Summary
Qui forniamo un protocollo per lo screening di potenziali fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo di cellule dendritiche (DC) utilizzando la trasduzione lentivirale di shRNA per ottenere linee cellulari di knockdown stabili per la differenziazione DC in vitro .
Abstract
Le cellule dendritiche (DC) sono importanti cellule che presentano l'antigene che collegano le risposte immunitarie innate e adattative. I DC sono eterogenei e possono essere suddivisi in DC convenzionali (cDC) e DC plasmacitoidi (pDC). cDCs è specializzata nella presentazione di antigeni e attivare cellule T naïve. D'altra parte, i pDC possono produrre grandi quantità di interferoni di tipo I (IFN-I) durante l'infezione virale. La specifica delle DC si verifica in una fase iniziale dei progenitori DC nel midollo osseo (BM) ed è definita da una rete di fattori di trascrizione (TF). Ad esempio, i cDC esprimono altamente ID2, mentre i pDC esprimono altamente E2-2. Poiché vengono identificati sempre più sottoinsiemi di DC, c'è un crescente interesse per la comprensione di specifici TF che controllano lo sviluppo DC. Qui, stabiliamo un metodo per lo screening dei TF critici per la differenziazione delle DC in vitro consegnando lentivirus che trasporta RNA a forcina corta (shRNA) in una linea immortalizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (iHSPC). Dopo la selezione e la differenziazione in vitro , il potenziale cDC e pDC delle linee cellulari stabili di knockdown viene analizzato mediante citometria a flusso. Questo approccio fornisce una piattaforma per identificare i geni che potenzialmente governano i destini della DC dai progenitori in vitro.
Introduction
I DC sono regolatori chiave dell'immunità innata e adattativa1. I DC sono principalmente classificati in due popolazioni funzionalmente distinte, vale a dire pDC e cDC. Inoltre, i cDC comprendono due sottoinsiemi, vale a dire, rispettivamente, cDC di tipo I e di tipo II o cDC1 e cDC22. Le pDC, che esprimono BST2, Siglec-H e livelli intermedi di CD11c nei topi3,4, sono le cellule che possono secernere grandi quantità di IFN-I durante l'infiammazione e l'infezione virale5. Grazie alla loro robusta capacità di produrre IFN-I, si sospetta anche che svolgano un ruolo chiave nella progressione delle malattie autoimmuni, tra cui il lupus eritematoso sistemico (LES)6. I cDC1, definiti dall'espressione superficiale di XCR1, CD8a, CLEC9A e CD103 nei topi7, sono specializzati nell'attivazione e polarizzazione delle cellule T CD8+ citotossiche (CTL) attraverso la presentazione incrociata dell'antigene, avviando così l'immunità di tipo I in risposta a patogeni intracellulari e cancro8,9. D'altra parte, i cDC2, che esprimono CD11b e CD172α (noto anche come Sirpα) sia nell'uomo che nei topi, possono attivare le cellule T CD4 + e promuovere la risposta immunitaria di tipo II contro allergeni e parassiti10, oltre a modulare l'immunità di tipo III a seguito di batteri extracellulari e riconoscimento del microbiota11,12.
La diversificazione delle DC è determinata da un gruppo di TF da cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) nel BM. E2-2 (codificato da Tcf4) è un regolatore principale per la differenziazione e la funzione dei pDC13,14. Al contrario, l'inibitore del legame del DNA 2 (ID2) guida la specifica cDC e inibisce lo sviluppo di pDC bloccando l'attività della proteina E15. Inoltre, lo sviluppo di cDC1 richiede IRF8 e BATF3, mentre la differenziazione di cDC2 dipende fortemente da IRF416. Lavori recenti hanno esplorato l'eterogeneità dei pDC17 e dei cDC e la loro regolazione trascrizionale18. A causa della complessità della rete DC, vi è una necessità insoddisfatta di stabilire una piattaforma per identificare altri TF che controllano lo sviluppo e la funzionalità dei DC.
Qui, abbiamo usato un iHSPC che è stato generato esprimendo la traslocazione nucleare regolata dagli estrogeni di Hoxb8 nelle cellule BM (note anche come cellule Hoxb8-FL)19. Le iHSPC possono proliferare e rimanere in uno stadio indifferenziato in presenza di β-estradiolo e ligando Flt3 (FL), mentre iniziano a differenziarsi in diversi tipi di DC in presenza di FL al momento del ritiro di β-estradiolo19. Sulla base di questa caratteristica, possiamo abbattere i geni di interesse nella fase progenitrice, seguita dall'esame dell'effetto sulla differenziazione in vitro di pDC e cDC. Pertanto, questo metodo è un potente strumento per scoprire i geni che regolano lo sviluppo e la funzione dei DC.
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Protocol
La gestione del lentivirus viene eseguita secondo il regolamento del Dipartimento di salute e sicurezza ambientale del National Taiwan University College of Medicine.
1. Preparazione di linee cellulari staminali e progenitrici ematopoietiche immortalizzate (iHSPC)
- Mantenere la linea cellulare iHSPC in un mezzo RPMI 1640 completo contenente 100 ng/mL FL e 1 μM β-estradiolo.
- Passare le cellule ad un rapporto di 1:10 ogni 3 giorni.
NOTA: Rendere completo RPMI 1640 medio integrando con 10% di siero bovino fetale (FBS), 5 x 10-5 M β-mercaptoetanolo e 10 μg / mL di gentamicina. FL murino ricombinante è anche disponibile in commercio.
2. Trasduzione lentivirale
- Piastra iHSPC ad una densità di 1 x 105 celle/pozzetto in piastre a 12 pozzetti in 1 mL di mezzo completo contenente 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiolo e 8 μg/mL di polibrene.
NOTA: La concentrazione di polybrene dipende dai tipi di cellule ed è solitamente compresa tra 4-8 μg/mL. - Aggiungere il lentivirus portatore di shRNA in ogni pozzetto ad una molteplicità di infezione (MOI) di 100.
NOTA: Il vettore lentivirale è pLKO.1-Puro con un marcatore di selezione della puromicina (Figura 1). Le sequenze target di shRNA contro LacZ, Tcf4 e Id2, rispettivamente, sono elencate nella Tabella dei materiali. Il MOI è definito dal numero di virioni che vengono aggiunti per cellula durante l'infezione.
- Ruotare le piastre a 1.100 x g per 90 minuti a 37 °C.
NOTA: l'infezione da spin viene effettuata utilizzando un rotore a benna oscillante. - Incubare la piastra contenente cellule infette per una notte a 37 °C in un'incubatrice.
NOTA: se le cellule sono sensibili al polibrene, aggiornare le cellule con il mezzo completo senza polibrene dopo l'infezione da spin. - Aggiornare le cellule con mezzo completo contenente 100 ng/mL FL e 1 μM β-estradiolo 24 ore dopo l'infezione.
- Aggiungere 6 μg/mL di puromicina al mezzo per selezionare le cellule infette dopo ulteriori 24 ore.
NOTA: Il vettore lentivirale trasdotto di solito richiede 48 ore per esprimere i geni, incluso il gene resistente alla puromicina. Assicurarsi che la concentrazione di puromicina sia ottimizzata per ogni linea cellulare. - Aggiornare il mezzo di selezione contenente 100 ng / mL FL, 1 μM β-estradiolo e 6 μg / mL puromicina ogni 3 giorni e mantenere le cellule per almeno una settimana per espandere le cellule iHSPC trasdotte stabilmente.
NOTA: La selezione di puromicina di solito ha effetto 48 ore dopo e il periodo di selezione dipende dai tipi di cellule.
3. Misurazione dell'efficienza di abbattimento mediante trascrizione inversa e REAL-TIME PCR (RT-PCR)
- Estrarre l'RNA totale da 1 x 107 shLacZ, shTcf4 e shId2 cellule iHSPC stabili di knockdown utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA commerciale e precipitare l'RNA dallo strato acquoso con isopropanolo, seguito dal lavaggio del precipitato di RNA con etanolo al 75%.
- Sciogliere l'RNA (~ 5 μg) con 5 μL di H2O trattato con DEPC e regolare la concentrazione a 1 μg/μL.
- Prendere 1-3 μg di RNA, mescolare con H2O trattato con DEPC per un volume finale di 17,4 μL, aggiungere 1 μL di 1 unità/μL di DNasi I priva di RNasi e incubare per 20 minuti a 37 °C.
NOTA: Questo passaggio consiste nel digerire il DNA genomico nei campioni di RNA. - Aggiungere 1 μL di 20 mM EDTA ai campioni di RNA, incubare a 65 °C per 10 minuti per inattivare la DNasi I e mettere immediatamente i campioni di RNA a 4 °C.
- Aggiungere 11,6 μL della miscela di reazione contenente 1 μL di primer oligo (dT) (45 μM), 6 μL di 5x tampone del 1° filamento, 3 μL di dNTP (2 mM), 0,6 μL di inibitore della RNasi (50 Unità/μL) e 1 μL di trascrittasi inversa (200 Unità/μL) ai campioni di RNA e incubare a 40 °C per 1 ora.
- Arrestare la reazione riscaldando a 70 °C per 10 minuti e diluire la miscela di reazione con 30 μL di H2O.
- Prendi 2 μL della miscela di reazione RT diluita come modello di DNA e la PCR la amplifica usando primer contro Tcf4 o Id2 (vedi Tabella 1 per le condizioni del termociclatore).
NOTA: le sequenze di primer sono incluse nella Tabella dei materiali.
4. Differenziazione in vitro delle linee cellulari iHSPC a knockdown stabile
- Mantenere stabile il singolo knockdown di LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) o Id2 (shId2) in iHSPC in mezzo completo contenente 100 ng/ mL di FL e 1 μM β-estradiolo.
- Raccogliere gli iHSPC indifferenziati shLacZ, shTcf4 e shId2 in un tubo da 15 mL e centrifugare per 5 minuti a 500 x g per pellettare le celle.
- Scartare il surnatante e aggiungere 10 ml di PBS per lavare le cellule. Ripetere questo passaggio due volte.
- Risospesciare e seminare le cellule iHSPC ad una densità di 2 x 105 cellule/mL in una piastra a 12 pozzetti in 1 mL di mezzo completo contenente solo 100 ng/mL FL.
- Aggiungere 1 mL di mezzo fresco completo contenente 100 ng/mL FL tre giorni dopo.
- Analizzare le cellule differenziate (shLacZ, shTcf4 e shId2 iHSPC) mediante citometria a flusso due giorni dopo.
5. Analisi citometrica a flusso delle DC differenziate
- Raccogliere le cellule in tubi da 1,5 ml tubando le celle su e giù 2-3 volte nella piastra e centrifugare per 5 minuti a 500 x g a temperatura ambiente (RT).
NOTA: i DC differenziati in vitro si attaccheranno leggermente alle piastre. Il pipettaggio delicato aiuterà a recuperare i DC dalle piastre. - Scartare il surnatante e risospese le cellule in 50 μL di tampone FACS. Quindi, aggiungere 50 μL di surnatante ibridoma anti-CD16/32 e incubare per 5-10 minuti sul ghiaccio.
NOTA: L'anticorpo bloccante Fc impedisce il legame non specifico degli anticorpi ai recettori Fc che si esprimono su alcune cellule mieloidi e cellule B ed è disponibile in commercio attraverso vari fornitori. - Aggiungere anticorpi coniugati con colorante fluorescente (0,04 μg per ciascun anticorpo) direttamente alle cellule e incubare per 15 minuti sul ghiaccio al buio. Gli anticorpi utilizzati sono APC/cy7 anti-mouse CD11c, FITC anti-mouse CD11b e PE anti-mouse B220.
NOTA: i pDC sono definiti come CD11c+CD11b-B220+ e i cDC sono definiti come CD11c+CD11b+B220-. - Lavare le celle con 1 mL di tampone FACS e centrifugare per 5 min a 500 x g a RT.
- Risospendare le cellule in 100 μL di tampone FACS e analizzarle mediante citometria a flusso.
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Representative Results
Viene mostrata la mappa del vettore lentivirale pLKO.1-Puro (Figura 1). Dopo la somministrazione di lentivirus che esprimono shRNA contro LacZ (un controllo non mirato), Tcf4 e Id2 in iHSPC, l'efficienza di knockdown confermata da RT-qPCR ha rivelato che l'espressione di Tcf4 era ridotta nelle iHSPC shTcf4, rispetto alle iHSPC shLacZ (Figura 2A). D'altra parte, la diminuzione dell'espressione di Id2 è stata osservata anche nelle iHSPC shId2, rispetto al controllo shLacZ iHSPC (Figura 2B). Le linee cellulari iHSPC shLacZ, shTcf4 e shId2 sono state differenziate in pDC e cDC in vitro con FL. Dopo cinque giorni di coltura di iHSPC shLacZ, la frequenza delle cellule CD11c+, che rappresentano la popolazione DC7, era di circa il 95% (Figura 3A, pannello di sinistra). Tuttavia, il knockdown di Tcf4 o Id2 ha leggermente ridotto la generazione di DC CD11c+ (Figura 3A, pannello centrale e destro). Inoltre, ulteriori analisi dei DC CD11c+ hanno rivelato che gli iHSPC shLacZ si differenziavano nel 70% dei cDC (CD11c+CD11b+B220+) e nel 22% dei pDC (CD11c+CD11b-B220+) (Figura 3B, pannello di sinistra). Tuttavia, gli iHSPC shTcf4 hanno generato una percentuale significativamente inferiore di pDC (4%) rispetto al controllo shLacZ (Figura 3B, pannello centrale). D'altra parte, gli iHSPC shId2 hanno generato una percentuale significativamente inferiore di cDC (54%) ma una percentuale più alta di pDC (39%) rispetto al controllo shLacZ (Figura 3B, pannello di destra). Pertanto, questi risultati suggeriscono che gli iHSPC riflettono fedelmente lo stesso requisito dei fattori di trascrizione per il controllo dello sviluppo DC.
Figura 1: Il costrutto del vettore lentivirale pLKO.1-Puro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'efficienza di knockdown di shTcf4 e shId2. Dopo un knockdown genico stabile, gli RNA sono stati isolati da iHSPC shLacZ, shTcf4 e shId2 e trascritti inversamente in cDNA, e l'espressione di Tcf4 e Id2 è stata misurata da RT-qPCR. L'espressione genica relativa è stata normalizzata a Rpl7. Un. L'espressione di Tcf4 in shLacZ e shTcf4 iHSPC. B. Espressione di Id2 in shLacZ e shId2 iHSPC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'abbattimento di Tcf4 compromette lo sviluppo di pDC, mentre il knockdown di Id2 riduce la generazione di cDC da iHSPC in vitro. Le iHSPC sono state stabilmente trasdotte con lentivirus portatori di shLacZ, shTcf4 e shId2, quindi differenziate in vitro in DC con FL (100 ng / mL). Dopo la coltura per 5 giorni, le cellule sono state colorate e analizzate mediante citometria a flusso. Un. Viene mostrata la percentuale di cellule CD11c+. B. Viene mostrata l'analisi per pDC (CD11c+B220+CD11b-) e cDC (CD11c+B220-CD11b+). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reazione PCR | |||
| Passi | Temperatura | Ore | Cicli |
| Denaturazione iniziale | 95°C | 3 minuti | 1 |
| Denaturazione | 95°C | 15 secondi | 35-40 |
| Ricottura | 60°C | 20 secondi | |
| Estensione | 72°C | 20 secondi | |
| Estensione finale | 80°C | 20 secondi | 1 |
| Tenere | 4°C | ∞ | 1 |
Tabella 1: Condizioni del termociclatore per pcr.
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Discussion
I vettori shRNA basati su lentivirus sono spesso utilizzati per il silenziamento genico mediante trasduzione virale nelle cellule e consentono un'integrazione stabile nel genoma dell'ospite. Tuttavia, è necessario considerare varie efficienza di trasduzione in diversi tipi di cellule e sono stati adottati numerosi approcci per superare questo problema.
Polybrene è un polimero policanico in grado di neutralizzare le cariche sulla membrana cellulare, migliorando così il legame del virione alle cellule durante la trasduzione20. Sebbene sia un modo efficace per aumentare il tasso di trasduzione, è anche tossico per alcuni tipi di cellule quando si aggiungono quantità eccessive. In questo caso, è necessario testare la tossicità del polibrene e ottimizzare la concentrazione in diverse cellule. Protamina solfato, un composto cationico, forse un approccio alternativo per aumentare la vitalità cellulare21. Inoltre, aggiornare i supporti completi lo stesso giorno dell'infezione può migliorare il tasso di sopravvivenza della rappresentazione dopo la trasduzione.
La maggior parte dei sistemi di somministrazione di shRNA ha un marcatore selettivo per eliminare le cellule che non sono state infettate con successo. Il sistema lentivirale che abbiamo usato contiene un gene resistente alla puromicina in modo che le cellule infette possano essere selezionate dopo la trasduzione. Inoltre, lentivirus che esprime GFP è anche un'altra opzione per la selezione. Tuttavia, ci sono sia vantaggi che svantaggi per entrambi i metodi. L'uso della puromicina come metodo di selezione è difficile misurare direttamente l'efficienza di trasduzione a meno che l'espressione dei geni bersaglio non sia stata confermata dalla qPCR. Ma la puromicina fornisce stress per la selezione per mantenere il DNA estraneo all'interno delle cellule e mantenere il fenotipo di abbattimento. Al contrario, la GFP è anche un metodo di selezione che non fornisce stress alle cellule anche se l'efficienza di trasduzione può essere immediatamente valutata mediante citometria a flusso.
Uno dei limiti di questo metodo è il numero relativamente piccolo di cellule cDC1 generate da iHSPC in vitro19. Sebbene gli iHSPC abbiano pDC e cDC potenziali guidati da FL in vitro, la maggior parte dei sottotipi di cDC generati sono cDC2, ma non cDC1. Ciò è probabilmente dovuto al requisito della segnalazione di Notch durante la differenziazione in vitro di cDC122. Pertanto, la co-coltura con cellule stromali OP9-DL1 che esprimono il ligando Di Notch Delta-like 1 può ripristinare il potenziale cDC1 delle iHSPC, migliorando così gli studi meccanicistici sui cDC1.
L'applicazione di questo protocollo non solo per studiare il ruolo dei TF ma anche per altri geni, come i geni metabolici che possono partecipare allo sviluppo di DC o altri tipi di cellule. Un concetto emergente evidenzia che la via di sviluppo della DC è associata a un diverso metabolismo cellulare23,24. Pertanto, l'abbattimento genico nei progenitori DC è una potente strategia per studiare la regolazione metabolica in risposta a segnali ambientali e determinare come le diverse vie metaboliche regolano la differenziazione DC abbattendo i geni critici nel metabolismo25. D'altra parte, le iHSPC hanno la capacità di differenziarsi in cellule mieloidi oltre i lignaggi DC utilizzando specifici fattori di differenziazione. L'uso del fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e del fattore stimolante delle colonie di granulociti (G-CSF) provoca lo sviluppo di macrofagi e granulociti, rispettivamente, da iHSPC19. Sulla base della stessa strategia, questo metodo potrebbe applicarsi anche alla ricerca dello sviluppo delle cellule mieloidi.
Collettivamente, il protocollo descritto dal knockdown genico alla differenziazione in vitro delle iHSPC fornisce un modo rapido ed efficace per facilitare lo studio dello sviluppo di DC e risponde a domande fondamentali sullo sviluppo delle cellule immunitarie in futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati per il supporto tecnico del Dr. Tz-Ling Chen. Ringraziamo la National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) per aver fornito shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 e MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) |
References
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