该研究描述了一种方案,用于在不克隆或使用活细胞的情况下从合成基因片段中创建大量(μg-mg)DNA以进行蛋白质筛选活动。将最小模板酶消化并循环化,然后使用等温滚动循环扩增进行扩增。无细胞表达反应可以用未纯化的产物进行。
该协议描述了最小DNA模板的设计以及酶扩增的步骤,从而可以使用无细胞表达在不到24小时的时间内快速对可测定的蛋白质进行原型设计。从供应商处接收DNA后,对基因片段进行PCR扩增、切割、循环和冷冻储存。然后使用等温滚动圆扩增(RCA)稀释和显着扩增少量储存的DNA(高达106x)。RCA可以从起始物质的皮克水平(如果使用所有起始合成片段,则为mg水平)产生微克量的最小表达模板。在这项工作中,起始量为20 pg导致4μg的最终产物。所得的RCA产物(最小模板的串联体)可以直接添加到无细胞反应中,无需纯化步骤。由于这种方法完全基于PCR,因此当与自动化液体处理系统结合使用时,它可能会实现未来的高通量筛选工作。
无细胞基因表达(CFE)已成为一种具有许多应用的强大工具。这些应用包括疾病检测1,2,3,4,5,6, 微量营养素和小分子检测7,8,9,10,11,12, 生物制造13,14,15,16,17 ,18, 教育19,20,21, 制造难解蛋白17,22,23,24,25,26,27, 和变异筛选23,28,29,30,31,32 ,33.这是由于无细胞系统的开放性和它们赋予的灵活性。许多伟大的评论文章提供了对技术的历史教育和未来展望34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44。
典型的无细胞反应由三个主要成分组成:细胞提取物,能量组合和遗传模板。活性细胞提取物包含转录和翻译(TXTL)所需的所有机器,并且可以以多种方式进行处理36。能量组合中的糖酵解中间体、电解质、氨基酸和辅因子支持 TXTL 过程。它是无细胞实验中变异性的主要来源45,并且可以以多种方式制备34,46。由于传统的克隆方法产生具有优异表达特性的质粒,因此遗传模板的制备得到了较少的改进。这些传统方法的缺点是构建和传播它们所需的周转时间和生物专业知识的数量。最近的优化工作已经为细胞提取物制备47,48提供了简单的24小时工作流程,可以与能量混合制备49,50并行进行。然而,传统的克隆为CFE原型设计时间增加了多天(表1)23。从商业基因片段中快速扩增的PCR产物可以直接使用51,但这限制了原型实验的数量,因为只产生1μgDNA,这对应于大约五个反应(传统的15μL体积)。通过这些额外的循环化和等温扩增步骤,DNA的量可能大于毫克(1毫克约5,000次反应)。这大大增加了在蛋白质或组合酶网络的高通量筛选(无细胞代谢工程)中可以进行的测试数量;它还允许将线性模板库有效保存为高浓度DNA。此外,需要增加模板的数量,以原型化材料科学应用所需的大量蛋白质(基于蛋白质的纤维和水凝胶)。线性模板的一些限制可以通过使用BL21 DE3 Star的提取物或使用最近发现的方法来保护线性模板免受退化52,53,54来克服。然而,这并不能解决供应商生产的用于PCR扩增的DNA库存有限或克隆所需的生物学专门知识和设备问题。
这项工作提出了一种方案,明确设计用于增加可以从供应商生产的少量基因片段(通常为500-1000ng冻干粉末)中获得的表达模板的数量。所描述的方法不需要在质粒中进行传统克隆或在活细胞中进行转化和繁殖所需的技能。在邮件中收到基因片段后,用户可以通过采用等温滚动圆扩增(RCA)(图1)23来产生足够的模板来进行许多无细胞反应。虽然从供应商处获得的DNA数量可能足以进行有限的筛选工作,但它很快就会耗尽,重新购买基因片段既耗时又昂贵。该方法也特别适用于大肠杆菌中有毒且难以克隆的基因。
目的基因可以是任何所需的蛋白质,但最好从荧光蛋白开始,作为方便的报告者,以便在孔板读数仪上进行实时或终点读数,以便新采用该方法。对于新的蛋白质序列,复制所需蛋白质的氨基酸序列并将其粘贴到所需的密码子优化工具61,62中。密码子优化工具中通常有许多可用的大肠杆菌生物和菌株,但选择一般大肠杆菌选项将是合适的?…
The authors have nothing to disclose.
作者承认NIH 1R35GM138265-01和NSF 2029532对该项目的部分支持。
Alaline | Formedium | DOC0102 | |
Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
Arginine | Formedium | DOC0106 | |
Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
CMP | Sigma | C1006 | |
Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
dNTPs | NEB | N0447 | |
E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
Gene Fragment | IDT | ||
Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
Glycine | Formedium | DOC0138 | |
GMP | Sigma | G8377 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
HindIII-HF | NEB | R3104L | |
Histidine | Formedium | DOC0142 | |
Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
Leucine | Formedium | DOC0154 | |
Lysine | Formedium | DOC0158 | |
Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
Methionine | Formedium | DOC0166 | |
Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
NAD | Sigma | N8535 | |
NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
Proline | Formedium | DOC0174 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Serine | Formedium | DOC0178 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
Threonine | Formedium | DOC0182 | |
Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
UMP | Sigma | U6375 | |
Valine | Formedium | DOC0194 |