연구 결과는 복제하거나 살아있는 세포를 사용하지 않고 합성 유전자 단편에서 단백질 검열 캠페인을 위한 DNA의 큰 (μg-mg) 양을 만들기 위한 프로토콜을 기술합니다. 최소 템플릿은 효소적으로 소화되고 원형화된 다음, 이더스말 롤링 서클 증폭을 사용하여 증폭됩니다. 세포 없는 발현 반응은 불정제 된 제품으로 수행 될 수있다.
이 프로토콜은 최소한의 DNA 템플릿의 설계와 효소 증폭을 위한 단계를 설명하며, 세포 없는 발현을 사용하여 24시간 이내에 분석 가능한 단백질의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 합니다. 공급 업체로부터 DNA를 받은 후 유전자 단편은 PCR 증폭, 절단, 원형 및 저온 뱅크입니다. 소량의 뱅크된 DNA는 이더스롤링 원 증폭(RCA)을사용하여 현저하게 희석되고 증폭됩니다(최대 106x). RCA는 시작 물질의 피코그램 수준에서 최소한의 발현 템플릿의 마이크로그램 양을 얻을 수 있습니다 (모든 시작 합성 단편이 사용되는 경우 mg 수준). 이 작품에서 시작량은 20pg로 최종 제품의 4μg을 초래했습니다. 생성된 RCA 제품(최소 템플릿의 컨카퍼)은 정화 단계가 없는 세포 없는 반응에 직접 추가할 수 있다. 이 방법은 전적으로 PCR 기반이기 때문에 자동화된 액체 처리 시스템과 결합될 때 미래의 고처리량 선별 작업을 가능하게 할 수 있습니다.
세포 없는 유전자 발현(CFE)은 많은 응용분야와 함께 강력한 도구로 부상하고 있다. 이러한 응용 분야에는질병 검출1, 2,3,4,5,6,미량 영양소 및 소분자 검출7,8,9,10,11,12,바이오 제조13,14,15,16,17 ,18,교육19,20,21,제조 어려운 단백질17,22,23,24,25,26,27,및 변종 스크리닝23,28,29,30, 31,32 ,33. 이는 셀 프리 시스템의 개방적 특성과 그들이 부여하는 유연성 때문입니다. 많은 훌륭한 리뷰 기사는 기술34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44에대한 역사적 교육과 미래의관점을제공합니다.
전형적인 세포 없는 반응은 세포 추출물, 에너지 혼합 및 유전 템플릿의 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 활성 세포 추출물은 전사 및 번역(TXTL)에 필요한 모든 기계를 포함하고 있으며36의다양한 방법으로 처리될 수 있다. 에너지 믹스의 글리코리틱 중급자, 전해질, 아미노산 및 보조인은 TXTL 공정을 지원합니다. 그것은 세포 없는 실험에 있는 가변성의 주요 근원이고45 및 여러 가지 방법으로 제조될 수 있다34,46. 전통적인 복제 방법은 우수한 발현 특성을 가진 플라스미드를 초래하기 때문에 유전 템플릿의 준비는 적은 개선을 보았다. 이러한 전통적인 방법의 단점은 이를 구성하고 전파하는 데 필요한 처리 시간과 생물학적 전문 지식의 양입니다. 최근 최적화 노력으로 인해 에너지 믹스준비49,50과병행하여 수행할 수 있는 세포 추출물준비(47,48)를 위한 간단한 24시간 워크플로우가 발생했습니다. 그러나, 기존의 복제는 CFE 프로토타이핑 타임라인(표1)23에여러 일을 추가한다. 상용 유전자 단편으로부터 PCR 제품을 빠르게 증폭시키는 것은 직접사용할수 있지만, 이는 약 5개의 반응(전통적인 15μL 부피)에 해당하는 DNA의 1μg만 생성되기 때문에 프로토타이핑 실험의 수를 제한한다. 이러한 순환화 및 이더스말 증폭의 추가 단계로, DNA의 밀리그램 수량보다 큰 (~5,000 반응 1 mg). 이것은 극적으로 단백질의 높은 처리량 검열 또는 조합 효소 네트워크 (세포 없는 신진 대사 공학)에서 만들어질 수 있는 시험의 수를 증가시킵니다; 또한 선형 템플릿 라이브러리를 고농도 DNA로 효과적으로 보존할 수 있습니다. 또한 재료 과학 응용 분야(단백질 기반 섬유 및 하이드로겔)에 필요한 대량의 단백질을 시제품화하기 위해 더 많은 양의 템플릿이 필요합니다. 선형 템플릿의 일부 제한은 BL21 DE3 Star에서 추출한 추출을 사용하거나 최근에 발견된 방법을 사용하여 선형 템플릿을 분해52,53,54로부터보호함으로써 극복할 수 있다. 그러나, 이것은 PCR 증폭을 위한 공급 업체 생산 DNA의 제한된 주식을 가진 또는 복제에 필요한 생물학 전문 지식 및 장비의 문제를 다루지 않습니다.
이 작품은 소량의 벤더 생산 유전자 단편(일반적으로 lyophilized 분말의 500-1000 ng ng)에서 얻을 수 있는 발현 템플릿의 양을 증가시키기 위해 명시적으로 설계된 프로토콜을 제시한다. 설명된 방법은 플라스미드에서 전통적인 복제를 수행하거나 살아있는 세포에서 변환 및 전파하는 데 필요한 기술을 필요로하지 않습니다. 메일에서 유전자 단편을 받으면, 사용자는 이더스럽 롤링 원 증폭(RCA)(도 1)23을사용하여 많은 세포 없는 반응에 대한 충분한 템플릿을 생성할 수 있다. 공급 업체로부터 받은 DNA의 양은 제한된 선별 노력에 충분할 수 있지만, 신속하게 고갈되고 유전자 조각을 다시 구입하는 것은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 듭니다. 이 방법은 또한 대장균에서 독성이 있고 복제하기 어려운 유전자에 특히 적합합니다.
관심의 유전자는 원하는 단백질이 될 수 있지만, 이 방법의 새로운 채택자를위한 웰 플레이트 판독기에서 실시간 또는 엔드 포인트 판독을위한 편리한 리포터로서 형광 단백질로 시작하는 것이 가장 좋습니다. 새로운 단백질 서열의 경우 원하는 단백질의 아미노산 서열을 복사하여 원하는 코돈 최적화도구(61,62)에붙여 넣습니다. 코돈 최적화 도구에는 …
The authors have nothing to disclose.
저자는 NIH 1R35GM138265-01 및 NSF 2029532 이 프로젝트의 부분적인 지원을 인정합니다.
Alaline | Formedium | DOC0102 | |
Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
Arginine | Formedium | DOC0106 | |
Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
CMP | Sigma | C1006 | |
Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
dNTPs | NEB | N0447 | |
E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
Gene Fragment | IDT | ||
Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
Glycine | Formedium | DOC0138 | |
GMP | Sigma | G8377 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
HindIII-HF | NEB | R3104L | |
Histidine | Formedium | DOC0142 | |
Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
Leucine | Formedium | DOC0154 | |
Lysine | Formedium | DOC0158 | |
Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
Methionine | Formedium | DOC0166 | |
Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
NAD | Sigma | N8535 | |
NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
Proline | Formedium | DOC0174 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Serine | Formedium | DOC0178 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
Threonine | Formedium | DOC0182 | |
Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
UMP | Sigma | U6375 | |
Valine | Formedium | DOC0194 |