В исследовании описывается протокол создания больших (мкг-мг) количеств ДНК для кампаний скрининга белка из синтетических фрагментов генов без клонирования или использования живых клеток. Минимальный шаблон ферментативно переваривается и циркулируется, а затем усиливается с помощью изотермического усиления скользящего круга. Реакции бесклеточной экспрессии могут быть выполнены с неочищенным продуктом.
Этот протокол описывает разработку минимального шаблона ДНК и этапы ферментативной амплификации, что позволяет быстро создавать прототипы анализируемых белков менее чем за 24 ч с использованием бесклеточной экспрессии. После получения ДНК от поставщика фрагмент гена амплифицируется ПЦР, разрезается, циркуляризируется и криобанкируется. Небольшое количество хранимой ДНК затем разбавляют и значительно амплируют (до 106 х)с помощью изотермической амплификации скользящего круга (RCA). RCA может давать микрограммовые количества минимального шаблона экспрессии из пикограммных уровней исходного материала (уровни mg, если используется весь исходный синтетический фрагмент). В этой работе начальное количество 20 пг привело к 4 мкг конечного продукта. Полученный продукт RCA (конкатемер минимального шаблона) может быть добавлен непосредственно в бесклеточную реакцию без этапов очистки. Поскольку этот метод полностью основан на ПЦР, он может обеспечить будущие высокопроизводительные усилия по скринингу в сочетании с автоматизированными системами обработки жидкостей.
Бесклеточная экспрессия генов (CFE) стала мощным инструментом со многими приложениями. Такие приложения включают обнаружение заболеваний1,2,3,4,5,6,обнаружение микроэлементов и малых молекул7,8,9,10,11,12,биопроизводство13,14,15,16,17 ,18, образование19,20,21, производство сложных белков17,22,23,24,25,26,27, и вариантскрининга 23,28,29,30,31,32 ,33. Это связано с открытой природой бесклеточных систем и гибкостью, которую они предоставляют. Многие замечательные обзорные статьи предлагают историческое образование и будущие перспективы технологии34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.
Типичная бесклетовая реакция состоит из трех основных компонентов: клеточного экстракта, энергетического микса и генетического шаблона. Экстракт активных клеток содержит все необходимые механизмы для транскрипции и трансляции (TXTL) и может быть обработан различными способами36. Гликолитические промежуточные продукты, электролиты, аминокислоты и кофакторы в энергетическом балансе поддерживают процесс TXTL. Он является основным источником изменчивости в бесклеточных экспериментах45 и может быть получен многими способами34,46. Подготовка генетического шаблона показала меньше улучшений, поскольку традиционные методы клонирования приводят к плазмидам с отличными характеристиками экспрессии. Недостатком этих традиционных методов является время обработки и количество биологических знаний, необходимых для их создания и распространения. Недавние усилия по оптимизации привели к простым 24-часовым рабочим процессам для подготовки экстракта клеток47,48, которые могут выполняться параллельно с подготовкой энергетического баланса49,50. Однако традиционное клонирование добавляет несколько дней к временной шкале прототипирования CFE(таблица 1)23. Быстро амплифицированные продукты ПЦР из коммерческого фрагмента гена могут быть использованы непосредственно51,но это ограничивает количество экспериментов по прототипированию, так как производится только 1 мкг ДНК, что соответствует примерно пяти реакциям (традиционные объемы 15 мкл). С этими дополнительными этапами циркуляризации и изотермической амплификации возможны количества ДНК, превышающие миллиграммы (~ 5000 реакций на 1 мг). Это резко увеличивает количество тестов, которые могут быть сделаны при высокопроизводительном скрининге белков или комбинаторных ферментных сетей (бесклеточная метаболическая инженерия); это также позволяет эффективно сохранять библиотеку линейных шаблонов в виде ДНК высокой концентрации. Кроме того, для прототипирования большего количества белка, необходимого для применения в материаловедении (белковые волокна и гидрогели), потребуется увеличение количества шаблона. Некоторые ограничения линейных шаблонов можно преодолеть, используя выдержку из BL21 DE3 Star или используя недавно открытые методы защиты линейных шаблонов от деградации52,53,54. Однако это не касается наличия ограниченных запасов ДНК, производимой поставщиками для амплификации ПЦР, или вопроса о биологическом опыте и оборудовании, необходимом для клонирования.
В этой работе представлен протокол, явно предназначенный для увеличения количества шаблона экспрессии, который может быть получен из небольших количеств фрагментов генов, продуцируемых поставщиком (обычно 500-1000 нг лиофилизированного порошка). Описанный способ не требует навыков, необходимых для выполнения традиционного клонирования в плазмидах или преобразования и распространения в живых клетках. Получив фрагмент гена по почте, пользователь может создать достаточно шаблонов для многих бесклеточных реакций, используя изотермическую амплификацию скользящего круга (RCA)(Рисунок 1)23. Хотя количество ДНК, полученное от поставщика, может быть достаточным для ограниченных усилий по скринингу, оно быстро истощается, а повторная покупка фрагментов генов занимает много времени и стоит дорого. Метод также особенно хорошо подходит для генов, которые токсичны и трудно клонируются у кишечной палочки.
Интересующим геном может быть любой желаемый белок, но лучше всего начать с флуоресцентного белка в качестве удобного репортера для считывания в режиме реального времени или конечной точки на считывателе пластин для новых пользователей этого метода. Для новых белковых последовательн…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают, что NIH 1R35GM138265-01 и NSF 2029532 для частичной поддержки этого проекта.
Alaline | Formedium | DOC0102 | |
Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
Arginine | Formedium | DOC0106 | |
Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
CMP | Sigma | C1006 | |
Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
dNTPs | NEB | N0447 | |
E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
Gene Fragment | IDT | ||
Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
Glycine | Formedium | DOC0138 | |
GMP | Sigma | G8377 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
HindIII-HF | NEB | R3104L | |
Histidine | Formedium | DOC0142 | |
Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
Leucine | Formedium | DOC0154 | |
Lysine | Formedium | DOC0158 | |
Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
Methionine | Formedium | DOC0166 | |
Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
NAD | Sigma | N8535 | |
NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
Proline | Formedium | DOC0174 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Serine | Formedium | DOC0178 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
Threonine | Formedium | DOC0182 | |
Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
UMP | Sigma | U6375 | |
Valine | Formedium | DOC0194 |