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Medicine

इन विवो एप्लिकेशन के लिए नारिंगेनिन समाधान की तैयारी

Published: August 10, 2021 doi: 10.3791/62736
Automatic Translation
1, 2, 2
1Spine Research Institute, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Integrative Medicine, Huashan Hospital, Fudan University

Summary

यहां, प्रोटोकॉल विवो इंट्रापरिटोनियल प्रशासन के लिए नारिंगेनिन समाधान की तैयारी प्रस्तुत करता है। नारिंगेनिन पूरी तरह से डाइमिथाइलसल्फोक्साइड, ट्वीन 80 और खारा के मिश्रण में घुल जाता है। नारिंगेनिन के एंटीडायबिटिक ऑस्टियोपोरोटिक प्रभावों का मूल्यांकन रक्त शर्करा परीक्षण, टार्टरेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट धुंधला और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख द्वारा किया गया था।

Abstract

एक यौगिक (फाइटोकेमिकल) समाधान की तैयारी दवा स्क्रीनिंग जैसे अध्ययनों में इसके आवेदन से पहले एक अनदेखी लेकिन महत्वपूर्ण कदम है। यौगिक का पूर्ण घुलनशीलीकरण इसके सुरक्षित उपयोग और अपेक्षाकृत स्थिर परिणामों के लिए आवश्यक है। यहां, उच्च वसा वाले आहार और स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन (एसटीजेड) -प्रेरित मधुमेह मॉडल में नारिंगेनिन समाधान और इसके इंट्रापरिटोनियल प्रशासन को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में प्रदर्शित किया गया है। नारिंजेनिन (3.52-6.69 मिलीग्राम) की एक छोटी मात्रा का उपयोग सॉल्वैंट्स में इसके घुलनशीलता का परीक्षण करने के लिए किया गया था, जिसमें क्रमशः इथेनॉल, डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ), और डीएमएसओ प्लस ट्वीन 80 शामिल थे, जिन्हें शारीरिक लवण (पीएस) में पुनर्गठित किया गया था। यौगिक का पूर्ण घुलनशीलीकरण समाधान के रंग को देखकर निर्धारित किया जाता है, सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद अवक्षेप की उपस्थिति (30 सेकंड के लिए 2000 x g ), या समाधान को कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 घंटे तक खड़े रहने की अनुमति देता है। फाइटोकेमिकल समाधान प्राप्त करने के बाद, विवो अध्ययनों में आवश्यक यौगिक की अंतिम एकाग्रता / मात्रा को विलायक-केवल (कोई पीएस) स्टॉक समाधान में तैयार किया जा सकता है, और फिर वांछित रूप से पीएस के साथ पतला / मिश्रित किया जा सकता है। चूहों में नारिंगेनिन के एंटीडायबिटिक ऑस्टियोपोरोटिक प्रभाव (20 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू, 2 मिलीग्राम / एमएल पर इंट्रापरिटोनियल प्रशासन) का मूल्यांकन रक्त शर्करा, हड्डी द्रव्यमान (माइक्रो-सीटी), और हड्डी पुनरुत्थान दर (ट्रैप धुंधला और एलिसा) को मापकर किया गया था। विस्तृत कार्बनिक / फाइटोकेमिकल समाधान तैयारी की तलाश करने वाले शोधकर्ताओं को इस तकनीक से लाभ होगा।

Introduction

दवा स्क्रीनिंग के लिए फाइटोकेमिकल यौगिकों के उपयोग से संबंधित बढ़ते अध्ययनों के साथ, उनके इष्टतम प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए फाइटोकेमिकल समाधान तैयार करने के दृष्टिकोण ध्यान देने योग्य हैं। यौगिक1 तैयार करते समय विघटन पद्धति, खुराक और एकाग्रता जैसे कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए।

कार्बनिकयौगिक तैयारी के लिए विलायक-आधारित विघटन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले सॉल्वैंट्स में पानी, तेल, डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ), मेथनॉल, इथेनॉल, फॉर्मिक एसिड, ट्वीन, ग्लिसरीन, आदि शामिल हैं। यद्यपि जब यौगिक को गैस्ट्रिक गैवेज द्वारा प्रशासित किया जाता है, तो अविघटित पदार्थों के साथ एक निलंबन स्वीकार्य होता है, अंतःशिरा प्रशासन के लिए एक पूरी तरह से भंग विलेय महत्वपूर्ण है। चूंकि तेल समाधान, निलंबन और इमल्शन केशिका एम्बोलिज्म का कारण बन सकता है, यौगिक तैयारी के लिए एक जलीय घोल का सुझाव दिया जाता है, खासकर जब अंतःशिरा, इंट्रामस्क्युलर और इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन3 का प्रशासन किया जाता है।

प्रभावी खुराक सीमा यौगिकों के बीच भिन्न होती है और यहां तक कि एक ही यौगिक के साथ इलाज की जाने वाली बीमारियों के बीच भी। प्रभावी और सुरक्षित खुराक और एकाग्रता का निर्धारण साहित्य और प्रारंभिकप्रयोगों पर निर्भर है। यहां, यौगिक नारिंगेनिन की तैयारी को एक उदाहरण के रूप में प्रदर्शित किया गया है।

एक पॉलीफेनोलिक यौगिक, नारिंगेनिन (4,5,7-ट्राइहाइड्रॉक्सी-फ्लेवोन) का अध्ययन इसके हेपेटोप्रोटेक्टिव5, एंटीडायबिटिक6, एंटी-इंफ्लेमेटरी7 और एंटी-ऑक्सीडेंटगतिविधियों 8 के लिए रोग उपचार में किया गया है। विवो अनुप्रयोगों में, नारिंगेनिन के मौखिक प्रशासन का आमतौर पर उपयोग किया जाता है। पिछले अध्ययनों में 0.5% -1% कार्बोक्सीमिथाइल सेल्यूलोज, 0.5% मेथिलसेल्यूलोज खुराक, 0.01% डीएमएसओ, और शारीरिक लवण (पीएस) में 50-100 मिलीग्राम / किग्रा पर नारिंजेनिन समाधान तैयार करने की सूचना दी गई थी, जिसे मौखिक गैवेज 9,10,11,12 द्वारा प्रशासित किया जाता है। इसके अलावा, अन्य अध्ययनों ने 3.6 ग्राम/किग्रा/डी13,14 की खुराक पर मौखिक सेवन के लिए 3% (डब्ल्यूटी/डब्ल्यूटी) पर चाउ के साथ नारिंगेनिन को पूरक करने की सूचना दी है। अध्ययनों ने 10-50 मिलीग्राम / किग्रा 15,16,17,18 पर इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के लिए नारिंगेनिन को भंग करने के लिए इथेनॉल (0.5% वी / वी), पीएस और डीएमएसओ का उपयोग करने की भी सूचना दी है। टेम्पोरल लोब मिर्गी के एक अध्ययन में, चूहों को पीएस19 में घुलने वाले 0.25% कार्बोक्सीमिथाइल सेल्यूलोज में निलंबित नारिंगेनिन का इंजेक्शन मिला। हालांकि ये अध्ययन नारिंगेनिन समाधान तैयार करने के लिए विभिन्न सॉल्वैंट्स के उपयोग की रिपोर्ट करते हैं, लेकिन आगे के विवरण, जैसे कि भंग स्थिति और पशु प्रतिक्रिया, की सूचना नहीं दी गई है।

यह प्रोटोकॉल मधुमेह से प्रेरित ऑस्टियोपोरोसिस में विवो आवेदन के लिए नारिंगेनिन समाधान तैयार करने के लिए एक प्रक्रिया का परिचय देता है। इंजेक्शन समाधान की तैयारी में सॉल्वैंट्स और यौगिकों, खुराक अनुमान, विघटन प्रक्रिया और निस्पंदन तैयार करना शामिल है। खुराक 3 दिनों के लिए हर दिन इंजेक्शन देने और माउस व्यवहार के अनुसार खुराक को संशोधित करने के बाद चूहों की निगरानी करके साहित्य अनुसंधान और प्रारंभिक प्रयोगों के आधार पर निर्धारित किया गया था। अंतिम चुनी गई एकाग्रता (20 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू) को उच्च वसा वाले आहार और स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन (एसटीजेड) प्रेरित मधुमेह चूहों20,21 में 8 सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह 5 दिन इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित किया गया था। मधुमेह ऑस्टियोपोरोसिस में नारिंगेनिन के प्रभावों का मूल्यांकन रक्त शर्करा परीक्षण, माइक्रो-सीटी, टार्टरेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) धुंधला, और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा किया गया था।

कुल मिलाकर, यह देखा गया कि 40-400 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता सीमा पर नारिंगेनिन इथेनॉल या डीएमएसओ या 5% (इथेनॉल या डीएमएसओ) प्लस 95% पीएस (वी / वी) में पूरी तरह से भंग नहीं हुआ। हालांकि, नारिंगेनिन 3.52% डीएमएसओ, 3.52% ट्वीन 80 और 92.96% पीएस के मिश्रण में पूरी तरह से घुल गया। विस्तृत प्रक्रिया शोधकर्ताओं को विवो एप्लिकेशन के लिए इंजेक्शन समाधान के रूप में यौगिक तैयार करने में मदद करेगी।

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Protocol

वर्णित जांच राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुरूप थी और शंघाई विश्वविद्यालय के पारंपरिक चीनी चिकित्सा पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित की गई थी। प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय, सुरक्षा उद्देश्यों के लिए लैब कोट, डिस्पोजेबल नाइट्राइल दस्ताने और चश्मे की आवश्यकता होती है।

1. सॉल्वैंट्स की तैयारी और विवो अनुप्रयोग में आवश्यक नारिंगेनिन का आकलन

  1. निम्नलिखित सॉल्वैंट्स तैयार करें: ट्वीन -80 (अंतिम एकाग्रता सीमा: 0.5% -1%), डीएमएसओ, ग्लिसरीन (अंतिम एकाग्रता सीमा: 15% -20%), इथेनॉल (अंतिम एकाग्रता सीमा: इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए 12%)22, और 0.9% पीएस।
  2. खुराक, चूहों की संख्या और इंजेक्शन आवृत्ति के आधार पर आवश्यक नारिंगेनिन की मात्रा का अनुमान लगाएं।
    1. 10 चूहों (सी 57बीएल / 6, पुरुष, 5 सप्ताह पुराना, एसपीएफ) को 8 सप्ताह के लिए सप्ताह में 5 दिन नारिंगेनिन का प्रशासन करने का आदेश दें। चूहों को विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) स्थितियों में रखें।
      नोट: इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के लिए आवश्यक खुराक 20 मिलीग्राम /
    2. निम्नलिखित गणना के आधार पर 160 मिलीग्राम नारिंगेनिन का वजन करें: 20 मिलीग्राम / किग्रा x 0.02 किलोग्राम / माउस x 10 चूहे x 5 दिन / सप्ताह x 8 सप्ताह = 160 मिलीग्राम।
  3. विवो में इंजेक्ट किए जाने वाले नारिंगेनिन की एकाग्रता की गणना करें।
    1. चूहों के शरीर के वजन के आधार पर अनुशंसित मात्रा तैयार करें। प्रत्येक माउस पर लागू नारिंगेनिन की अनुशंसित मात्रा शरीर के वजन (0.3 एमएल) का 1% है। इस प्रयोग में, 0.2 एमएल प्रति माउस का उपयोग किया गया था।
    2. कुल मात्रा की गणना करें: 0.2 एमएल प्रति माउस x 10 चूहे x 5 दिन/सप्ताह x 8 सप्ताह = 80 एमएल।
    3. स्टॉक में नारिंगेनिन की एकाग्रता की गणना करें: 160 मिलीग्राम / 80 एमएल सॉल्वैंट्स = 2 मिलीग्राम /
    4. प्रत्येक दिन के लिए आयतन की गणना करें: 0.2 एमएल प्रति माउस x 10 चूहे = 2 एमएल।

2. विघटन

  1. इथेनॉल समाधान
    1. 2 मिलीग्राम / एमएल पर नारिंगेनिन समाधान तैयार करने के लिए, 3.52 मिलीग्राम नारिंगेनिन का वजन करें और इसे 2.0 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
      नोट: 2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, आवश्यक कुल मात्रा 1760 μL होगी (गणना: 3.52 mg/1760 μL = 2 mg/mL)।
    2. नारिंगेनिन पाउडर को ट्यूब के तल पर व्यवस्थित करने के लिए जल्दी से नीचे (30 सेकंड के लिए 2000 x g ) स्पिन करें (चित्रा 1 ए)।
    3. आवश्यक कुल मात्रा के संबंध में 0.5% (v/v) समाधान तैयार करने के लिए ट्यूब में 100% इथेनॉल का 8.8 μL जोड़ें। नारिंगेनिन पूरी तरह से भंग नहीं होता है (चित्रा 1 बी)।
    4. आवश्यक कुल मात्रा के संबंध में 5% (v/v) समाधान तैयार करने के लिए ट्यूब में 100% इथेनॉल का 79.2 μL जोड़ना जारी रखें (गणना: (79.2 μL + 8.8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%)। नारिंगेनिन पूरी तरह से भंग नहीं होता है (चित्रा 1 बी)।
    5. चरण 2.1.4 में वर्णित 5% इथेनॉल युक्त ट्यूब में 0.9% पीएस का 1672 μL जोड़ें। यह एक इमल्शन (चित्रा 1 डी) का उत्पादन करेगा। सेंट्रीफ्यूज (30 सेकंड के लिए 2000 x g ) यह जांचने के लिए समाधान है कि क्या नारिंगेनिन पूरी तरह से समाधान में घुल गया है। घोल में अविघटित नारिंजेनिन के सफेद अवक्षेप दिखाई देते हैं (चित्रा 1 ई)।
  2. DMSO समाधान
    1. 2 मिलीग्राम / एमएल पर नारिंगेनिन समाधान तैयार करने के लिए, 3.95 मिलीग्राम नारिंगेनिन का वजन करें और 2.0 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
      नोट: 2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, आवश्यक कुल मात्रा 1975 μL होगी (गणना: 3.95 mg/1975 μL = 2 mg/mL)।
    2. नली के निचले भाग में नारिंगेनिन पाउडर को व्यवस्थित करने के लिए जल्दी से नीचे (30 सेकंड के लिए 2000 x g ) स्पिन करें।
    3. 0.5% (v/v) समाधान तैयार करने के लिए ट्यूब में DMSO का 9.8 μL जोड़ें (गणना: 9.8 μL/1975 μL x 100% = 5%)। नारिंगेनिन पूरी तरह से घुल जाता है (चित्रा 2 ए)।
    4. आवश्यक कुल मात्रा के संबंध में 5% (v/v) समाधान तैयार करने के लिए ट्यूब में DMSO का 88.2 μL जोड़ें (गणना: (88.2 μL + 9.8 μL) / 1975 μL x 100% = 5%)। नारिंगेनिन पूरी तरह से घुल जाता है (चित्रा 2 बी)।
    5. चरण 2.2.4 में तैयार किए गए समाधान में 0.9% पीएस (95% का v/v प्रतिशत) का 1877 μL जोड़ें। एक इमल्शन का उत्पादन किया जाता है (चित्रा 1 सी)। सेंट्रीफ्यूज (30 सेकंड के लिए 2000 x g ) यह जांचने के लिए समाधान है कि क्या नारिंगेनिन पूरी तरह से समाधान में घुल गया है। घोल में अविघटित नारिंगेनिन के सफेद अवक्षेप दिखाई देते हैं (चित्रा 1 डी)।
  3. ट्वीन -80 और डीएमएसओ समाधान
    1. 2 मिलीग्राम / एमएल पर नारिंगेनिन समाधान तैयार करने के लिए, 6.69 मिलीग्राम नारिंगेनिन का वजन करें और 5.0 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
      नोट: 2 mg/mL की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए, आवश्यक कुल समाधान मात्रा 3345 μL होगी (गणना: 6.69 mg/3345 μL = 2 mg/mL)।
    2. नली के निचले भाग में नारिंगेनिन पाउडर को व्यवस्थित करने के लिए जल्दी से नीचे (30 सेकंड के लिए 2000 x g ) स्पिन करें।
    3. आवश्यक कुल मात्रा के संबंध में 3.5% (v/v) समाधान तैयार करने के लिए DMSO का 117.7 μL जोड़ें (गणना: 117.7 μL /3345 μL x 100% = 3.5%)। नारिंगेनिन पूरी तरह से घुल जाता है (चित्रा 3 ए)
    4. चरण 2.3.3 में तैयार किए गए समाधान में ट्वीन 80 का 117.7 μL जोड़ें ताकि 3.5% (v/v) ट्वीन 80 और 3.5% (v/v) DMSO प्राप्त किया जा सके। नारिंगेनिन के पूर्ण विघटन का निरीक्षण करें (चित्र 3बी)
    5. चरण 2.3.4 में तैयार किए गए घोल को धीरे-धीरे 5.0 एमएल ट्यूब में जोड़ें जिसमें 0.9% पीएस (93% का v/ v प्रतिशत) का 3109.6 μL होता है और एक स्पष्ट नारिंजेनिन समाधान प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से हिलाएं (चित्रा 3 सी)।
    6. चरण 2.3.5 में तैयार समाधान को 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर रहने दें। समाधान अभी भी बिना किसी दृश्य अवक्षेप के स्पष्ट है (चित्रा 3 डी)।
  4. विवो प्रशासन में नारिंगेनिन समाधान की तैयारी
    1. चरण 1.2.2 के अनुसार, 160 मिलीग्राम नारिंगेनिन (160 मिलीग्राम / 2 मिलीग्राम / एमएल = 80 एमएल) का वजन करें।
    2. 3.5% (v/v) समाधान प्राप्त करने के लिए 2.8 mL DMSO जोड़ें (गणना: 2.8 mL / 80 mL x 100% = 3.5%)
    3. फिर, चरण 2.4.2 में तैयार किए गए समाधान में ट्वीन 80 का 2.8 एमएल जोड़ें ताकि 3.5% (v/v) ट्वीन 80 और 3.5% (v/v) DMSO प्राप्त किया जा सके।
    4. चरण 2.4.3 में तैयार किए गए घोल को चार ट्यूबों में, 1.4 एमएल प्रति ट्यूब [(2.8 एमएल + 2.8 एमएल) / 4 = 1.4 एमएल] में विभाजित करें।
    5. एलिकोट 18.6 एमएल 0.9% पीएस से पांच 15 एमएल ट्यूबों तक।
    6. चरण 2.4.3 (स्टॉक समाधान) और 2.4.5 में तैयार समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस (2.8 एमएल + 2.8 एमएल + 18.6 एमएल एक्स 4 = 80 एमएल) पर स्टोर करें।
    7. स्टॉक समाधान (चरण 2.4.3) का 140 μL लें और इसे 0.9% PS के 1860 μL के साथ मिलाएं ताकि 1 दिन के प्रशासन के लिए 2 एमएल नारिनजेनिन समाधान तैयार किया जा सके।
    8. समाधान को 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।

3. नारिंगेनिन समाधान प्रशासन

  1. संभालना और संयम
    1. ढक्कन खोलने से पहले पिंजरे और हाथों को 70-75% अल्कोहल के साथ स्प्रे करें। पूंछ के आधार से माउस को उठाएं और इसे अपनी पूंछ को धीरे से वापस रखने के लिए एक ठोस सतह पर रखें।
    2. बाएं अंगूठे और तर्जनी उंगली से कान के पीछे गर्दन के झुकाव को पकड़ें और पूंछ को छोटी और अनामिका उंगली के बीच रखें। माउस को लापरवाह स्थिति में रखें और उसके पीछे के छोर को थोड़ा ऊंचा रखें।
  2. इंजेक्शन
    1. माउस की पिछली त्वचा को पकड़ें ताकि पेट की त्वचा तनी हुई हो।
    2. मूत्राशय, यकृत या अन्य आंतरिक अंगों से टकराने से बचने के लिए सुई और पेट की सतह के बीच 10 डिग्री के कोण पर, पेट के निचले दाएं या बाएं चतुर्थांश में सुई (इंसुलिन सिरिंज) को धक्का दें।
    3. सुई को 3-5 मिमी के लिए कपाल दिशा में चमड़े के नीचे चलाएं, और फिर इसे पेट की गुहा में 45 डिग्री कोण पर डालें।
    4. जब सुई पेट की दीवार से गुजरती है और प्रतिरोध गायब हो जाता है, तो यह पुष्टि करने के लिए एक आकांक्षा करें कि कोई रिफ्लक्स सामग्री वापस नहीं ली गई है। फिर, धीरे-धीरे समाधान को धक्का दें।
    5. इंजेक्शन के बाद, धीरे-धीरे सुई को बाहर खींचें और रिसाव को रोकने के लिए इसे थोड़ा घुमाएं। अनुशंसित मात्रा 50-100 μL / 10 ग्राम है।
    6. बचे हुए नारिंगेनिन को बायोहाजार्ड कंटेनर में निपटाएं।

4. रक्त शर्करा परीक्षण

नोट: इंजेक्शन से 1 दिन पहले और इंजेक्शन के 1 और 2 महीने बाद रक्त शर्करा का परीक्षण करें।

  1. रक्त शर्करा परीक्षण से पहले चूहों को 15 घंटे तक उपवास करें। पानी उपलब्ध कराया जाना जारी रह सकता है।
  2. परीक्षण स्ट्रिप्स खोलें और तारीख चिह्नित करें। एक बार खोलने के बाद, 3 महीने के भीतर परीक्षण स्ट्रिप्स का उपयोग करें। परीक्षण स्ट्रिप्स को 2-30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नमी के गठन को रोकने के लिए पट्टी को हटाने के बाद ढक्कन को कसकर बंद करें।
  3. जानवर को प्रेरण कक्ष में रखें। आइसोफ्लुरेन के लिए 4% और ऑक्सीजन के लिए 4 एल / मिनट के प्रेरण स्तर पर वेपोराइज़र चालू करें। जानवर को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड करने के बाद, नाक शंकु के साथ एनेस्थेटिक और एनेस्थेटिक डिलीवरी को आइसोफ्लुरेन के लिए 1.5% और ऑक्सीजन के लिए 0.4 एल / मिनट के स्तर पर बनाए रखें।
  4. 70% -75% अल्कोहल में भिगोए गए कपास के गोले / स्वैब के साथ पूंछ को पोंछें।
  5. पूंछ के सबसे निचले बिंदु से शुरू करके, 25 जी सुई चुभन के साथ पार्श्व पूंछ की नस पर एक छोटा पंचर बनाएं और रक्त की एक बूंद निचोड़ें।
  6. एक टिशू पेपर के साथ रक्त की बूंद को पोंछें।
  7. रक्त की एक और बूंद निचोड़ें और इसे एक परीक्षण पट्टी के किनारे पर इकट्ठा करें।
  8. ग्लूकोज मीटर पर प्रदर्शित परिणाम को पढ़ें और रिकॉर्ड करें।
  9. रक्तस्राव को रोकने के लिए, एक बाँझ धुंध के साथ माउस की पूंछ को चुटकी लें और 75% अल्कोहल के साथ क्षेत्र को पोंछ दें।
  10. अतिरिक्त नमूने एक समान तकनीक द्वारा प्राप्त किए जा सकते हैं जो पूंछ को कपाल के रूप में आगे बढ़ाती है।

5. ट्रैप धुंधला होना

  1. स्लाइड्स की तैयारी
    1. सप्ताह में एक बार चूहों पर उपवास रक्त शर्करा परीक्षण करें। जब रक्त शर्करा का स्तर 11.1 mmol / L (सफल टाइप II मधुमेह चूहों मॉडल24 का संकेत) ≥ होता है, तोCO2 का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत्यु दें, इसके बाद ग्रीवा डिस्कलोकेशन करें, और लम्बर 4th-6 th (L4-L6) एकत्र करें (रक्त शर्करा परीक्षण का उपवास करते समय कोई इच्छामृत्यु नहीं की जाती है)।
    2. एल 4-एल 6 नमूनों को 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें (सुनिश्चित करें कि पैराफॉर्मलडिहाइड की मात्रा > ऊतक की मात्रा 20 गुना) है, और फिर नल के पानी के निरंतर प्रवाह में 2 घंटे के लिए धो लें।
    3. नमूनों को डीकैल्सीफाई करने के लिए, उन्हें स्थिर स्थिति में आरटी में 2 सप्ताह के लिए 10% एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) समाधान में डुबोएं जब तक कि नमूने नरम न हो जाएं। सुनिश्चित करें कि डिकैल्सीफाइंग समाधान की मात्रा ऊतक / नमूने की मात्रा का 20-30 गुना है। हर दूसरे दिन ईडीटीए समाधान बदलें।
    4. एक डिहाइड्रेटर का उपयोग करके नमूने को निर्जलित करें।
      1. नमूनों को ऊतक प्रसंस्करण एम्बेडिंग कैसेट में रखें। पेंसिल का उपयोग करके कैसेट को नंबर दें।
      2. डिहाइड्रेटर कार्यक्रम को निम्नानुसार सेट करें: 2 घंटे के लिए 75% अल्कोहल, 1 घंटे के लिए 85% अल्कोहल, 1 घंटे के लिए 95% अल्कोहल, 2 घंटे के लिए निर्जल इथेनॉल (I), 2 घंटे के लिए निर्जल इथेनॉल (II), 2 घंटे के लिए निर्जल इथेनॉल (III), 1 घंटे के लिए जाइलीन (I), 1 घंटे के लिए जाइलीन (II), 1 घंटे के लिए जाइलीन (III), 1 घंटे के लिए जाइलीन (III), 2 घंटे के लिए पैराफिन मोम (I), और आरटी पर 2 घंटे के लिए पैराफिन मोम (II)।
    5. पैराफिन मोम में नमूने एम्बेड करें।
      1. पैराफिन एम्बेडिंग स्टेशन के कैसेट ट्रे में पैराफिन मोम जोड़ें और 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। निर्जलित नमूनों को कम से कम 2 घंटे के लिए डुबोएं।
      2. ऊतक कैसेट को कैसेट ट्रे में रखें और प्रीहीट करें।
      3. पैराफिन जलाशय में पैराफिन मोम जोड़ें और 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      4. 2 घंटे के बाद, ऊतक कैसेट और नमूने दोनों को कार्य क्षेत्र में ले जाएं। पैराफिन जलाशय से पहले से गर्म पैराफिन मोम को ऊतक कैसेट में डालें। नमूना को पैराफिन मोम में रखें, सुनिश्चित करें कि पैराफिन मोम ऊतक को पूरी तरह से कवर करता है, और फिर तुरंत कैसेट को आइसिंग स्टेशन पर ले जाएं।
      5. पैराफिन-एम्बेडेड नमूनों को 5-6 μm वर्गों में काटने के लिए एक माइक्रोटोम का उपयोग करें। 10 सेकंड से कम समय के लिए 40 डिग्री सेल्सियस गर्म पानी में खंडों को फैलाएं। एपीएस (एमिनो सिलेन) लेपित ग्लास स्लाइड पर अनुभाग एकत्र करें। 1 घंटे के लिए आरटी पर स्लाइड्स को सुखाएं, और फिर स्लाइड्स को रात भर के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन सेट में ले जाएं।
  2. ट्रैप अभिकर्मक तैयारी
    1. मूल स्टॉक इनक्यूबेशन समाधान तैयार करें: आसुत जल के 1000 एमएल में 9.2 ग्राम सोडियम एसीटेट निर्जल, 11.4 ग्राम एल-(+) टार्टरिक एसिड और 2.8 एमएल ग्लेशियल एसिड को घोलें। पीएच को 4.7-5.0 में समायोजित करें और आरटी पर 6 महीने तक स्टोर करें।
    2. नाफ्थोल-ईथर समाधान तैयार करें: एथिलीन ग्लाइकोल मोनोइथाइल ईथर के 5 एमएल में 0.1 ग्राम नाफ्थोल एएस-बीआई फॉस्फेट को भंग करें। 5 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. सोडियम नाइट्राइट घोल तैयार करें: आसुत जल के 25 एमएल में 1 ग्राम सोडियम नाइट्राइट घोलें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. पैरारोसानिलिन डाई तैयार करें: 2 एन एचसीएल के 20 एमएल (417 एमएल पानी में एचसीएल के 83 एमएल) में 1 ग्राम पैरारोसेनिलिन बेस जोड़ें। आधार को भंग करने के लिए एक हलचल प्लेट का उपयोग करें और उपयोग करने से पहले इसे छान लें।
  3. ट्रैप धुंधला होना
    1. 50 एमएल बेसिक स्टॉक इनक्यूबेशन समाधान के साथ दो कोप्लिन जार भरें और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    2. एक कोप्लिन जार लें और 0.5 एमएल नेप्टोल-ईथर समाधान जोड़ें।
    3. स्लाइड्स को कोप्लिन जार में रखें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रत्येक समूह के लिए कम से कम तीन स्लाइड तैयार करें।
    4. इनक्यूबेशन समय समाप्त होने से कुछ मिनट पहले, 1 एमएल सोडियम नाइट्राइट घोल और 1 एमएल पैरारोसेनिलिन डाई जोड़ें। 30 सेकंड के लिए धीरे से मिलाएं और इसे 2 मिनट के लिए छोड़ दें।
    5. चरण 5.2.2 में तैयार समाधान को मूल स्टॉक समाधान वाले अन्य प्रीहीट कोप्लिन जार में जोड़ें। घोल को अच्छी तरह से मिलाएं और चरण 5.3.3 में कोप्लिन जार से स्लाइड डालें।
    6. आरटी पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. 5 मिनट के लिए 200 एमएल पीबीएस के साथ एक अन्य कोप्लिन जार में स्लाइस को धोएं।
    8. कोप्लिन जार में 30 सेकंड के लिए 100% हेमेटॉक्सिलिन के साथ स्लाइस को काउंटर-दाग दें।
    9. स्लाइस को 85%, 95%, और 100% अल्कोहल (200 एमएल) के साथ 2 मिनट के लिए निर्जलित करें और 3x के लिए 2 मिनट के लिए जाइलीन (200 एमएल) में इलाज करें। प्रत्येक चरण को करने के लिए कोप्लिन जार का उपयोग करें।
    10. राल का उपयोग करके कवरस्लिप के साथ कवर ग्लास पर अनुभाग को सुरक्षित करें। हवा के बुलबुले के फंसने से बचना सुनिश्चित करें।

6. एलिसा

  1. नमूना तैयार करना
    1. माउस के फीमर और टिबिया से नरम ऊतकों को हटा दें। हड्डियों को धुंध से साफ करें।
    2. हड्डी के नमूनों को 1 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें और नमूना ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: नमूने को 6 महीने से अधिक समय तक तरल नाइट्रोजन टैंक में भी संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. हड्डी के नमूने का वजन करें। 1:10 के अनुपात में 0.9% पीएस के साथ पतला करें। उदाहरण के लिए, पीएस के 1 एमएल के साथ 0.1 ग्राम हड्डी को पतला करें।
    4. ट्यूब में 3 मिमी ज़िरकोनिया मोती जोड़ें और नमूने को 30 सेकंड के लिए 70 हर्ट्ज पर 3x पीस लें और बीच में 20 सेकंड आराम करें।
    5. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 12,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें।
  2. एलिसा परख किट
    नोट: निर्माता द्वारा निर्दिष्ट परख प्रोटोकॉल के अनुसार एलिसा करें।
    1. मानक, रिक्त और नमूने के प्रत्येक कमजोर पड़ने का 100 μL उपयुक्त कुओं में जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. प्रत्येक कुएं से तरल को अलग करें और बायोटिनाइलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी वर्किंग सॉल्यूशन के 100 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. घोल को हटाकर, प्रत्येक कुएं में 350 μL वॉश बफर जोड़ें। 1 मिनट के लिए भिगोएं, 3x दोहराएं।
    4. प्रत्येक कुएं में एचआरपी संयुग्म कार्य समाधान के 100 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. समाधान निकालें। चरण 6.2.3 में वर्णित वॉश प्रक्रिया 5x को दोहराएँ।
    6. सब्सट्रेट अभिकर्मक के 90 μL जोड़ें। प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. स्टॉप समाधान के 50 μL जोड़ें।
  3. 450 एनएम पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण को रिकॉर्ड करने के लिए एक प्लेट रीडर का उपयोग करें।
  4. मानक वक्र उत्पादन
    1. क्रमिक रूप से पतला प्रोटीन सांद्रता के खिलाफ संबंधित औसत अवशोषण मूल्यों को प्लॉट करें।
    2. सबसे अच्छा फिट वक्र बनाने के लिए बिंदुओं में शामिल हों। मानक वक्र समीकरण उत्पन्न करने के लिए किसी भी उपयुक्त कंप्यूटर अनुप्रयोग (स्प्रेडशीट) का उपयोग करें।
  5. संबंधित नमूने की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मानक वक्र समीकरण में प्रत्येक नमूने के अवशोषण मूल्य को प्रतिस्थापित करें।

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Representative Results

एसटीजेड उपचार के बाद 0-8 सप्ताह तक नियंत्रण समूहों की तुलना में उच्च वसा वाले आहार-पोषित और एसटीजेड-प्रेरित मधुमेह चूहों के शरीर के वजन में कमी पाई गई। सप्ताह 4 में गैर-उपचारित चूहों (एसटीजेड समूह) की तुलना में नारिंगेनिन-उपचारित चूहों का वजन घटाना महत्वपूर्ण था। नियंत्रण और एसटीजेड समूहों को पीएस (तालिका 1) की समान मात्रा के साथ प्रशासित किया गया था। एसटीजेड प्रेरण के बाद 1 महीने के भीतर मधुमेह चूहों में रक्त शर्करा का स्तर नाटकीय रूप से बढ़ गया। यह तब स्वचालित रूप से 2 महीने पहले देखे गए स्तर तक कम हो गया जब पशु मॉडल स्थापित किया गया था। नारिंजेनिन उपचार ने 1 और 2 महीने में क्रमशः रक्त शर्करा के स्तर को 51.8% और 34.8% तक कम कर दिया (तालिका 2)। एसटीजेड-प्रेरित मधुमेह चूहों ने हड्डी के नुकसान का प्रदर्शन किया, जैसा कि क्रमशः हड्डी की मात्रा / ऊतक की मात्रा (बीवी / टीवी) (30.97%) और ट्रेबेकुले (टीबीएन) (11.4%) की संख्या में कमी से संकेत मिलता है। इन दो मापदंडों के मूल्यों में परिवर्तन से पता चलता है कि नारिंगेनिन उपचार ने हड्डी के नुकसान को काफी हद तक बचाया (तालिका 3)। टीबी एआर (ओस्टियोक्लास्ट संख्या प्रति ट्रेब्युलर हड्डी क्षेत्र) द्वारा इंगित ओस्टियोक्लास्ट गतिविधि उच्च वसा वाले आहार और एसटीजेड-प्रेरित मधुमेह चूहों में बढ़ी थी, हालांकि नियंत्रण और रोग मॉडल के बीच कोई सांख्यिकीय महत्व नहीं देखा गया था। नारिंगेनिन उपचार ने ओस्टियोक्लास्ट गतिविधियों को काफी कम कर दिया, जैसा कि चित्रा 4 और तालिका 4 में दिखाया गया है। टाइप 1 कोलेजन (सीटीआईएक्स) के सी-टर्मिनल टेलोपेप्टाइड और टाइप 1 प्रोकोलाजेन (पीआईएनपी) के एन-टर्मिनल प्रोपेप्टाइड को मधुमेह के जानवरों में क्रमशः 68.09% और 204.88% तक बढ़ाया गया था, जो हड्डी पुनर्जीवन दर में नाटकीय वृद्धि का संकेत देता है। नारिंगेनिन ने हड्डी पुनर्जीवन दर के दोनों संकेतकों को काफी कम कर दिया (तालिका 5)।

Figure 1
चित्र 1: इथेनॉल में नारिंजेनिन को घोलना। (A) नीचे घूमने के बाद ट्यूब में नारिंजेनिन पाउडर। (बी) नारिंजेनिन + इथेनॉल (400 मिलीग्राम / एमएल - 8.8 μL इथेनॉल में 3.52 मिलीग्राम नारिंजेनिन)। (ग) नारिंजेनिन + इथेनॉल (40 मिलीग्राम/एमएल - 3.52 मिलीग्राम नारिंजेनिन 8.8 μL इथेनॉल में) (D) 5% (v/v) इथेनॉल में नारिंजेनिन और 95% पीएस (09%)। (E) नीचे घूमने के बाद D में अवक्षेप। (च) चित्र 1, चित्र 2 और चित्र 3 के लिए स्केल पट्टी प्राप्त करने के लिए माप। नर: नारिंगेनिन। स्केल पट्टी = 1 सेमी . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: डीएमएसओ में नारिंगेनिन को भंग करना। (ए) नारिंजेनिन + डीएमएसओ (400 मिलीग्राम / एमएल - डीएमएसओ के 9.8 μL में 3.95 मिलीग्राम नारिंगेनिन)। (बी) नारिंगेनिन + डीएमएसओ (डीएमएसओ के 98 μL में 40 मिलीग्राम / एमएल- 3.95 मिलीग्राम नारिंगेनिन)। (ग) 5% (v/v) डीएमएसओ और 95% पीएस (09%) में नरिंजेनिन। (D) नीचे घूमने के बाद C में अवक्षेपित होता है। नर: नारिंगेनिन। स्केल पट्टी = 1 सेमी . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: डीएमएसओ और ट्वीन 80 में नारिंगेनिन को भंग करना। (ए) नारिंगेनिन + डीएमएसओ (डीएमएसओ के 117.7 μL में 57.2 मिलीग्राम / एमएल - 6.69 मिलीग्राम नारिंगेनिन)। (बी) नारिंगेनिन + डीएमएसओ + ट्वीन (डीएमएसओ के 117.7 μL में 57.2 mg/mL - 6.69 mg naringenin और ट्वीन 80 के 117.7 μL में)। (ग) 35% (v/v) DMSO, 3.5% (v/v) ट्वीन 80, और 93% PS (09%) के मिश्रण में नारिनजेनिन। (D) नीचे घूमने के बाद C में कोई अवक्षेप नहीं होता है। नर: नारिंगेनिन। स्केल पट्टी = 1 सेमी . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: उच्च वसा वाले आहार-पोषित और एसटीजेड-इंजेक्शन (एसटीजेड) चूहों की ओस्टियोक्लास्ट गतिविधि पर नारिंगेनिन का प्रभाव। "एल 4 कशेरुकाओं के ट्रेब्युलर हड्डी और ओस्टियोक्लास्ट का जाल धुंधला होना". त्रिकोण ने ओस्टियोक्लास्ट का संकेत दिया। स्केल बार = 100 μm। इस आंकड़े को लियू एट अल.25 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(छ) 0 सप्ताह 1 सप्ताह 2 सप्ताह 4 सप्ताह 5 सप्ताह 6 सप्ताह 8 सप्ताह
नियंत्रण 23.7 ± 0.2 25.1 ± 1.3 26.2 ± 1.0 27.7 ± 0.5 31.1 ± 0.7 31.7 ± 0.8 32.7 ± 1.3
STZ 16.8 ± 1.7 ** 18.2 ± 2.5 ** 18.6 ± 2.5 ** 18.2 ± 1.4 ** 21.3 ± 1.6 ** 22.0 ± 1.4 ** 20.8 ± 1.4 **
Naringenin 16.6 ± 1.1 ** 17.6 ± 1.5 ** 17.4 ± 1.7 ** 15.6 ± 1.4**ΔΔ 18.4 ± 1.5**ΔΔ 17.7 ± 1.4**ΔΔ 15.5 ± 1.0**ΔΔ
** पी < 0.01 बनाम नियंत्रण
0.01 बनाम एसटीजेड <

तालिका 1: समूहों और अवधियों में उच्च वसा वाले आहार-फ़ीड और एसटीजेड-इंजेक्शन (एसटीजेड) चूहों का बॉडीवेट। डेटा को औसत ± s.d. ** p < 0.01 बनाम नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है, ΔP < 0.01 बनाम। एसटीजेड।

(mmol/L) 0 महीना 1 महीना 2 महीने
नियंत्रण 4.9 ± 0.9 8.4 ± 0.7 8.3 ± 0.5
STZ 12.8 ± 4.2 ** 22.8 ± 4.3 ** 15.5 ± 2.7*
Naringenin 13.2 ± 3.5 ** 11.0 ± 1.9ΔΔ 10.1 ± 5.3ΔΔ
* पी < 0.05, ** पी < 0.01 बनाम नियंत्रण
0.01 बनाम एसटीजेड <

तालिका 2: समूहों और अवधियों में एसटीजेड चूहों के रक्त शर्करा का उपवास। डेटा को औसत ± s.d. * p < 0.05 ** p < 0.01 बनाम नियंत्रण, A3 p < 0.01 बनाम STZ के रूप में दिखाया गया है।

बीवी /टीवी (%) Tb.N (1/mm)
नियंत्रण 0.268 ± 0.046 5.35 ± 0.31
STZ 0.185 ± 0.081* 4.74 ± 0.77*
Naringenin 0.241 ± 0.032Δ 5.47 ± 0.19ΔΔ
* पी < 0.05 बनाम नियंत्रण
0.05 <, 0.01 बनाम एसटीजेड <

तालिका 3: समूहों में एसटीजेड चूहों के हड्डी द्रव्यमान से संबंधित पैरामीटर। डेटा को औसत ± s.d. * p < 0.05 बनाम नियंत्रण, 0.05 < P < 0.01 बनाम STZ के औसत के रूप में दिखाया गया है।

1/μm2 N.oc/T.Ar
नियंत्रण 0.000182 ± 8.84E-05
STZ 0.00024 ± 2.06E-05
Naringenin 0.000156 ± 3.88E-05ΔΔ
0.01 बनाम एसटीजेड <

तालिका 4: समूहों में एसटीजेड चूहों की ओस्टियोक्लास्ट गतिविधि। डेटा को औसत ± s.d. A.p < 0.01 बनाम STZ के रूप में दिखाया गया है।

ng/mL CTIX PINP
नियंत्रण 22 ± 8.98 1.64 ± 0.95
STZ 36.98 ± 22.57 5 ± 2.33 *
Naringenin 5.31 ± 2.09 ΔΔ 0.85 ± 0.02 ΔΔ
* पी < 0.05 बनाम नियंत्रण
0.01 बनाम एसटीजेड <

तालिका 5: समूहों में एसटीजेड चूहों की हड्डी पुनर्जीवन दर। डेटा को औसत ± एसडी * पी < 0.05 बनाम नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है, ए 0.01 बनाम एसटीजेड <।

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Discussion

फाइटोकेमिकल समाधान की तैयारी विवो में इसके आवेदन का आधार है। इस प्रोटोकॉल में, विभिन्न सॉल्वैंट्स, जैसे इथेनॉल, डीएमएसओ, ट्वीन 80 और 0.9% पीएस का उपयोग करके नारिंगेनिन समाधान की तैयारी का प्रदर्शन किया गया था। पूरी तरह से भंग स्थिति में समाधान को कुछ विस्तारित घंटों के लिए कमरे के तापमान पर रहने की अनुमति देकर आगे की निगरानी करने की आवश्यकता है, और फिर विवो में उपयोग करने से पहले फ़िल्टर किया जाना चाहिए।

विलायक निर्धारण इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। यौगिकों को भंग करने के लिए कई विलायक विकल्प हैं, जिनमें से इथेनॉल, डीएमएसओ और पीएस सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। इथेनॉल अपने अत्यधिक ध्रुवीय गुणों के कारण कई पानी-अघुलनशील यौगिकों को भंग कर सकता है, जिससे हाइड्रोजन बॉन्डिंग की अनुमति मिलती है और इस प्रकार ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय दोनों पदार्थों को भंग किया जाता है। इसके अलावा, इथेनॉल की एकाग्रता फाइटोकेमिकल यौगिक के गुणों को निर्धारित कर सकती है। पानी विलायक को पॉलीफेनोल्स की उच्चतम उपज निकालने के लिए सबसे अच्छा माना जाता है और इसमें सबसे मजबूत एंटी-ऑक्सीडेंट गुणहोते हैं। एक अन्य अध्ययन में पाया गया कि एंटी-ऑक्सीडेंट गुण 27 को व्यक्त करने के लिए पॉलीफेनोल अर्क के लिए इथेनॉल एकाग्रता को 150 डिग्री सेल्सियस पर 32.5% तक कमकिया जा सकता है। हालांकि, इथेनॉल की उच्च सांद्रता न्यूरोटॉक्सिसिटी और हेपेटोटॉक्सिसिटी28 का कारण बन सकती है। 8% -32% v / v से सांद्रता की एक सीमा में इथेनॉल इंजेक्शन (यानी) आमतौर पर व्यवहार मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जाता है और सशर्त स्वाद घृणा और हाइपोथर्मिया29 का कारण बन सकता है। डीएमएसओ उच्च ध्रुवीयता का एक द्विध्रुवीय एप्रोटिक विलायक है और इसका उपयोग कई कार्बनिक यौगिकों को भंग करने के लिए विलायक के रूप में किया जाता है। एक तुलनात्मक अध्ययन ने संकेत दिया कि डीएमएसओ / मेथनॉल (50: 50 वी / वी) के परिणामस्वरूप साइट्रस रिंड30 में फेनोलिक एसिड की इष्टतम उपज हुई। हालांकि, खुराक, एकाग्रता और आवृत्ति अनदेखी करने योग्य कारक नहीं हैं जब डीएमएसओ जानवरों को दिया जाता है। चूहों में इंट्रापरिटोनियल रूप से दी गई 17.7 ग्राम / किग्रा खुराक ने एलडी 50 प्राप्त किया, जबकि चूहों में 6 सप्ताह के लिए खुराक को 2.5 ग्राम / किलोग्राम तक कम करने से अवलोकन योग्यप्रतिकूल प्रभाव नहीं पड़ा। यद्यपि सुझाया गया डीएमएसओ एकाग्रता 0.5% -5% है, डीएमएसओ कई यौगिकों को भंग करने में सक्षम नहीं है। कोलुची एट अल ने चूहों में इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर और मौखिक प्रशासन द्वारा अलग-अलग सांद्रता में डीएमएसओ और डीएमएसओ युक्त खारा के प्रभावों का परीक्षण किया। अध्ययन से पता चला है कि खारा में 25% डीएमएसओ के समाधान ने पशु व्यवहार प्रतिक्रियाओंको नहीं बदला। ट्वीन 80 एक नॉनियोनिक सर्फेक्टेंट है और इसका व्यापक रूप से खराब घुलनशील दवाओं की घुलनशीलता को बढ़ाने और फार्माकोकाइनेटिक विशेषताओं को बढ़ाने के लिए सह-विलायक के रूप में उपयोग कियाजाता है। सुरक्षा33 को ध्यान में रखते हुए 1% ट्वीन 80 की एकाग्रता को चुना गया था। इस प्रकार, विभिन्न सांद्रता में उपरोक्त सॉल्वैंट्स और सर्फेक्टेंट्स का उपयोग इंट्रापरिटोनियल प्रशासन के लिए नारिंगेनिन को पूरी तरह से घुलनशील करने के लिए किया गया था।

कुछ सुझाव विचार के लिए यहां सूचीबद्ध हैं। सबसे पहले, हम खपत लागत पर विचार करते हुए प्रारंभिक प्रयोगों के लिए फाइटोकेमिकल यौगिक की एक छोटी मात्रा से शुरू करने का सुझाव देते हैं। दूसरा, समाधान तैयार करने से पहले व्यापक साहित्य अनुसंधान करना आवश्यक है, विशेष रूप से पशु प्रजातियों, बीमारियों, प्रशासन मार्गों और आवृत्ति के बारे में करीबी अध्ययन। तीसरा, सॉल्वैंट्स और सह-सॉल्वैंट्स जैसे सर्फेक्टेंट की एकाग्रता सीमा उपलब्ध साहित्य, प्रारंभिक प्रयोगों और अध्ययन डिजाइन के उद्देश्य पर निर्भर है। चौथा, नियमित सिरिंज के बजाय इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है ताकि इंजेक्शन की चोट को अपेक्षाकृत उच्च आवृत्ति से कम किया जा सके। पांचवां, बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए, 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके घोल को निष्फल करने और जीवित जानवरों में घोल इंजेक्ट करते समय शराब में भिगोए गए बाँझ सिरिंज और कपास स्वैब का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

प्रोटोकॉल के फायदे इसके सरल संचालन और कम लागत हैं। सारांश में, प्रोटोकॉल चूहों में इंट्रापरिटोनियल प्रशासन के लिए एक फाइटोकेमिकल समाधान की तैयारी को दर्शाता है, जिसमें एक उदाहरण के रूप में नारिंगेनिन है। प्रोटोकॉल दवा स्क्रीनिंग या फार्माकोलॉजी से निपटने वाले शोधकर्ताओं को लाभान्वित करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81973607 और 81573992) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL  microtubes Corning Science (Wujiang) Co. 23218392 Holding liquid
Automatic Dehydrator Leica Microsystems (Shanghai) Co. LEICA ASP 300S Dehydrate samples
Blood glucose test strips Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. 4130392
Centrifuge MIULAB Minute centrifuge Centrifugal solution
Dehydrator Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. LEICA  ASP300S Dehydration
DMSO Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. E918BA0041 Co-Solvent
ELISA assay kit Elabscience Biotechnology Co.,Ltd Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c
Mouse  CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c
Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c
Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c
Ethanol absolute Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10009218 Co-Solvent
Ethylene glycol monoethyl ether Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. A501118-0500 TRAP staining
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10009617 Decalcification
Filter Merck Millpore LTD. Millex-GP, 0.22 µm filter solution
Glacial acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10000218 TRAP staining
Glucose meter Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. One Touch Ultra Vue Serial number:COJJG8GW
Grinder Shanghaijingxin Experimental Technology Tissuelyser-24
Hematoxylin Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute D005 TRAP staining
Insulin syringe Shanghai Kantaray Medical Devices Co. 0.33 mm x 13 mm, RW LB Intraperitoneal injection
L-(+) tartaric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 100220008 TRAP staining
Microscope OLYMPUS sz61 Observation
Microtome Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. LEICA RM 2135 Section
Mini centrifuge Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd.  Mini-6KC Centrifuge
Naphthol AS-BI phosphate SIGMA-ALDRICH BCBS3419 TRAP staining
Naringenin Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd 102764 Solute
Paraffin Embedding station Leica Microsystems (Shanghai) Co. LEICA  EG 1150 H, LEICA  EG 1150 C Embed  samples
Pararosaniline base BBI Life Sciences E112BA0045 TRAP staining
Pipettes eppendorf 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL   transferre Liquid
Plate reader BioTek Instruments USA, Inc. BioTek CYTATION 3 imaging reader ELISA
Resin Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. Neutral balsam TRAP staining
saline (0.9 PS) Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd A6E1323 Solvent
Sodium acetate anhydrous Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd Merck-1.06268.0250 | 250g TRAP staining
Sodium nitrite Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10020018 TRAP staining
Tween-80 Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. E819BA0006 Emulsifier
Zirconia beads Shanghaijingxin Experimental Technology 11079125z 454g Grinding

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References

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Liu, S., Dong, J., Bian, Q. Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application. J. Vis. Exp. (174), e62736, doi:10.3791/62736 (2021).

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