Summary
El estudio describe un protocolo para crear grandes cantidades (μg-mg) de ADN para campañas de detección de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sin clonar ni usar células vivas. La plantilla mínima se digiere y circula enzimáticamente y luego se amplifica mediante amplificación de círculo de rodadura isotérmica. Las reacciones de expresión libre de células podrían realizarse con el producto no purificado.
Abstract
Este protocolo describe el diseño de una plantilla de ADN mínima y los pasos para la amplificación enzimática, lo que permite la creación rápida de prototipos de proteínas ensayables en menos de 24 h utilizando la expresión libre de células. Después de recibir ADN de un proveedor, el fragmento de gen es amplificado por PCR, cortado, circularizado y crio-almacenado. Una pequeña cantidad del ADN almacenado se diluye y amplifica significativamente (hasta 106x) utilizando la amplificación isotérmica del círculo rodante (RCA). RCA puede producir cantidades de microgramos de la plantilla de expresión mínima a partir de niveles de picogramos de material de partida (niveles de mg si se utiliza todo el fragmento sintético inicial). En este trabajo, una cantidad inicial de 20 pg resultó en 4 μg del producto final. El producto RCA resultante (concatemer de la plantilla mínima) se puede agregar directamente a una reacción libre de células sin pasos de purificación. Debido a que este método está completamente basado en PCR, puede permitir futuros esfuerzos de detección de alto rendimiento cuando se combina con sistemas automatizados de manejo de líquidos.
Introduction
La expresión génica libre de células (CFE) ha surgido como una herramienta poderosa con muchas aplicaciones. Tales aplicaciones incluyen detección de enfermedades1,2,3,4,5,6, detección de micronutrientes y moléculas pequeñas7,8,9,10, 11,12, biofabricación13,14,15,16,17 ,18, educación19,20,21, fabricación de proteínasdifíciles 17,22,23,24,25,26,27, y detección devariantes 23,28,29,30,31,32 ,33. Esto se debe a la naturaleza abierta de los sistemas libres de células y la flexibilidad que confieren. Muchos grandes artículos de revisión ofrecen educación histórica y perspectivas futuras sobre la tecnología34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44.
Una reacción típica libre de células consta de tres componentes principales: extracto celular, mezcla de energía y plantilla genética. El extracto de célula activa contiene toda la maquinaria necesaria para la transcripción y traducción (TXTL) y se puede procesar de diversas maneras36. Los intermedios glicolíticos, electrolitos, aminoácidos y cofactores en la combinación de energía apoyan el proceso TXTL. Es una fuente importante de variabilidad en experimentos libres de células45 y se puede preparar de muchas maneras34,46. La preparación de la plantilla genética ha visto menos mejoras ya que los métodos tradicionales de clonación dan como resultado plásmidos con excelentes características de expresión. La desventaja de estos métodos tradicionales es el tiempo de respuesta y la cantidad de experiencia biológica necesaria para construirlos y propagarlos. Los esfuerzos de optimización recientes han dado como resultado flujos de trabajo simples de 24 horas para la preparación de extractoscelulares 47,48 que se pueden realizar en paralelo con la preparación de la mezcla energética49,50. Sin embargo, la clonación tradicional agrega varios días a la línea de tiempo de creación de prototipos de CFE (Tabla 1)23. Los productos de PCR rápidamente amplificados a partir del fragmento de gen comercial se pueden usar directamente51, pero esto limita el número de experimentos de prototipado ya que solo se produce 1 μg de ADN, lo que corresponde a aproximadamente cinco reacciones (volúmenes tradicionales de 15 μL). Con estos pasos adicionales de circularización y amplificación isotérmica, es posible cantidades superiores a miligramos del ADN (~ 5,000 reacciones por 1 mg). Esto aumenta drásticamente el número de pruebas que se pueden realizar en el cribado de alto rendimiento de proteínas o redes enzimáticas combinatorias (ingeniería metabólica libre de células); también permite la preservación efectiva de la biblioteca de plantillas lineales como ADN de alta concentración. Además, se necesitaría una mayor cantidad de plantilla para crear prototipos de grandes cantidades de proteínas necesarias para aplicaciones de ciencia de materiales (fibras e hidrogeles a base de proteínas). Algunas limitaciones de las plantillas lineales se pueden superar mediante el uso de un extracto de BL21 DE3 Star o el uso de métodos recientemente descubiertos para proteger las plantillas lineales de la degradación52,53,54. Sin embargo, esto no aborda el hecho de tener existencias limitadas de ADN producido por el proveedor para la amplificación por PCR o la cuestión de la experiencia biológica y el equipo necesario para la clonación.
Este trabajo presenta un protocolo diseñado explícitamente para aumentar la cantidad de plantilla de expresión que se puede obtener de pequeñas cantidades de fragmentos de genes producidos por el proveedor (típicamente 500-1000 ng de polvo liofilizado). El método descrito no requiere las habilidades necesarias para realizar la clonación tradicional en plásmidos o la transformación y propagación en células vivas. Al recibir un fragmento de gen por correo, un usuario puede producir suficientes plantillas para muchas reacciones libres de células mediante el empleo de amplificación isotérmica del círculo rodante (RCA) (Figura 1)23. Si bien la cantidad de ADN recibida del proveedor puede ser suficiente para los esfuerzos de detección limitados, se agota rápidamente y la recompra de fragmentos de genes lleva mucho tiempo y es costosa. El método también es especialmente adecuado para genes que son tóxicos y difíciles de clonar en E. coli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Diseño del fragmento de gen
NOTA: El fragmento de gen debe tener todos los elementos genéticos necesarios para la transcripción / traducción, incluido el promotor, el sitio de unión al ribosoma (RBS), el codón de inicio, el gen de interés y el terminador. Si bien el terminador no es necesario para una plantilla de expresión lineal (LET), será importante si el usuario decide insertar la secuencia en un plásmido. Estas secuencias fueron extraídas del plásmido pJL1-sfGFP55 (regalo del laboratorio de Michael Jewett), que utiliza un promotor T7. Además de estos elementos genéticos necesarios, se agrega un sitio de corte de enzima de restricción de seis pares de bases antes del promotor (sitio de corte de 5 ') y otros seis pares de bases después del terminador (sitio de corte de 3 '), en este caso utilizando HindIII (se pueden usar otras enzimas de restricción, pero es útil estandarizar las secuencias con una enzima de restricción de alta fidelidad para reducir el número necesario para mantener en la biblioteca). Los sitios de imprimación se agregan diez pares de bases aguas arriba del sitio de corte de 5 'y diez pares de bases aguas abajo del sitio de corte de 3 ', en este caso utilizando secuencias de imprimación M13 estandarizadas (las imprimaciones son artículos de stock de bajo costo). El sitio de la enzima de restricción y los cebadores utilizados quedan a discreción del usuario. Sin embargo, el usuario debe asegurarse de que las secuencias no estén presentes en ningún otro lugar de la plantilla (no desea crear cortes no deseados o sitios de inicio de amplificación). Las secuencias para las plantillas utilizadas en este trabajo se detallan en el material complementario. Estos pasos se utilizan para modificar desde esta plantilla base.
- Determinar el gen deseado a expresar y obtener la secuencia de aminoácidos o la secuencia genética si se ha expresado en E. coli.
- Si se trata de una secuencia de aminoácidos, realice la optimización de codones para E. coli utilizando una de las muchas herramientas estándar del proveedor56. Si utiliza la plantilla proporcionada en el suplemento, asegúrese de que la secuencia optimizada no tenga sitios de restricción HindIII (AAGCTT). En el caso de que lo haga, continúe optimizando la secuencia hasta que ya no haya un sitio HindIII.
- Copie la secuencia y péguela en la plantilla proporcionada para la Secuencia suplementaria # 1 donde se indica el gen de interés. Si expresa sfGFP, use la Secuencia suplementaria # 1 tal como está. Si expresa subtilisina, use la Secuencia Suplementaria #2 tal cual.
- Solicite la plantilla mínima y los cebadores necesarios del servicio de síntesis de ADN preferido.
2. Resuspender el fragmento de gen y los cebadores
NOTA: Al recibir el fragmento de gen, siga los protocolos del fabricante para la resuspensión o use esta guía simple para crear un stock de ADN.
- Centrifuga el tubo (300 x g durante 5 s) para recoger el pellet de ADN en la parte inferior.
- Añadir agua destilada doble (ddH2O) para hacer una concentración final de 10 ng/μL de plantilla de ADN.
- Vórtice la solución en un ajuste medio durante 5-10 s.
- Disolver todo el pellet incubando a 50 °C durante 20 min.
- Brevemente vórtice de nuevo
- Centrifugar a 300 x g durante 5 s para recoger la solución en la parte inferior del tubo.
- Conservar a -20 °C o utilizar en PCR.
- Prepare un material de imprimación de 100 μM resuspiendo los cebadores en agua libre de nucleasas. Para determinar la cantidad de agua a agregar, multiplique el número de nanomoles de imprimación liofilizada por 10. Por ejemplo, si el tubo contiene 45 nM de imprimación liofilizada, agregue 450 μL de ddH2O y vórtice la solución.
- Almacene las soluciones de imprimación a -20 °C o continúe realizando la amplificación.
3. Amplificación del fragmento de gen a través de PCR
NOTA: Decida qué kit de PCR es el adecuado para el gen de interés. Los genes más pequeños (<1.000 kb) pueden ser más susceptibles a una polimerasa Taq más barata, mientras que los genes más grandes (≥1.000 kb) pueden beneficiarse de la polimerasa de alta fidelidad para reducir los errores. Es importante tener en cuenta que esta amplificación inicial de PCR no es necesaria si el usuario no está preocupado por preservar el fragmento de gen inicial (proporciona múltiples intentos de circularización y permite estudios comparativos del producto LET vs. RCA). También es importante tener en cuenta que este LET amplificado por PCR se puede utilizar directamente en reacciones; sin embargo, como se mencionó en la introducción, sólo permitiría un número limitado de reacciones si no se tuvieran en cuenta las nuevas medidas de amplificación. La digestión y la ligadura se pueden realizar en el fragmento de gen resuspendido directamente57 (si uno está seguro, no necesitarán más LET para realizar existencias de circularización adicionales). Si este es el caso, omita la sección 3 y continúe con la sección 4. Para realizar PCR, siga estos pasos.
- Utilice las existencias de 100 μM del paso 2.8 para crear soluciones de trabajo de 10 μM. Muchos protocolos de kits de PCR requieren soluciones de imprimaciones de 10 μM.
- Programe el termociclador para que conduzca la reacción de acuerdo con los protocolos del fabricante del kit. Los diferentes kits requieren parámetros de ciclismo ligeramente variados. Para el kit enumerado en la Tabla de Materiales,las condiciones son de 94 °C para 30 s de desnaturalización inicial; 30 ciclos de 94 °C para 30 s de desnaturalización, 45 °C para 30 s de recocido por imprimación y 68 °C para 60 s de extensión; con una extensión final a 68 °C durante 5 min; y, por último, una retención indefinida de 10 °C.
- Asegúrese de seleccionar el tiempo de elongación correcto (variable dependiendo de la longitud del gen a amplificar). Tener un tiempo de elongación de 1 min por cada 1.000 pb.
- Asegúrese de introducir la temperatura de recocido correcta para los cebadores. Utilice una calculadora Tm en línea que utiliza ambos cebadores como entradas para determinar la mejor temperatura de recocido58. Una temperatura de recocido de 45 °C es suficiente cuando se utilizan imprimaciones M13.
- Al determinar el número de ciclos, consulte el protocolo del fabricante, pero 30 ciclos con mayor frecuencia resultarán en una amplificación suficiente.
- Si se realizan PCR, descongelar y vórtice los dNTP. Utilice el búfer de PCR proporcionado en el kit.
- En un solo tubo de PCR, combine todos los componentes del kit según las indicaciones del protocolo del fabricante. Para garantizar una amplificación exitosa, agregue 1 μL de material de ADN resuspendido (paso 2.6).
- Homogeneice suavemente la mezcla mediante vórtice en ajuste medio durante 5-10 s. Alternativamente, pipetee la mitad del volumen hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces hasta el vórtice.
- Realizar la reacción pcrista.
- Si el protocolo de PCR no incluyó un paso de enfriamiento final, permita que la reacción se enfríe durante 5 minutos a 10 ° C antes de retirarla para conducir la condensación al fondo del tubo.
- Purifique la reacción utilizando un kit de limpieza de PCR siguiendo las instrucciones del proveedor.
- En un tubo de 1,5 ml, agregue el tampón de unión al ADN y la muestra de PCR en una proporción de 5: 1, respectivamente.
- Transfiera esta mezcla a la columna de centrifugado y centrífuga a 16.000 x g durante 1 min. Descarta el flujo.
- Agregue 200 μL de tampón de lavado de ADN a la columna e incube a temperatura ambiente durante 1 min.
- Centrifugar durante 1 min a 16.000 x g y desechar el flujo.
- Repita los pasos 2.8.3 y 2.8.4 sin la etapa de incubación de 1 minuto.
- Centrifugar durante 1-2 minutos adicionales a 16.000 x g para eliminar cualquier búfer restante.
- Elute el ADN en 46 μL de ddH2O.
- Cuantificar el ADN purificado utilizando un espectrofotómetro.
- Almacene el ADN purificado a -20 °C o continúe con el siguiente paso.
4. Digestión y circularización
NOTA: Se puede lograr una mayor amplificación mediante la circularización del ADN seguido de RCA. Digiere el ADN para preparar la plantilla para la circularización. Esto eliminará las secuencias de imprimación y creará extremos pegajosos en los extremos 5' y 3' de la plantilla. Vuelva a unir estos extremos a través de la reacción de ligadura.
- En un tubo de PCR, combine 5 μL del tampón necesario, 20 U de HindIII y 45 μL del ADN purificado del paso 3.8.
- Homogeneiza suavemente esta mezcla con una pipeta.
- Incubar la mezcla en un termociclador durante 15 min a 37 °C.
- Inactivar con calor HindIII incubando durante 20 min a 80 °C.
- Deje que la reacción se enfríe a 10 °C antes de retirarla para llevar la condensación a la parte inferior del tubo.
- Agregue 5 μL de tampón de ligasa T4 y 800 U de ligasa T4 al ADN recién digerido.
- Use la ligasa T7, si lo desea.
- Homogeneiza suavemente esta mezcla con una pipeta.
- Incubar la mezcla durante 1 h a 25 °C para realizar la reacción de circularización.
- Purifique la reacción utilizando un kit de limpieza de PCR siguiendo las instrucciones del proveedor. Utilice el mismo protocolo detallado en el paso 3.8.
- Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro. Los valores esperados son ~20 ng/μL.
- Conservar a -20 °C o continuar con el siguiente paso.
5. Amplificación del círculo de rodadura isotérmica
NOTA: La amplificación de círculo rodante (RCA) se puede realizar utilizando un kit comercial o con componentes comprados individualmente. Seguir el protocolo del fabricante asegurará una amplificación exitosa. Los kits generalmente contienen un tampón de muestra, un tampón de reacción y una polimerasa que desplaza la hebra, como la polimerasa φ29. Se pueden combinar tubos de reacción múltiple para producir una gran cantidad de ADN para la expresión libre de células (4 μg de 20 pg de material de partida). El siguiente protocolo funciona de manera eficiente.
- En un solo tubo, combine 20 μL del tampón de muestra, 20 μL del tampón de reacción, 0,8 μL de la enzima y 1 μL de la plantilla de expresión circular (CET) del paso 4.9.
NOTA: Esto tendrá una masa total de ADN de ~ 20 ng, pero RCA puede trabajar con cantidades de picogramos, lo que permite la dilución del CET y la amplificación enzimática extrema si hay una necesidad significativa de material en el cribado de alto rendimiento. - Homogeneizar la mezcla con una pipeta y alícuota de 10 μL de la mezcla en cuatro tubos separados.
- Incubar a 30 °C durante 4-18 h.
- El calor inactiva la enzima incubando a 65 °C durante 10 min. Reduzca la temperatura a 12 °C durante 5 minutos para fomentar la condensación en la parte inferior del tubo.
NOTA: Es más fácil combinar todos los pasos de temperatura en un protocolo automatizado en un termociclador. - Diluya la solución resultante añadiendo 15 μL de ddH2O a cada tubo.
- Combine todos los tubos y agréguelos directamente a una reacción libre de células.
- Si lo desea, utilice un kit de limpieza por PCR para purificar el producto y eluirlo en 36 μL de ddH2O para cuantificar. Asegúrese de que la concentración de la plantilla sea ~100 ng/μL.
6. Reacción libre de células
Nota : realice la expresión libre de celdas mediante la combinación de búfer de energía, extracción y plantilla RCA. Una reacción típica libre de células utilizando el tampón de energía PANOx-SP consiste en 1.2 mM ATP, 0.85 mM cada uno de GMP, UMP y CMP, 30 mM fosfoenolpiruvato, 130 mM de glutamato de potasio, 10 mM de glutamato de amonio, 12 mM de glutamato de magnesio, 1.5 mM de espermidina, 1 mM de putrescina, 34 μg/mL de ácido folínico, 171 μg/mL de mezcla de ARNt de E. coli, 2 mM cada uno de 20 aminoácidos sin etiquetar, 0,33 mM NAD, 0,27 mM de coenzima A (CoA), 4 mM oxalato de potasio, 57 mM tampón HEPES-KOH (pH 7,5), 0,24% de volumen del extracto de E. coli, y cantidades variables de ADN23,49. El volumen de reacción puede variar, pero las reacciones de 15 μL pueden ahorrar en el uso de reactivos y son lo suficientemente pequeñas para su uso en una microplaca de paredes negras384 49,50.
- Si expresa una proteína fluorescente como sfGFP, prepare un lector de placas para leer a la excitación/emisión, temperatura y agitación deseadas.
- Si se utiliza una placa de 384 pocillos, alícuota 60 μL de H2O en los pozos que bordean un pozo de muestra vacío para mantener la humedad y reducir el efecto de borde.
- Agregue los diversos componentes necesarios en un tubo para cada muestra. Agregue lo suficiente para realizar triplicados. Las réplicas dentro de la placa pueden ayudar a identificar las causas de la variabilidad.
- Agregue el extracto, el amortiguador de energía y luego el ADN.
- Diluir hasta el volumen final deseado con ddH2O.
- Mezcle esta solución a fondo canalizando la mitad del volumen de la solución hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces.
- Transfiera la mezcla de reacción en alícuotas de 15 μL a los pocillos deseados en la placa de microtitulación.
- Selle la placa con una película de sellado incolora para mantener la humedad y evitar la evaporación.
- Coloque la placa sellada en el lector de placas y permita que se complete la reacción.
- Si expresa una proteína que no tiene la capacidad de ser monitoreada en vivo, use otro aparato de temperatura controlada, como un termobloqueo, para incubar la placa.
7. Ensayo de subtilisina
NOTA: Si expresa el gen bpN' de subtilisina (SBT(n)) en la Secuencia Suplementaria #2,siga este protocolo para evaluar la actividad.
- Preparar una solución madre de 10 μM de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilida en dimetilformamida (DMF).
- Ajuste un lector de placas para medir la absorbancia a 410 nm cada 20 s durante 10 minutos manteniendo una temperatura de 25 °C.
- En un fondo plano, placa incolora de 96 pocillos, alícuota 94 μL de ddH2O y 1 μL de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilida del paso 7.1.
- Agregue 5 μL de la reacción libre de células terminada del paso 6.7 y lea utilizando un lector de placas establecido en el protocolo descrito en el paso 7.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La expresión de sfGFP a partir de plantillas RCA fue comparable a la del plásmido pJL1 cuando se utilizaron solo 0,30 μL de ADN RCA no purificado en una reacción de 15 μL(Figura 2A). De hecho, duplicar y triplicar la cantidad de plantilla parece no ofrecer ningún beneficio en el extracto bl21 DE3 Star, lo que sugiere niveles ya saturados de la plantilla a 0,30 μL por reacción. Por el contrario, parece haber un beneficio en el aumento de la cantidad de plantilla RCA cuando se agrega al extracto celular procedente de la cepa SHuffle (Figura 2B)28. Para algunas proteínas, los resultados se pueden observar muy rápidamente, lo que comprime todo el flujo de trabajo (amplificación y ensayo) a menos de 24 h. Sin embargo, algunas proteínas requieren una temperatura más baja o tienen tiempos de plegado más lentos, lo que aumentará el tiempo hasta que se obtengan los resultados, pero afectará el flujo de trabajo presentado aquí. Esto se puede observar al expresar subtilisina (SBT(n)) donde el ensayo después de 4 h de expresión no fue lo suficientemente largo para la maduración de SBT(n)(Figura 3A,ejemplo de un resultado fallido). Permitir que la reacción continúe hasta 16 h puede conducir a niveles detectables de SBT(n) (Figura 3B). Esta mejora puede ser dependiente de la temperatura, como se observa en la literatura donde se exploraron condiciones de temperatura optimizadas59,60.
Figura 1: Un esquema representativo de la plantilla genética mínima y el proceso al que se somete después de la etapa inicial de amplificación por PCR. Las plantillas se digieren con HindIII, se circularizan con ligasa T4 y se amplifican aún más con φ29 polimerasa para crear grandes concatemeros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados de las reacciones libres de células con 5 nM de plásmido no purificado (pJL1), 5 nM de plantilla lineal (LET) y concentraciones variables de RCA no purificado. RCA #1, #2 y #3 contenían 0.3 μL, 0.6 μL y 0.9 μL (respectivamente) de producto RCA no purificado en una reacción de 15 μL incubada a 30 °C (n = 3). Las barras de error representan ± 1 SD de la media. El eje y es la fluorescencia, y el eje x es el tiempo que ha pasado durante la reacción. La cinética de la expresión sfGFP se representa en (A) BL21 DE3 Star y (B) T7 SHuffle. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Reacciones libres de células con 5 nM de SBT(n) LET y concentraciones variables de producto RCA no purificado. RCA ng y pg corresponden a la concentración del ADN utilizada para realizar la amplificación del círculo rodante. El producto RCA no purificado se utilizó en una reacción de 15 μL incubada a 30 °C (n = 3). Las barras de error representan ± 1 SD de la media. El eje y es la absorbancia a 410 nm, y el eje x es la cantidad de tiempo que ha pasado en el ensayo. Las reacciones se realizaron durante (A) 4 h y (B) 16 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Método de clonación | |
| PCR | 2 -4 h |
| Digestión de plásmidos | 35 minutos |
| Ligadura | 1 h |
| Transformación | 2 h |
| Incubación nocturna | 16 horas |
| Secuenciación | 24 - 48 h |
| Preparación de stock de glicerol | 16 horas |
| Crecimiento y purificación | 16 horas |
| Tiempo total | 46 - 72 h |
| RCA (método) | |
| PCR | 2 - 4 h |
| Digestión | 35 minutos |
| Ligadura | 1 h |
| RCA | 4 - 18 h |
| CFE | 4 - 16 h |
| Tiempo total | 12 - 40 h |
Tabla 1: Una comparación de la línea de tiempo entre un protocolo de clonación tradicional simplificado y el protocolo RCA cubierto en este documento.
Archivo suplementario: El archivo suplementario enumera las secuencias. La secuencia #1 es sfGFP (999 pares de bases) y la secuencia #2 es subtilisina BPN' (1344 bp). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El gen de interés puede ser cualquier proteína deseada, pero es mejor comenzar con una proteína fluorescente como un reportero conveniente para la lectura en tiempo real o de punto final en un lector de placas de pozo para los nuevos adoptantes de este método. Para nuevas secuencias de proteínas, copie la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada y péguela en la herramienta de optimización de codones deseada61,62. Por lo general, hay muchos organismos y cepas disponibles de E. coli en la herramienta de optimización de codones, pero elegir la opción general de Escherichia coli será adecuado. Después de la optimización, verifique dos veces el gen para asegurarse de que el sitio de corte previamente elegido y las secuencias de imprimación no estén presentes. Si es así, la secuencia se puede optimizar hasta que las secuencias ya no estén presentes. En algunas situaciones, puede ser necesario reemplazar los sitios de corte HindIII con un sitio de restricción diferente si la optimización repetida da como resultado consistentemente un sitio de corte HindIII interno. Es mejor usar el mismo sitio de corte con la mayor frecuencia posible para mantener el proceso estandarizado y reducir el costo de mantener múltiples enzimas de restricción a mano.
Antes de comenzar la amplificación, elija el kit de PCR que mejor se adapte al LET. Un LET con <1.000 pares de bases se puede amplificar con una polimerasa Taq simple, mientras que un LET con ≥ 1.000 pares de bases puede requerir una polimerasa de mayor fidelidad63. Configure el protocolo para la amplificación de acuerdo con el fabricante del kit y la temperatura de recocido de los cebadores deseados. La temperatura de recocido es crítica para una amplificación exitosa. Una regla general es seleccionar una temperatura de recocido que sea 5 ° C más baja que la Tm de los cebadores. Existen herramientas online gratuitas que proporcionarán una temperatura de recocido optimizada basada en la secuencia de los cebadores58. El uso de la temperatura de recocido correcta es fundamental para producir una plantilla de ADN de alta calidad.
La expresión génica libre de células ha experimentado un renacimiento en los últimos años debido a su velocidad, simplicidad y utilidad para la creación de prototipos de biología sintética. Este trabajo ha esbozado un método para aumentar la velocidad y la facilidad al probar una gran biblioteca de proteínas nuevas y funcionales. Si bien los métodos tradicionales de clonación pueden tardar días o semanas, este protocolo se puede realizar en menos de 24 h. La Tabla 1 describe los rangos de tiempo típicos tanto para la clonación tradicional como para el protocolo RCA. Tenga en cuenta que el protocolo de clonación se ha simplificado y se han omitido algunos pasos opcionales, como el aislamiento en gel. La Tabla 1 también se refiere únicamente a los protocolos comunes de digestión de restricción; hay muchos otros métodos de clonación, pero estos requieren una cantidad similar de tiempo. El rango superior de este protocolo de amplificación enzimática requiere menos tiempo que el rango inferior del método de clonación, especialmente cuando se considera una jornada laboral de 8 horas. Esto se debe en gran parte a la eliminación de las incubaciones nocturnas y la falta de confirmación de la secuenciación. El protocolo RCA se basa completamente en PCR y RCA, que requieren habilidades menos especializadas que las técnicas tradicionales de clonación, transformación y cultivo celular. Este método hace que la expresión libre de células sea accesible para los laboratorios que no tienen experiencia previa en clonación o acceso al capital necesario para transformar y cultivar células. Este método también es adecuado para proyectos centrados en proteínas citotóxicas, donde la clonación y propagación de los genes con clonación tradicional es difícil debido a la toxicidad en la célula viva. Este protocolo RCA también es capaz de amplificar cantidades muy pequeñas de ADN circular (picogramos de ADN) a los niveles necesarios para CFE. En la Figura 3B,la plantilla circularizada SBT(n) se diluyó a 20 ng/μL y 20 pg/uL antes de RCA. Si bien las tasas de degradación observadas fueron diferentes, ambas reacciones dieron como resultado la misma cantidad de degradación del sustrato en 10 minutos. El método propuesto no pretende sustituir a la clonación; La propagación de plásmidos puede producir cantidades de ADN para genes no tóxicos que no pueden ser emparejados. Más bien, esta es una herramienta de creación de prototipos conveniente en una fase de selección masiva de bibliotecas (los pasos enzimáticos son susceptibles de automatización con un controlador de fluidos estándar) que ayudaría a identificar qué secuencias deben clonarse para archivar y propagar posteriormente.
Al diseñar una reacción libre de células, hay mucha flexibilidad, pero hay algunos factores que deben tenerse en cuenta para garantizar el éxito. Las reacciones más pequeñas tienen una mayor relación área de superficie a volumen, lo cual es ideal para el intercambio de gases, pero la reacción debe cubrir completamente el fondo del pozo para mediciones precisas de fluorescencia. La temperatura de la reacción también puede variar dependiendo del gen de interés59. Hay múltiples opciones para los usuarios cuando se trata de la selección de un búfer de energía34,46. Algunas recetas son más caras que otras, pero la decisión se deja en manos del usuario. También hay muchas fuentes potenciales para el extracto de E. coli 36. Los usuarios deben familiarizarse con los protocolos de producción de extractos y decidir cuál es el mejor para sus propósitos28,48,50,64,65,66,67.
Cuando se utiliza RCA para amplificar plantillas para la expresión libre de células, la elección de la cepa bacteriana es muy importante. El perfil de expresión tiende a ser mejor que el de los LETs. La popular cepa BL21 DE3 Star maneja esto bien, con RCA funcionando ~ 1.4 veces mejor que LET y el plásmido pJL1 funcionando ~ 1.2 veces mejor que la mejor concentración de RCA(Figura 2A). Por otro lado, algunas cepas exhiben degradación de plantilla y tienen un rendimiento deficiente debido a la presencia de nucleasas nativas23,28. En este caso, parece que la cepa SHuffle se beneficia de una plantilla RCA aumentada. La literatura previa ha demostrado que el extracto de SHuffle no funciona bien con los productos de PCR, pero la mayor concentración de producto RCA no purificado utilizado en este estudio superó al plásmido pJL1(Figura 2B). La expresión de SBT(n) funcional(Figura 3)es un ejemplo de una proteína citotóxica que es convenientemente producida por células libres pero difícil de prototipar en células vivas debido a la toxicidad (incapaz de clonar esta plantilla de expresión en plásmido y propagarse en E. coli). A diferencia de sfGFP, la actividad SBT(n) no se puede observar después de sólo 4 h de expresión (Figura 3A). La señal es detectable después de 16 h de expresión y maduración (Figura 3B). El ADN no purificado utilizado en estos ejemplos provino de 100 μL, que fueron cuatro reacciones de RCA de 10 μL diluidas y combinadas. Este stock puede soportar 333 reacciones libres de células si solo se usan 0.30 μL por reacción.
La compatibilidad de las plantillas RCA con CFE debe explorarse más a fondo con varios extractos. Las complicaciones potenciales con productos lineales pueden aliviarse agregando oligos cortos que contengan la secuencia de E. coli chi o la proteína GamS52,53. La literatura sugiere que la adición de chi oligos puede proporcionar una mayor protección a las plantillas lineales que la proteína GamS53. Si se utiliza un extracto conocido por proporcionar bajos rendimientos a partir de plantillas lineales, el usuario debe analizar el costo de cada agente protector y utilizar el que mejor se adapte a sus propósitos. Otra limitación es la incapacidad de convertir las concentraciones de plantillas RCA a molaridad debido a la naturaleza del concatemer resultante. Esto significa que se puede agregar el mismo número de plantillas mínimas basadas en la masa, pero tendrán longitudes de concatemer variables, lo que podría afectar los niveles de expresión. Los autores no han encontrado que esto sea un problema en la detección / creación de prototipos, ya que los niveles de expresión promediados de cada pozo son los mismos (baja varianza), pero podrían ser un problema si se expresan en volúmenes más pequeños (por ejemplo, microgotas).
La expresión génica libre de células tiene el potencial de ser utilizada como una herramienta importante en la creación de prototipos de proteínas y en los flujos de trabajo de diseño, construcción y prueba. Sin embargo, la mayoría de los flujos de trabajo de expresión libre de células todavía dependen de los plásmidos tradicionales como plantilla genética. Esto ralentiza el proceso y evita que la expresión libre de células se utilice en toda su extensión para fines de detección / creación de prototipos. La amplificación de plantillas y posteriormente la realización de RCA pueden producir rápidamente suficientes plantillas genéticas para muchas reacciones, produciendo suficiente proteína para la caracterización posterior y las pruebas funcionales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nigel Reuel es miembro del consejo asesor científico de BigHat Biosciences Inc., una compañía que utiliza sistemas libres de células para el diseño de anticuerpos.
Acknowledgments
Los autores reconocen a NIH 1R35GM138265-01 y NSF 2029532 por el apoyo parcial de este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alaline | Formedium | DOC0102 | |
| Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
| Arginine | Formedium | DOC0106 | |
| Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
| Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
| CMP | Sigma | C1006 | |
| Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
| Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
| DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
| Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
| Gene Fragment | IDT | ||
| Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
| Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
| Glycine | Formedium | DOC0138 | |
| GMP | Sigma | G8377 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HindIII-HF | NEB | R3104L | |
| Histidine | Formedium | DOC0142 | |
| Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
| Leucine | Formedium | DOC0154 | |
| Lysine | Formedium | DOC0158 | |
| Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
| Methionine | Formedium | DOC0166 | |
| Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
| Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
| Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
| NAD | Sigma | N8535 | |
| NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
| PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
| Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
| Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
| Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
| Proline | Formedium | DOC0174 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Serine | Formedium | DOC0178 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
| TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
| Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
| Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
| Threonine | Formedium | DOC0182 | |
| Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
| Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
| UMP | Sigma | U6375 | |
| Valine | Formedium | DOC0194 |
References
- Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), Oxford, England. (2018).
- Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
- Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
- Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
- Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
- Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
- Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
- Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
- Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
- Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
- Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
- Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
- Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
- Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
- Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
- Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
- Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
- Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
- Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
- Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
- Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
- Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
- Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
- Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
- Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
- Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Addgene: pJL1. , Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021).
- IDT Codon Optimization Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021).
- Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
- New England Biolabs Tm Calculator. , Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
- Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
- Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
- Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
- Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).
