Summary
L’étude décrit un protocole pour créer de grandes quantités (μg-mg) d’ADN pour des campagnes de dépistage de protéines à partir de fragments de gènes synthétiques sans clonage ni utilisation de cellules vivantes. Le gabarit minimal est digéré et circularisé de manière enzymatique, puis amplifié à l’aide d’une amplification de cercle roulant isotherme. Des réactions d’expression sans cellules pourraient être effectuées avec le produit non purifié.
Abstract
Ce protocole décrit la conception d’un modèle d’ADN minimal et les étapes de l’amplification enzymatique, permettant le prototypage rapide de protéines testables en moins de 24 heures en utilisant l’expression sans cellule. Après avoir reçu de l’ADN d’un fournisseur, le fragment de gène est amplifié par PCR, coupé, circularisé et cryo-banc. Une petite quantité d’ADN mis en banque est ensuite diluée et amplifiée de manière significative (jusqu’à 106x) à l’aide de l’amplification isotherme du cercle roulant (RCA). RCA peut produire des quantités de microgrammes du modèle d’expression minimale à partir des niveaux de picogramme du matériau de départ (niveaux de mg si tous les fragments synthétiques de départ sont utilisés). Dans ce travail, une quantité de départ de 20 pg a donné 4 μg du produit final. Le produit RCA résultant (concatémère du gabarit minimal) peut être ajouté directement à une réaction sans cellule sans étapes de purification. Étant donné que cette méthode est entièrement basée sur la PCR, elle peut permettre de futurs efforts de criblage à haut débit lorsqu’elle est associée à des systèmes automatisés de manipulation des liquides.
Introduction
L’expression génique sans cellules (CFE) est devenue un outil puissant avec de nombreuses applications. Ces applications comprennent la détectionde maladies 1,2,3,4,5,6, la détection de micronutriments et de petites molécules7,8,9,10,11,12, biofabrication13,14,15,16,17 ,18, éducation19,20,21, fabrication de protéines difficiles17,22,23,24,25,26,27, et dépistage devariantes 23,28,29,30,31,32 ,33. Cela est dû à la nature ouverte des systèmes sans cellules et à la flexibilité qu’ils confèrent. De nombreux grands articles de synthèse offrent une éducation historique et des perspectives d’avenir sur la technologie34,35,36,37 , 38,39,40,41,42,43,44.
Une réaction typique sans cellule se compose de trois composants principaux: l’extrait cellulaire, le mélange énergétique et le modèle génétique. L’extrait de cellule active contient toutes les machines nécessaires à la transcription et à la traduction (TXTL) et peut être traité de différentes manières36. Les intermédiaires glycolytiques, les électrolytes, les acides aminés et les cofacteurs du mix énergétique soutiennent le processus TXTL. C’est une source majeure de variabilité dans les expériences sans cellules45 et peut être préparé de nombreuses façons34,46. La préparation du gabarit génétique a connu moins d’améliorations depuis que les méthodes de clonage traditionnelles aboutissent à des plasmides présentant d’excellentes caractéristiques d’expression. L’inconvénient de ces méthodes traditionnelles est le délai d’exécution et la quantité d’expertise biologique nécessaires pour les construire et les propager. Les efforts d’optimisation récents ont abouti à des flux de travail simples de 24 heures pour la préparation de l’extrait cellulaire47,48 qui peuvent être effectués en parallèle avec la préparation du mélange énergétique49,50. Cependant, le clonage traditionnel ajoute plusieurs jours à la chronologie de prototypage CFE (Tableau 1)23. Les produits pcR rapidement amplifiés à partir du fragment de gène commercial peuvent être utilisés directement51, mais cela limite le nombre d’expériences de prototypage car seulement 1 μg d’ADN est produit, ce qui correspond à environ cinq réactions (volumes traditionnels de 15 μL). Avec ces étapes supplémentaires de circularisation et d’amplification isotherme, des quantités supérieures à des milligrammes d’ADN sont possibles (~5 000 réactions pour 1 mg). Cela augmente considérablement le nombre de tests pouvant être effectués dans le criblage à haut débit de protéines ou de réseaux d’enzymes combinatoires (ingénierie métabolique sans cellule); il permet également de préserver efficacement la bibliothèque de modèles linéaires en tant qu’ADN à haute concentration. En outre, une quantité accrue de gabarit serait nécessaire pour prototyper de plus grandes quantités de protéines nécessaires aux applications de la science des matériaux (fibres à base de protéines et hydrogels). Certaines limitations des modèles linéaires peuvent être surmontées en utilisant un extrait de BL21 DE3 Star ou en utilisant des méthodes récemment découvertes pour protéger les modèles linéaires de la dégradation52,53,54. Cependant, cela ne traite pas des stocks limités d’ADN produit par les fournisseurs pour l’amplification par PCR ou de la question de l’expertise biologique et de l’équipement nécessaires au clonage.
Ce travail présente un protocole explicitement conçu pour augmenter la quantité de modèle d’expression qui peut être obtenue à partir de petites quantités de fragments de gènes produits par le fournisseur (généralement 500-1000 ng de poudre lyophilisée). La méthode décrite ne nécessite pas les compétences nécessaires pour effectuer le clonage traditionnel dans les plasmides ou la transformation et la propagation dans les cellules vivantes. En recevant un fragment de gène par la poste, un utilisateur peut produire suffisamment de modèles pour de nombreuses réactions sans cellules en utilisant l’amplification isotherme en cercle roulant (RCA) (Figure 1)23. Bien que la quantité d’ADN reçue du fournisseur puisse être suffisante pour des efforts de dépistage limités, elle est rapidement épuisée et le rachat de fragments de gènes prend du temps et coûte cher. La méthode est également particulièrement bien adaptée aux gènes toxiques et difficiles à cloner chez E. coli.
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Protocol
1. Conception du fragment de gène
REMARQUE: Le fragment de gène doit avoir tous les éléments génétiques nécessaires à la transcription / traduction, y compris le promoteur, le site de liaison des ribosomes (RBS), le codon de départ, le gène d’intérêt et le terminateur. Bien que le terminateur ne soit pas nécessaire pour un modèle d’expression linéaire (LET), il sera important que l’utilisateur décide d’insérer la séquence dans un plasmide. Ces séquences ont été extraites du plasmide pJL1-sfGFP55 (don du laboratoire de Michael Jewett), qui utilise un promoteur T7. En plus de ces éléments génétiques nécessaires, un site de coupe d’enzyme de restriction est ajouté six paires de bases avant le promoteur (site de coupe de 5') et six autres paires de bases après le terminateur (site de coupe de 3'), dans ce cas en utilisant HindIII (d’autres enzymes de restriction peuvent être utilisées, mais il est utile de normaliser les séquences avec une enzyme de restriction haute fidélité pour réduire le nombre nécessaire à conserver dans la bibliothèque). Les sites d’amorce sont ajoutés dix paires de bases en amont du site de coupe de 5' et dix paires de bases en aval du site de coupe de 3', dans ce cas en utilisant des séquences d’amorce M13 standardisées (les amorces sont des articles de stock peu coûteux). Le site d’enzyme de restriction et les amorces utilisées sont à la discrétion de l’utilisateur. Cependant, l’utilisateur doit s’assurer que les séquences ne sont présentes nulle part ailleurs dans le modèle (ne veut pas créer de coupes indésirables ou de sites d’initiation d’amplification). Les séquences des modèles utilisés dans ce travail sont détaillées dans le matériel supplémentaire. Ces étapes sont utilisées pour modifier à partir de ce modèle de base.
- Déterminer le gène souhaité à exprimer et obtenir la séquence d’acides aminés ou la séquence génétique s’il a été exprimé chez E. coli.
- S’il s’agit d’une séquence d’acides aminés, effectuez l’optimisation du codon pour E. coli à l’aide de l’un des nombreux outils standard du fournisseur56. Si vous utilisez le modèle fourni dans le supplément, assurez-vous que la séquence optimisée n’a pas de sites de restriction HindIII (AAGCTT). Dans le cas où c’est le cas, continuez à optimiser la séquence jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de site HindIII.
- Copiez la séquence et collez-la dans le modèle fourni pour la séquence supplémentaire #1 où le gène d’intérêt est indiqué. Si vous exprimez sfGFP, utilisez la séquence supplémentaire #1 telle quelle. Si vous exprimez la subtilisine, utilisez la séquence supplémentaire #2 telle quelle.
- Commandez le modèle minimal et les amorces nécessaires auprès du service de synthèse d’ADN préféré.
2. Réanimer le fragment de gène et les amorces
REMARQUE: À la réception du fragment de gène, suivez les protocoles du fabricant pour la remise en suspension ou utilisez ce guide simple pour créer un stock d’ADN.
- Centrifugez le tube (300 x g pendant 5 s) pour prélever la pastille d’ADN au fond.
- Ajouter de l’eau double distillée (ddH2O) pour obtenir une concentration finale de 10 ng/μL de gabarit d’ADN.
- Vortex la solution sur un réglage moyen pendant 5-10 s.
- Dissoudre la pastille entière en incubant à 50 °C pendant 20 min.
- Brièvement vortex à nouveau
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 s pour recueillir la solution au fond du tube.
- Conserver à -20 °C ou utiliser en PCR.
- Préparer un apprêt de 100 μM en remettant les amorces dans de l’eau sans nucléase. Pour déterminer la quantité d’eau à ajouter, multipliez le nombre de nanomoles d’apprêt lyophilisé par 10. Par exemple, si le tube contient 45 nM d’apprêt lyophilisé, ajoutez 450 μL de ddH2O et vortexez la solution.
- Conservez les solutions mères d’apprêt à -20 °C ou continuez à effectuer l’amplification.
3. Amplifier le fragment de gène par PCR
REMARQUE: Décidez quel kit de PCR convient au gène d’intérêt. Les gènes plus petits (<1 000 kb) peuvent être plus propices à une Taq polymérase moins chère, tandis que les gènes plus gros (≥1 000 kb) peuvent bénéficier d’une polymérase haute fidélité pour réduire les erreurs. Il est important de noter que cette amplification initiale par PCR n’est pas nécessaire si l’utilisateur n’est pas préoccupé par la préservation du fragment de gène initial (elle fournit de multiples tentatives de circularisation et permet des études comparatives du produit LET vs RCA). Il est également important de noter que ce LET amplifié par PCR peut être utilisé directement dans les réactions; toutefois, comme indiqué dans l’introduction, elle ne permettrait qu’un nombre limité de réactions si les étapes d’amplification supplémentaires n’étaient pas prises en compte. La digestion et la ligature peuvent être effectuées sur le fragment de gène remis en suspension directement57 (si l’on est certain, ils n’auront pas besoin de plus de LET pour effectuer des stocks de circularisation supplémentaires). Si tel est le cas, sautez l’article 3 et passez à l’article 4. Pour effectuer la PCR, procédez comme suit.
- Utilisez les stocks de 100 μM de l’étape 2.8 pour créer des solutions de travail de 10 μM. De nombreux protocoles de kit PCR nécessitent des solutions d’amorces de 10 μM.
- Programmez le cycleur thermique pour qu’il effectue la réaction conformément aux protocoles du fabricant du kit. Différents kits nécessitent des paramètres de cyclisme légèrement variés. Pour le kit listé dans le Tableau des Matériaux, les conditions sont de 94 °C pour 30 s de dénaturation initiale ; 30 cycles de 94 °C pour 30 s de dénaturation, 45 °C pour 30 s de recuit d’apprêt et 68 °C pour 60 s d’extension; avec une extension finale à 68 °C pendant 5 min; et enfin, une retenue indéfinie de 10 °C.
- Assurez-vous de sélectionner le temps d’allongement correct (variable en fonction de la longueur du gène à amplifier). Avoir un temps d’allongement de 1 min pour chaque 1 000 pb.
- Assurez-vous d’entrer la bonne température de recuit pour les apprêts. Utilisez un calculateur Tm en ligne qui utilise les deux amorces comme entrées pour déterminer la meilleure température de recuit58. Une température de recuit de 45 °C est suffisante lors de l’utilisation d’apprêts M13.
- Pour déterminer le nombre de cycles, reportez-vous au protocole du fabricant, mais 30 cycles entraîneront le plus souvent une amplification suffisante.
- Si vous effectuez une PCR, décongelez et vortexez les dNTP. Utilisez le tampon PCR fourni dans le kit.
- Dans un seul tube PCR, combinez tous les composants du kit comme indiqué dans le protocole du fabricant. Pour assurer une amplification réussie, ajoutez 1 μL de stock d’ADN remis en suspension (étape 2.6).
- Homogénéiser doucement le mélange en vortexant sur le réglage moyen pendant 5-10 s. Alternativement, pipettez la moitié du volume vers le haut et vers le bas 10-20 fois pour vortex.
- Effectuez la réaction PCR.
- Si le protocole PCR n’incluait pas d’étape de refroidissement finale, laissez la réaction refroidir pendant 5 min à 10 °C avant de la retirer pour entraîner la condensation au fond du tube.
- Purifiez la réaction à l’aide d’un kit de nettoyage PCR en suivant les instructions du fournisseur.
- Dans un tube de 1,5 mL, ajoutez un tampon de liaison à l’ADN et un échantillon de PCR dans un rapport de 5:1, respectivement.
- Transférer ce mélange dans la colonne de spin et centrifuger à 16 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux.
- Ajouter 200 μL de tampon de lavage d’ADN à la colonne et incuber à température ambiante pendant 1 min.
- Centrifuger pendant 1 min à 16 000 x g et jeter le débit.
- Répétez les étapes 2.8.3 et 2.8.4 sans l’étape d’incubation de 1 min.
- Centrifuger pendant 1 à 2 minutes supplémentaires à 16 000 x g pour éliminer tout tampon restant.
- Éluez l’ADN dans 46 μL de ddH2O.
- Quantifiez l’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Conservez l’ADN purifié à -20 °C ou passez à l’étape suivante.
4. Digestion et circularisation
REMARQUE: Une amplification supplémentaire peut être obtenue en circularisant l’ADN suivi de RCA. Digérez l’ADN pour préparer le modèle à la circularisation. Cela supprimera les séquences d’amorce et créera des extrémités collantes aux extrémités 5' et 3' du modèle. Rattrapez ces extrémités par réaction de ligature.
- Dans un tube PCR, combiner 5 μL du tampon nécessaire, 20 U de HindIII et 45 μL de l’ADN purifié de l’étape 3.8.
- Homogénéiser doucement ce mélange avec une pipette.
- Incuber le mélange dans un cycleur thermique pendant 15 min à 37 °C.
- La chaleur inactive HindIII en incubant pendant 20 min à 80 °C.
- Laissez la réaction refroidir à 10 °C avant de la retirer pour entraîner la condensation au fond du tube.
- Ajouter 5 μL de tampon T4 ligase et 800 U de T4 ligase à l’ADN nouvellement digéré.
- Utilisez T7 ligase, si vous le souhaitez.
- Homogénéiser doucement ce mélange avec une pipette.
- Incuber le mélange pendant 1 h à 25 °C pour effectuer la réaction de circularisation.
- Purifiez la réaction à l’aide d’un kit de nettoyage PCR en suivant les instructions du fournisseur. Utilisez le même protocole que celui détaillé à l’étape 3.8.
- Quantifiez l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Les valeurs attendues sont d’environ 20 ng/μL.
- Conserver à -20 °C ou passer à l’étape suivante.
5. Amplification isotherme du cercle de roulement
REMARQUE: L’amplification du cercle roulant (RCA) peut être effectuée à l’aide d’un kit commercial ou avec des composants achetés individuellement. Suivre le protocole du fabricant assurera une amplification réussie. Les kits contiennent généralement un tampon d’échantillon, un tampon de réaction et une polymérase déplaçant le brin, telle que la polymérase φ29. Plusieurs tubes de réaction peuvent être combinés pour produire une grande quantité d’ADN pour l’expression sans cellule (4 μg à partir de 20 pg de matière première). Le protocole suivant fonctionne efficacement.
- Dans un seul tube, combiner 20 μL du tampon de l’échantillon, 20 μL du tampon de réaction, 0,8 μL de l’enzyme et 1 μL du gabarit d’expression circulaire (CET) de l’étape 4.9.
REMARQUE: Cela aura une masse totale d’ADN d’environ 20 ng, mais RCA peut fonctionner avec des quantités de picogrammes, permettant ainsi la dilution du CET et une amplification enzymatique extrême s’il y a un besoin important de matériel dans le criblage à haut débit. - Homogénéiser le mélange avec une pipette et aliquoter 10 μL du mélange en quatre tubes séparés.
- Incuber à 30 °C pendant 4-18 h.
- La chaleur inactive l’enzyme en incubant à 65 °C pendant 10 min. Réduire la température à 12 °C pendant 5 min pour favoriser la condensation au fond du tube.
REMARQUE: Il est plus facile de combiner toutes les étapes de température dans un protocole automatisé sur un cycleur thermique. - Diluer la solution obtenue en ajoutant 15 μL de ddH2O à chaque tube.
- Combinez tous les tubes et ajoutez-les directement à une réaction sans cellule.
- Si vous le souhaitez, utilisez un kit de nettoyage PCR pour purifier le produit et l’éluer dans 36 μL de ddH2O à quantifier. Assurez-vous que la concentration du gabarit est d’environ 100 ng/μL.
6. Réaction sans cellule
REMARQUE : Effectuez une expression sans cellule en combinant le tampon d’énergie, l’extrait et le modèle RCA. Une réaction typique sans cellule utilisant le tampon énergétique PANOx-SP se compose de 1,2 mM d’ATP, 0,85 mM chacun de GMP, UMP et CMP, 30 mM de phosphoénolpyruvate, 130 mM de glutamate de potassium, 10 mM de glutamate d’ammonium, 12 mM de glutamate de magnésium, 1,5 mM de spermidine, 1 mM de putrescine, 34 μg/mL d’acide folinique, 171 μg/mL de mélange d’ARNt E. coli, 2 mM chacun de 20 acides aminés non marqués, 0,33 mM de NAD, 0,27 mM de coenzyme A (CoA), 4 mM d’oxalate de potassium, 57 mM de tampon HEPES-KOH (pH 7,5), 0,24 % du volume de l’extrait d’E. coli et des quantités variables d’ADN23,49. Le volume de réaction peut varier, mais les réactions de 15 μL peuvent économiser sur l’utilisation de réactifs et sont suffisamment petites pour être utilisées dans une microplaque à paroi noire384 49,50.
- Si vous exprimez une protéine fluorescente telle que sfGFP, préparez un lecteur de plaques pour lire à l’excitation / émission, à la température et à l’agitation souhaitées.
- Si vous utilisez une plaque de 384 puits, aliquotez 60 μL deH2O dans les puits bordant un puits d’échantillon vide pour maintenir l’humidité et réduire l’effet de bord.
- Ajoutez les différents composants requis dans un tube pour chaque échantillon. Ajoutez-en assez pour effectuer des triplés. Les réplications dans la plaque peuvent aider à identifier les causes de la variabilité.
- Ajoutez l’extrait, le tampon d’énergie puis l’ADN.
- Diluer jusqu’au volume final souhaité avec ddH2O.
- Mélangez soigneusement cette solution en pipetant la moitié du volume de la solution vers le haut et vers le bas 10 à 20 fois.
- Transférer le mélange réactionnel dans des aliquotes de 15 μL dans les puits souhaités dans la plaque de microtitrage.
- Scellez la plaque avec un film d’étanchéité incolore pour maintenir l’humidité et empêcher l’évaporation.
- Placez la plaque scellée dans le lecteur de plaque et laissez la réaction se terminer.
- Si vous exprimez une protéine qui n’a pas la capacité d’être surveillée en direct, utilisez un autre appareil à température contrôlée tel qu’un thermobloc pour incuber la plaque.
7. Dosage de la subtilisine
REMARQUE: Si vous exprimez le gène BPN' (SBT(n)) de la subtilisine dans la séquence supplémentaire #2,suivez ce protocole pour tester l’activité.
- Préparer une solution mère de 10 μM de N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide dans du diméthylformamide (DMF).
- Réglez un lecteur de plaques pour mesurer l’absorbance à 410 nm toutes les 20 s pendant 10 minutes tout en maintenant une température de 25 °C.
- Dans une plaque de 96 puits incolore à fond plat, aliquote 94 μL de ddH2O et 1 μL de N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide à partir de l’étape 7.1.
- Ajouter 5 μL de la réaction sans cellule finie de l’étape 6.7 et lire à l’aide d’un lecteur de plaques défini selon le protocole décrit à l’étape 7.2.
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Representative Results
L’expression de sfGFP à partir de gabarits RCA était comparable à celle du plasmide pJL1 lorsqu’on n’utilisait que 0,30 μL d’ADN RCA non purifié dans une réaction de 15 μL(Figure 2A). En fait, doubler et tripler la quantité de gabarit ne semble offrir aucun avantage dans l’extrait d’étoile BL21 DE3, suggérant des niveaux déjà saturés du gabarit à 0,30 μL par réaction. Inversement, il semble y avoir un avantage à augmenter la quantité de gabarit RCA lorsqu’il est ajouté à l’extrait cellulaire provenant de la souche SHuffle (Figure 2B)28. Pour certaines protéines, les résultats peuvent être observés très rapidement, ce qui comprime l’ensemble du flux de travail (amplification et dosage) à moins de 24 h. Cependant, certaines protéines nécessitent une température plus basse ou ont des temps de repliement plus lents, ce qui augmentera le temps jusqu’à ce que les résultats soient obtenus, mais affectera le flux de travail présenté ici. Ceci peut être observé lors de l’expression de la subtilisine (SBT(n)) où le dosage après 4 h d’expression n’était pas assez long pour la maturation de SBT(n)(Figure 3A, exemple d’un résultat échoué). Permettre à la réaction de se poursuivre jusqu’à 16 h peut conduire à des niveaux détectables de SBT(n)(Figure 3B). Cette amélioration peut dépendre de la température, comme observé dans la littérature où des conditions de température optimisées ont été explorées59,60.
Figure 1: Schéma représentatif du gabarit génétique minimal et du processus qu’il subit après l’étape initiale d’amplification par PCR. Les gabarits sont digérés avec HindIII, circularisés avec de la ligase T4 et amplifiés avec de la polymérase φ29 pour créer de grands concatémères. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Résultats des réactions sans cellules avec 5 nM de plasmide non purifié (pJL1), 5 nM de gabarit linéaire (LET) et des concentrations variables de RCA non purifié. Les RCA #1, #2 et #3 contenaient 0,3 μL, 0,6 μL et 0,9 μL (respectivement) de produit RCA non purifié dans une réaction de 15 μL incubée à 30 °C (n = 3). Les barres d’erreur représentent ± 1 SD de la moyenne. L’axe des y est la fluorescence, et l’axe des x est le temps qui s’est écoulé pendant la réaction. La cinétique de l’expression sfGFP est représentée en (A) BL21 DE3 Star et (B) T7 SHuffle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Réactions sans cellules avec 5 nM de SBT(n) LET et des concentrations variables de produit RCA non purifié. RCA ng et pg correspondent à la concentration de l’ADN utilisé pour effectuer l’amplification du cercle roulant. Le produit RCA non purifié a été utilisé dans une réaction de 15 μL incubée à 30 °C (n = 3). Les barres d’erreur représentent ± 1 SD de la moyenne. L’axe des y est l’absorbance à 410 nm, et l’axe des x est le temps qui s’est écoulé dans le test. Les réactions ont été effectuées pendant (A) 4 h et (B) 16 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Clonage, méthode | |
| PcR | 2 -4 h |
| Digestion des plasmides | 35 min |
| Ligature | 1 h |
| Transformation | 2 h |
| Incubation de nuit | 16 h |
| Séquençage | 24 - 48 h |
| Préparation du stock de glycérol | 16 h |
| Croissance et purification | 16 h |
| Temps total | 46 - 72 h |
| RCA, méthode | |
| PcR | 2 - 4 h |
| Digestion | 35 min |
| Ligature | 1 h |
| RCA | 4 - 18 h |
| CFE | 4 - 16 h |
| Temps total | 12 - 40 h |
Tableau 1 : Comparaison de la chronologie entre un protocole de clonage traditionnel simplifié et le protocole RCA couvert ici.
Fichier supplémentaire : le fichier supplémentaire répertorie les séquences. La séquence #1 est sfGFP (999 paires de bases) et la séquence #2 est la subtilisine BPN' (1344 bp). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le gène d’intérêt peut être n’importe quelle protéine désirée, mais il est préférable de commencer avec une protéine fluorescente comme rapporteur pratique pour la lecture en temps réel ou le point final sur un lecteur de plaque de puits pour les nouveaux adoptants de cette méthode. Pour les nouvelles séquences de protéines, copiez la séquence d’acides aminés de la protéine souhaitée et collez-la dans l’outil d’optimisation du codon souhaité61,62. Il existe généralement de nombreux organismes et souches d’E. coli disponibles dans l’outil d’optimisation du codon, mais le choix de l’option générale Escherichia coli conviendra. Après optimisation, revérifiez le gène pour vous assurer que le site de coupe et les séquences d’amorce précédemment choisis ne sont pas présents. Si c’est le cas, la séquence peut être optimisée jusqu’à ce que les séquences ne soient plus présentes. Dans certaines situations, il peut être nécessaire de remplacer les sites de coupe HindIII par un site de restriction différent si une optimisation répétée aboutit systématiquement à un site de coupe HindIII interne. Il est préférable d’utiliser le même site de coupe aussi souvent que possible pour maintenir le processus standardisé et réduire le coût de garder plusieurs enzymes de restriction à portée de main.
Avant de commencer l’amplification, choisissez le kit PCR qui convient le mieux au LET. Un LET avec <1 000 paires de bases peut être amplifié avec une polymérase Taq simple tandis qu’un LET avec ≥ 1 000 paires de bases peut nécessiter une polymérase63plus fidèle. Configurez le protocole d’amplification en fonction du fabricant du kit et de la température de recuit des apprêts souhaités. La température de recuit est essentielle à une amplification réussie. Une règle générale est de choisir une température de recuit inférieure de 5 °C à la Tm des apprêts. Il existe des outils en ligne gratuits qui fourniront une température de recuit optimisée en fonction de la séquence des amorces58. L’utilisation de la bonne température de recuit est essentielle à la production d’un modèle d’ADN de haute qualité.
L’expression génique sans cellules a connu une renaissance ces dernières années en raison de sa rapidité, de sa simplicité et de son utilité pour le prototypage en biologie synthétique. Ce travail a décrit une méthode pour augmenter la vitesse et la facilité lors du test d’une grande bibliothèque de nouvelles protéines fonctionnelles. Alors que les méthodes de clonage traditionnelles peuvent prendre des jours ou des semaines, ce protocole peut être effectué en moins de 24 heures. Le tableau 1 décrit les plages de temps typiques pour le clonage traditionnel et le protocole RCA. Notez que le protocole de clonage a été simplifié et que certaines étapes facultatives ont été laissées de côté, telles que l’isolation du gel. Le tableau 1 ne fait également référence qu’aux protocoles communs de digestion de restriction; il existe de nombreuses autres méthodes de clonage, mais celles-ci nécessitent un temps similaire. La plage supérieure de ce protocole d’amplification enzymatique nécessite moins de temps que la plage inférieure de la méthode de clonage, en particulier lorsque l’on considère une journée de travail de 8 heures. Cela est dû en grande partie à la suppression des incubations de nuit et à l’absence de confirmation du séquençage. Le protocole RCA est entièrement basé sur la PCR et la RCA, qui nécessitent moins de compétences spécialisées que les techniques traditionnelles de clonage, de transformation et de culture cellulaire. Cette méthode rend l’expression sans cellule accessible aux laboratoires qui n’ont aucune expérience préalable dans le clonage ou l’accès au capital nécessaire pour transformer et cultiver des cellules. Cette méthode est également bien adaptée aux projets axés sur les protéines cytotoxiques, où le clonage et la propagation des gènes avec le clonage traditionnel sont difficiles en raison de la toxicité dans la cellule vivante. Ce protocole RCA est également capable d’amplifier de très petites quantités d’ADN circulaire (picogrammes d’ADN) aux niveaux nécessaires à la CFE. À la figure 3B,le gabarit circulaire SBT(n) a été dilué à 20 ng/μL et 20 pg/uL avant RCA. Bien que les taux de dégradation observés aient été différents, les deux réactions ont entraîné la même quantité de dégradation du substrat en 10 minutes. La méthode proposée n’est pas destinée à remplacer le clonage; La propagation des plasmides peut produire des quantités d’ADN pour des gènes non toxiques qui ne peuvent pas être appariées. Il s’agit plutôt d’un outil de prototypage pratique lors d’une phase de criblage de bibliothèque massive (les étapes enzymatiques se prêtent à l’automatisation avec un gestionnaire de fluide standard) qui aiderait à identifier les séquences à cloner pour l’archivage et la propagation ultérieure.
Lors de la conception d’une réaction sans cellule, il y a beaucoup de flexibilité, mais certains facteurs doivent être pris en considération pour assurer le succès. Les réactions plus petites ont un rapport surface/volume plus important, ce qui est idéal pour l’échange de gaz, mais la réaction doit couvrir complètement le fond du puits pour des mesures de fluorescence précises. La température de la réaction peut également varier en fonction du gène d’intérêt59. Il existe de multiples choix pour les utilisateurs lorsqu’il s’agit de choisir un tampon d’énergie34,46. Certaines recettes sont plus chères que d’autres, mais la décision est laissée à l’utilisateur. Il existe également de nombreuses sources potentielles d’extrait d’E. coli 36. Les utilisateurs doivent se familiariser avec les protocoles de production d’extraits et décider lequel est le mieux adapté à leurs besoins28,48,50,64,65,66,67.
Lors de l’utilisation de RCA pour amplifier les modèles d’expression sans cellule, le choix de la souche bactérienne est très important. Le profil d’expression a tendance à être meilleur que celui des LET. La populaire souche BL21 DE3 Star gère bien cela, avec RCA performant ~ 1,4 fois mieux que LET et le plasmide pJL1 performant ~ 1,2 fois mieux que la meilleure concentration RCA(Figure 2A). D’autre part, certaines souches présentent une dégradation du gabarit et fonctionnent mal en raison de la présence de nucléases natives23,28. Dans ce cas, il semble que la souche SHuffle bénéficie d’un modèle RCA accru. La littérature antérieure a montré que l’extrait de SHuffle ne fonctionne pas bien avec les produits de PCR, mais la plus forte concentration de produit RCA non purifié utilisé dans cette étude a surpassé le plasmide pJL1(Figure 2B). L’expression de SBT(n) fonctionnelle(Figure 3)est un exemple de protéine cytotoxique qui est commodément fabriquée par des cellules sans cellules mais difficile à prototyper dans des cellules vivantes en raison de la toxicité (incapable de cloner ce modèle d’expression dans le plasmide et de se propager dans E. coli). Contrairement au SFGFP, l’activité SBT(n) ne peut être observée après seulement 4 h d’expression(Figure 3A). Le signal est détectable après 16 h d’expression et de maturation (Figure 3B). L’ADN non purifié utilisé dans ces exemples provenait de 100 μL, soit quatre réactions RCA de 10 μL diluées et combinées. Ce seul stock peut supporter 333 réactions sans cellules si seulement en utilisant 0,30 μL par réaction.
La compatibilité des modèles RCA avec CFE doit être explorée plus avant avec divers extraits. Les complications potentielles avec les produits linéaires peuvent être atténuées par l’ajout d’oligos courts contenant la séquence E. coli chi ou la protéine GamS52,53. La littérature suggère que l’ajout d’oligos chi peut fournir une plus grande protection aux modèles linéaires que la protéine GamS53. S’il utilise un extrait connu pour fournir de faibles rendements à partir de modèles linéaires, l’utilisateur doit analyser le coût de chaque agent de protection et utiliser celui qui convient le mieux à ses besoins. Une autre limitation est l’incapacité de convertir les concentrations du gabarit RCA en molarité en raison de la nature du concatémère résultant. Cela signifie que l’on peut ajouter le même nombre de modèles minimaux en fonction de la masse, mais ils auront des longueurs concatémères variables, ce qui peut affecter les niveaux d’expression. Les auteurs n’ont pas trouvé que cela posait un problème dans le criblage / prototypage, car les niveaux d’expression moyens de chaque puits sont les mêmes (faible variance), mais pourraient être un problème s’ils sont exprimés en plus petits volumes (par exemple, des microgouttelettes).
L’expression génique sans cellules a le potentiel d’être utilisée comme un outil important dans le prototypage de protéines et les flux de travail de conception-construction-test. Cependant, la plupart des flux de travail d’expression sans cellules s’appuient toujours sur les plasmides traditionnels comme modèle génétique. Cela ralentit le processus et empêche l’expression sans cellule d’être utilisée au maximum à des fins de criblage / prototypage. L’amplification des modèles et l’exécution ultérieure de RCA peuvent rapidement produire suffisamment de modèles génétiques pour de nombreuses réactions, produisant suffisamment de protéines pour la caractérisation en aval et les tests fonctionnels.
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Disclosures
Nigel Reuel siège au conseil consultatif scientifique de BigHat Biosciences Inc., une société qui utilise des systèmes sans cellules pour la conception d’anticorps.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent NIH 1R35GM138265-01 et NSF 2029532 pour leur soutien partiel à ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alaline | Formedium | DOC0102 | |
| Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
| Arginine | Formedium | DOC0106 | |
| Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
| Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
| CMP | Sigma | C1006 | |
| Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
| Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
| DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
| Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
| Gene Fragment | IDT | ||
| Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
| Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
| Glycine | Formedium | DOC0138 | |
| GMP | Sigma | G8377 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HindIII-HF | NEB | R3104L | |
| Histidine | Formedium | DOC0142 | |
| Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
| Leucine | Formedium | DOC0154 | |
| Lysine | Formedium | DOC0158 | |
| Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
| Methionine | Formedium | DOC0166 | |
| Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
| Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
| Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
| NAD | Sigma | N8535 | |
| NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
| PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
| Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
| Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
| Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
| Proline | Formedium | DOC0174 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Serine | Formedium | DOC0178 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
| TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
| Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
| Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
| Threonine | Formedium | DOC0182 | |
| Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
| Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
| UMP | Sigma | U6375 | |
| Valine | Formedium | DOC0194 |
References
- Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), Oxford, England. (2018).
- Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
- Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
- Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
- Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
- Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
- Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
- Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
- Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
- Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
- Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
- Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
- Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
- Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
- Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
- Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
- Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
- Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
- Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
- Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
- Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
- Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
- Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
- Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
- Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
- Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
- Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Addgene: pJL1. , Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021).
- IDT Codon Optimization Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021).
- Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
- New England Biolabs Tm Calculator. , Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
- Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
- Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
- Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
- Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).
