JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
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Protocol
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Bioengineering

Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos mínimos e lineares para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62728
,
1Chemical and Biological Engineering,Iowa State University

Summary

O estudo descreve um protocolo para a criação de grandes (μg-mg) quantidades de DNA para campanhas de triagem de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sem clonagem ou uso de células vivas. O modelo mínimo é digerido e circularizado e, em seguida, amplificado usando amplificação do círculo de rolamento isotérmico. Reações de expressão livre de células poderiam ser realizadas com o produto não purificado.

Abstract

Este protocolo descreve o desenho de um modelo de DNA mínimo e os passos para a amplificação enzimática, permitindo a prototipagem rápida de proteínas assayable em menos de 24 h usando a expressão livre de células. Depois de receber DNA de um fornecedor, o fragmento genético é amplificado, cortado, circularizado e crio-bancário. Uma pequena quantidade do DNA bancado é então diluída e amplificada significativamente (até 106x) usando amplificação do círculo de rolamento isotemal (RCA). A RCA pode produzir quantidades de microgramas do modelo de expressão mínima dos níveis de picograma do material inicial (níveis de mg se todos os fragmentos sintéticos iniciais forem usados). Neste trabalho, uma quantidade inicial de 20 pg resultou em 4 μg do produto final. O produto RCA resultante (concatemer do modelo mínimo) pode ser adicionado diretamente a uma reação livre de células sem etapas de purificação. Devido a este método ser inteiramente baseado em PCR, ele pode permitir futuros esforços de triagem de alto rendimento quando juntamente com sistemas automatizados de manuseio de líquidos.

Introduction

A expressão genética livre de células (CFE) emergiu como uma ferramenta poderosa com muitas aplicações. Tais aplicações incluem detecção de doenças1,2,3,4,5,6, micronutrientes e detecção de moléculas pequenas7,8,9,10,11,12, biomanufacturing13,14,15,16,17 ,18, educação19,20,21, fabricação de proteínas difíceis de fabricação17,22,23,24,25,26,27, e triagem variante23,28,29,30,31,32 ,33. Isso se deve à natureza aberta dos sistemas livres de células e à flexibilidade que eles conferem. Muitos artigos de grande revisão oferecem educação histórica e perspectivas futuras sobre a tecnologia34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

Uma reação típica sem células consiste em três componentes principais: extrato celular, mistura de energia e modelo genético. O extrato de célula ativa contém todas as máquinas necessárias para transcrição e tradução (TXTL) e pode ser processado de várias maneiras36. Intermediários glicólticos, eletrólitos, aminoácidos e cofatores na mistura de energia suportam o processo TXTL. É uma grande fonte de variabilidade em experimentos sem células45 e pode ser preparado de muitas maneiras34,46. A preparação do modelo genético tem visto menos melhorias desde que os métodos tradicionais de clonagem resultam em plasmídeos com excelentes características de expressão. A desvantagem desses métodos tradicionais é o tempo de reviravolta e a quantidade de conhecimento biológico necessários para construí-los e propagar- los. Os esforços recentes de otimização resultaram em fluxos de trabalho simples de 24 horas para a preparação do extratocelular 47,48 que podem ser realizados em paralelo com a preparação do mix de energia49,50. No entanto, a clonagem tradicional adiciona vários dias à linha do tempo de prototipagem do CFE(Tabela 1)23. Produtos PCR rapidamente amplificados do fragmento genético comercial podem ser usadosdiretamente 51, mas isso limita o número de experimentos de prototipagem à medida que apenas 1 μg de DNA é produzido, o que corresponde a aproximadamente cinco reações (volumes tradicionais de 15 μL). Com essas etapas adicionais de circularização e amplificação isotérmica, quantidades maiores do que miligramas do DNA são possíveis (~5.000 reações por 1 mg). Isso aumenta drasticamente o número de testes que podem ser feitos em triagem de alta produtividade de proteínas ou redes enzimáticas combinatórias (engenharia metabólica livre de células); também permite a preservação efetiva da biblioteca de modelos lineares como DNA de alta concentração. Além disso, uma quantidade aumentada de modelo seria necessária para protótipo de quantidades maiores de proteína necessárias para aplicações científicas materiais (fibras à base de proteínas e hidrogéis). Algumas limitações de modelos lineares podem ser superadas usando um extrato de BL21 DE3 Star ou usando métodos recentemente descobertos para proteger modelos lineares da degradação52,53,54. No entanto, isso não aborda ter estoques limitados de DNA produzido pelo fornecedor para amplificação de PCR ou a questão da perícia biológica e equipamentos necessários para a clonagem.

Este trabalho apresenta um protocolo explicitamente projetado para aumentar a quantidade de modelo de expressão que pode ser obtido a partir de pequenas quantidades de fragmentos genéticos produzidos por fornecedores (tipicamente 500-1000 ng de pó liofilizado). O método descrito não requer as habilidades necessárias para realizar clonagem tradicional em plasmídeos ou transformação e propagação em células vivas. Ao receber um fragmento genético no e-mail, o usuário pode produzir modelos suficientes para muitas reações livres de células, empregando amplificação do círculo de rolamento isoterânmico (RCA) (Figura 1)23. Embora a quantidade de DNA recebida do fornecedor possa ser suficiente para esforços limitados de triagem, ele é rapidamente esgotado, e a recodência de fragmentos genéticos é demorada e cara. O método também é especialmente adequado para genes tóxicos e difíceis de clonar em E. coli.

Protocol

1. Projetando o fragmento genético NOTA: O fragmento genético deve ter todos os elementos genéticos necessários para transcrição/tradução, incluindo promotor, site de ligação ribossosome (RBS), codon inicial, gene de interesse e exterminador. Embora o exterminador não seja necessário para um modelo de expressão linear (LET), será importante se o usuário decidir inserir a sequência em um plasmídeo. Estas sequências foram levantadas do pJL1-sfGFP plasmid55…

Representative Results

A expressão de sfGFP dos modelos RCA foi comparável à do plasmídeo pJL1 ao usar apenas 0,30 μL de DNA RCA não purificado em uma reação de 15 μL(Figura 2A). Na verdade, duplicar e triplicar a quantidade de modelo parece não oferecer nenhum benefício no extrato BL21 DE3 Star, sugerindo níveis já saturados do modelo a 0,30 μL por reação. Por outro lado, parece haver um benefício para aumentar a quantidade de modelo RCA quando adicionado ao extrato celular originado da cepa SHuf…

Discussion

O gene de interesse pode ser qualquer proteína desejada, mas é melhor começar com uma proteína fluorescente como repórter conveniente para leitura em tempo real ou ponto final em um leitor de placas de poço para novos adotantes deste método. Para novas sequências proteicas, copie a sequência de aminoácidos da proteína desejada e cole-a na ferramenta de otimização de codon desejada61,62. Geralmente existem muitos organismos disponíveis e cepas de <em…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem que o NIH 1R35GM138265-01 e o NSF 2029532 para apoio parcial deste projeto.

Materials

Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194
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References

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Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).
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