MX550D- 40 MHz probe | Fujifilm- Visual Sonics | ||
| Needle Driver | Fine Science Tools | FST 12002-12 | |
| PE-10 Tubing | Braintree Scienctific, Inc. | PE10 50 FT | |
| Scissors | Fine Science Tools | FST 14184-09 | |
| SMZ-1B Stereo Microscope | Nikon | SMZ1-PS | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | |
| Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine)) | CDMV Inc | 124918 | controlled drug |
| Vevo 2100 Software | Fujifilm-Visual Sonics |
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