Summary
ここで、プロトコルは、 インビボ 腹腔内投与のためのナリンゲニン溶液の調製を提示する。ナリンゲニンは、ジメチルスルホキシド、トゥイーン80、および生理食塩水の混合物に完全に溶解します。ナリンゲニンの抗糖尿病性骨粗鬆症効果は、血糖値検査、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色、および酵素結合免疫吸着アッセイによって評価されました。
Abstract
化合物(ファイトケミカル)溶液の調製は、薬物スクリーニングなどの研究に適用する前に見過ごされていますが重要なステップです。化合物の完全な可溶化は、その安全な使用および比較的安定した結果のために必要です。ここでは、高脂肪食およびストレプトゾトシン(STZ)誘発糖尿病モデルにおけるナリンゲニン溶液およびその腹腔内投与を調製するためのプロトコルが例として実証される。少量のナリンゲニン(3.52〜6.69 mg)を使用して、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および生理食塩水(PS)で再構成されたDMSOとTween 80を含む溶媒への可溶化をテストしました。化合物の完全な可溶化は、溶液の色、遠心分離後の沈殿物の存在(2000 x g で30秒間)、または溶液を室温(RT)で2時間放置することによって決定されます。安定した化合物/ファイトケミカル溶液を得た後、 in vivo 研究に必要な化合物の最終濃度/量を溶媒のみ(PSなし)のストック溶液で調製し、必要に応じてPSで希釈/混合することができます。マウスにおけるナリンゲニンの抗糖尿病性骨粗鬆症効果(20 mg / kg b.w.、2 mg / mLでの腹腔内投与)は、血糖値、骨量(マイクロCT)、および骨吸収率(TRAP染色およびELISA)を測定することによって評価されました。.詳細な有機/植物化学溶液調製物を探している研究者は、この技術の恩恵を受けるでしょう。
Introduction
薬物スクリーニングのための植物化学物質の使用に関する研究の増加に伴い、それらの最適な効果を評価するために植物化学溶液を調製するアプローチは注目に値する。化合物1を調製する際には、溶解方法、投与量、濃度などの多くの側面を考慮する必要があります。
溶媒系溶解は、有機化合物調製1に広く用いられている。一般的に使用される溶媒には、水、油、ジメチルスルホキシド(DMSO)、メタノール、エタノール、ギ酸、トゥイーン、グリセリンなどが含まれます2。化合物を胃管投与する場合は、未溶解物質を含む懸濁液が許容されますが、静脈内投与には完全に溶解した溶質が重要です。.油性溶液、懸濁液、およびエマルジョンは毛細血管塞栓症を引き起こす可能性があるため、特に静脈内、筋肉内、腹腔内注射を投与する場合は、化合物調製用の水溶液が推奨されます3。
有効用量範囲は化合物間、および同じ化合物で治療された疾患間でも異なります。.有効用量および安全用量および濃度の決定は、文献および予備実験に依存する4。ここでは、化合物ナリンゲニンの調製が一例として実証される。
ポリフェノール化合物であるナリンゲニン(4,5,7-トリヒドロキシフラバノン)は、肝保護活性5、抗糖尿病6、抗炎症7、および抗酸化活性8の疾患治療で研究されています。インビボ用途では、ナリンゲニンの経口投与が一般的に使用されます。以前の研究では、0.5%〜1%カルボキシメチルセルロース、0.5%メチルセルロース用量、0.01%DMSO、および生理食塩水(PS)でナリンゲニン溶液を50〜100 mg / kgで調製し、経口強制投与で投与したと報告されています9,10,11,12。.その上、他の研究は、3.6 g / kg / d13,14の用量で経口摂取のために3%(wt / wt)でチャウチャウでナリンゲニンを補給することを報告しています。研究では、エタノール(0.5%v / v)、PS、およびDMSOを使用して、腹腔内注射用のナリンゲニンを10〜50 mg / kgで溶解することも報告されています15,16,17,18。側頭葉てんかんの研究では、マウスはPS19に溶解した0.25%カルボキシメチルセルロースに懸濁したナリンゲニンの注射を受けた。これらの研究では、ナリンゲニン溶液を調製するためのさまざまな溶媒の使用が報告されていますが、溶解状態や動物の反応などの詳細は報告されていません。.
このプロトコルは、糖尿病誘発性骨粗鬆症におけるin vivo適用のためのナリンゲニン溶液を調製するための手順を導入する。注射液の調製には、溶媒および化合物の調製、投与量推定、溶解プロセス、および濾過が含まれる。投与量は、文献研究および予備実験に基づいて、毎日3日間注射を投与した後にマウスを監視し、マウスの行動に応じて投与量を変更することにより決定した。最終的に選択された濃度(20 mg / kg b.w.)は、高脂肪食およびストレプトゾトシン(STZ)誘発糖尿病マウス20,21で週5日、8週間腹腔内投与されました。糖尿病性骨粗鬆症におけるナリンゲニンの効果は、血糖値検査、マイクロCT、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって評価されました。
全体として、40〜400 mg / mLの濃度範囲のナリンゲニンは、エタノールまたはDMSOまたは5%(エタノールまたはDMSO)と95%PS(v / v)のいずれにも完全に溶解しないことが観察されました。しかしながら、ナリンゲニンは3.52%DMSO、3.52%トゥイーン80、および92.96%PSの混合物に完全に溶解した。詳細な手順は、研究者が in vivo アプリケーション用の注射溶液として化合物を調製するのに役立ちます。
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Protocol
記載されている調査は、国家研究評議会の実験動物の世話と使用に関するガイドラインに準拠しており、上海中医薬大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。実験を行う際には、安全のために白衣、使い捨てニトリル手袋、ゴーグルが必要です。
1. in vivo 応用に必要な溶媒の調製とナリンゲニンの推定
- 次の溶媒を準備します:Tween-80(最終濃度範囲:0.5%-1%)、DMSO、グリセリン(最終濃度範囲:15%-20%)、エタノール(最終濃度範囲:筋肉内注射用12%)22、および0.9%PS。
- 用量、マウスの数、および注射頻度に基づいて、必要なナリンゲニンの量を推定します。
- 10匹のマウス(C57BL/6、雄、5週齢、SPF)にナリンゲニンを週5日8週間投与するように注文します。マウスを特定の病原体のない(SPF)状態に保ちます。
注:腹腔内注射に必要な用量は20 mg / kg b.w.23です。 - 次の計算に基づいて160 mgのナリンゲニンを量ります:20 mg / kg x 0.02 kg /マウスx 10マウスx 5日/週x 8週間= 160 mg。
- 10匹のマウス(C57BL/6、雄、5週齢、SPF)にナリンゲニンを週5日8週間投与するように注文します。マウスを特定の病原体のない(SPF)状態に保ちます。
- 生体内に注射されるナリンゲニンの濃度を計算します。
- マウスの体重に基づいて推奨容量を準備します。各マウスに適用されるナリンゲニンの推奨量は、体重の1%(0.3mL)です。.この実験では、マウスあたり0.2mLを使用しました。
- 総容量を計算します:マウスあたり0.2 mL x 10匹のマウスx 5日/週x 8週間= 80mL。
- 在庫中のナリンゲニンの濃度を計算します:160 mg / 80 mL溶媒= 2 mg / mL。
- 毎日の容量を計算します:マウスあたり0.2 mL x 10匹のマウス= 2 mL。
2. 解散
- エタノール溶液
- 2 mg/mLのナリンゲニン溶液を調製するには、3.52 mgのナリンゲニンを量り、2.0 mLのチューブに加えます。
注:2 mg / mLの濃度を達成するには、必要な総容量は1760 μLになります(計算:3.52 mg / 1760 μL = 2 mg / mL)。 - すばやくスピンダウン(2000 x g で30秒間)して、ナリンゲニン粉末をチューブの底に沈降させます(図1A)。
- 8.8 μLの100%エタノールをチューブに加え、必要な総量に対して0.5%(v/v)溶液を調製します2。ナリンゲニンは完全には溶解しません(図1B)。
- 引き続き79.2 μLの100%エタノールをチューブに追加して、必要な総量に対して5%(v / v)溶液を調製します(計算:(79.2 μL + 8.8 μL)/ 1760 μL x 100% = 5%)。ナリンゲニンは完全には溶解しません(図1B)。
- ステップ2.1.4の説明に従って、5%エタノールを含むチューブに1672μLの0.9%PSを追加します。これにより、エマルジョンが生成されます(図1D)。溶液を遠心分離機(2000 x g で30秒間)して、ナリンゲニンが溶液に完全に溶解しているかどうかを確認します。溶解していないナリンゲニンの白色沈殿物が溶液中に現れる(図1E)。
- 2 mg/mLのナリンゲニン溶液を調製するには、3.52 mgのナリンゲニンを量り、2.0 mLのチューブに加えます。
- DMSOソリューション
- 2 mg/mLでナリンゲニン溶液を調製するには、3.95 mgのナリンゲニンを量り、2.0 mLチューブに加えます。
注:2 mg / mLの濃度を達成するには、必要な総容量は1975 μLになります(計算:3.95 mg / 1975 μL = 2 mg / mL)。 - すばやくスピンダウン(2000 x g で30秒)して、ナリンゲニン粉末をチューブの底に沈降させます。
- 9.8 μLのDMSOをチューブに加え、0.5%(v/v)溶液を調製します(計算:9.8 μL/1975 μL x 100% = 5%)。ナリンゲニンは完全に溶解します(図2A)。
- 88.2 μLのDMSOをチューブに加え、必要な総量に対して5%(v/v)溶液を調製します(計算:(88.2 μL + 9.8 μL)/1975 μL x 100% = 5%)。ナリンゲニンは完全に溶解します(図2B)。
- ステップ2.2.4で調製した溶液に1877μLの0.9%PS(v/vパーセント95%)を加えます。エマルジョンが生成されます(図1C)。溶液を遠心分離機(2000 x g で30秒間)して、ナリンゲニンが溶液に完全に溶解しているかどうかを確認します。溶解していないナリンゲニンの白色沈殿物が溶液中に現れる(図1D)。
- 2 mg/mLでナリンゲニン溶液を調製するには、3.95 mgのナリンゲニンを量り、2.0 mLチューブに加えます。
- トゥイーン-80およびDMSOソリューション
- 2 mg/mLでナリンゲニン溶液を調製するには、6.69 mgのナリンゲニンを量り、5.0 mLのチューブに加えます。
注:最終濃度2 mg / mLを達成するには、必要な総溶液容量は3345 μLになります(計算:6.69 mg / 3345 μL = 2 mg / mL)。 - すばやくスピンダウン(2000 x g で30秒)して、ナリンゲニン粉末をチューブの底に沈降させます。
- 117.7 μLのDMSOを加えて、必要な総量に対して3.5%(v/v)の溶液を調製します(計算:117.7 μL / 3345 μL x 100% = 3.5%)。ナリンゲニンは完全に溶解します(図3A)
- ステップ2.3.3で調製した溶液に117.7 μLのトゥイーン80を加えると、3.5%(v/v)トゥイーン80および3.5%(v/v)DMSOが得られます。ナリンゲニンの完全な溶解を観察します(図3B)
- ステップ2.3.4で調製した溶液を、3109.6 μLの0.9%PS(v/vパーセントの93%)を含む5.0 mLチューブにゆっくりと加え、よく振って明らかなナリンゲニン溶液を得ます(図3C)。
- ステップ2.3.5で調製した溶液を室温(RT)で2時間放置します。溶液は目に見える沈殿物なしでまだ明らかです(図3D)。
- 2 mg/mLでナリンゲニン溶液を調製するには、6.69 mgのナリンゲニンを量り、5.0 mLのチューブに加えます。
- インビボ投与のためのナリンゲニン溶液の調製
- ステップ1.2.2に従って、160 mgのナリンゲニンを計量します(160 mg / 2 mg / mL = 80 mL)。
- 2.8 mLのDMSOを加えて3.5%(v/v)溶液を得る(計算:2.8 mL / 80 mL x 100% = 3.5%)
- 次に、ステップ2.4.2で調製した溶液に2.8 mLのトゥイーン80を加えて、3.5%(v / v)トゥイーン80および3.5%(v / v)DMSOを達成します。
- ステップ2.4.3で調製した溶液を4本のチューブに分注し、チューブあたり1.4mL[(2.8mL + 2.8mL)/ 4 = 1.4mL]します。
- 18.6 mLの0.9%PSを5本の15 mLチューブに分注します。
- ステップ 2.4.3 で調製した溶液(ストック溶液)および 2.4.5 を 4 °C で保存します (2.8 mL + 2.8 mL + 18.6 mL x 4 = 80 mL)。
- 140 μLのストック溶液を取り(ステップ2.4.3)、1860 μLの0.9%PSと混合して、2 mLのナリンゲニン溶液を調製し、1日間の投与を行います。
- 溶液を0.2 μmフィルターでろ過します。
3.ナリンゲニン溶液投与
- 取り扱いと拘束
- 蓋を開ける前に、ケージと手に70〜75%のアルコールをスプレーします。マウスの尾の付け根を持ち上げて固い面に置いて、尾をそっと後ろに置きます。
- 左手の親指と人差し指で耳の後ろの首筋をつかみ、小指と薬指の間に尾を置きます。マウスを仰臥位に保ち、後端をわずかに持ち上げます。
- 注射
- 腹部の皮膚が緊張するように、マウスの背面の皮膚をつかみます。
- 膀胱、肝臓、またはその他の内臓に当たらないように、腹部の右下または左の象限で、針と腹面の間の10°の角度で針(インスリン注射器)を押し込みます。
- 針を頭蓋方向に3〜5 mm皮下に走らせてから、45°の角度で腹腔内に挿入します。
- 針が腹壁を通過して抵抗がなくなったら、吸引を行って還流物質が引き抜かれていないことを確認します。次に、溶液をゆっくりと押します。
- 注入後、ゆっくりと針を引き抜き、漏れを防ぐために少し回転させます。推奨容量は50〜100μL / 10 gです。
- 残ったナリンゲニンはバイオハザード容器に入れて処分してください。
4.血糖値検査
注:注射の1日前と注射の1か月後と2か月後に血糖値をテストします。
- 血糖値テストの前にマウスを15時間絶食させます。水は引き続き供給できます。
- テストストリップを開き、日付をマークします。開封後は、3ヶ月以内にテストストリップを使用してください。テストストリップは2〜30°Cで保管してください。 湿気の形成を防ぐために、ストリップを取り外した後は蓋をしっかりと閉めてください。
- 動物を誘導室に入れます。イソフルランの場合は4%、酸素の場合は4 L / minの誘導レベルで気化器をオンにします。動物が完全に麻酔された後、ノーズコーンで麻酔薬を維持し、麻酔薬をイソフルランで1.5%、酸素で0.4 L / minのレベルに維持します。.
- 70%〜75%のアルコールに浸した綿棒/綿棒で尾を拭きます。
- 尾の最下点から始めて、25Gの針刺しで外側尾静脈に小さな穴を開け、一滴の血液を絞り出します。
- ティッシュペーパーで血滴を拭きます。
- もう一滴の血液を絞り出し、テストストリップの端に集めます。
- 血糖値計に表示される結果を読んで記録します。
- 出血を止めるには、滅菌ガーゼでマウスの尾をつまみ、75%アルコールでその領域を拭きます。
- 追加のサンプルは、尾を頭蓋上に移動させる同様の技術によって得ることができる。
5.トラップ染色
- スライドの準備
- 週に一度、マウスの空腹時血糖値検査を行います。血糖値が11.1 mmol / L≥(II型糖尿病マウスモデル24の成功を示す)の場合、CO2を使用してマウスを安楽死させ、続いて頸椎椎間板座を行い、腰椎4〜6番目(L4-L6)を収集します(空腹時血糖値検査中は安楽死は行われません)。
- L4-L6サンプルを4%パラホルムアルデヒドで24時間固定し(パラホルムアルデヒドの体積が組織の体積の>20倍であることを確認してください)、水道水の連続流で2時間洗浄します。
- サンプルを脱灰するには、サンプルが軟化するまで、10%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液に静置状態でRTで2週間浸漬します。脱灰溶液の体積が組織/サンプルの体積の20〜30倍であることを確認してください。EDTAソリューションを1日おきに変更してください。
- 脱水機を使用してサンプルを脱水します。
- 標本を組織処理埋め込みカセットに入れます。鉛筆を使用してカセットに番号を付けます。
- 脱水プログラムを次のように設定します:2時間で75%アルコール、1時間で85%アルコール、1時間で95%アルコール、2時間で95%アルコール、2時間で無水エタノール(I)、2時間で無水エタノール(II)、2時間で無水エタノール(III)、1時間でキシレン(I)、1時間でキシレン(II)、1時間でキシレン(III)、 パラフィンワックス(I)を2時間、パラフィンワックス(II)を2時間、RTで。
- サンプルをパラフィンワックスに埋め込みます。
- パラフィン包埋ステーションのカセットトレイにパラフィンワックスを加え、60°Cに加熱する。 脱水した標本を少なくとも2時間浸します。
- ティッシュカセットをカセットトレイに入れて予熱します。
- パラフィンワックスをパラフィンリザーバーに加え、60°Cに加熱します。
- 2時間後、ティッシュカセットと検体の両方を作業エリアに持っていきます。予熱したパラフィンワックスをパラフィンリザーバーからティッシュカセットに注ぎます。標本をパラフィンワックスに入れ、パラフィンワックスが組織を完全に覆っていることを確認してから、すぐにカセットをアイシングステーションに移動します。
- ミクロトームを使用して、パラフィン包埋サンプルを5〜6 μmのセクションに切断します。切片を40°Cの温水で10秒未満広げます。APS(アミノシラン)コーティングされたスライドガラスの切片を収集します。スライドをRTで1時間乾燥させた後、スライドを60°Cに設定したオーブンに入れて一晩移動します。
- TRAP試薬の調製
- 塩基性ストックインキュベーション溶液の調製:無水酢酸ナトリウム9.2 g、L-(+)酒石酸11.4 g、および氷酸2.8 mLを蒸留水1000 mLに溶解します。pHを4.7〜5.0に調整し、RTで最大6か月間保管します。
- ナフトールエーテル溶液の調製:0.1 gのナフトールAS-BIリン酸を5 mLのエチレングリコールモノエチルエーテルに溶解します。4°Cで最大5週間保存します。
- 亜硝酸ナトリウム溶液の準備:1 gの亜硝酸ナトリウムを25 mLの蒸留水に溶解します。4°Cで保存してください。
- パラロサニリン色素の調製:1 gのパラロサニリン塩基を20 mLの2N HCl(417 mLの水に83 mLのHCl)に加えます。攪拌板を使用してベースを溶解し、使用前にろ過します。
- トラップ染色
- 2つのCoplinジャーに50 mLの塩基性ストックインキュベーション溶液を入れ、37°Cのオーブンに2時間入れます。
- コプリンジャーを1つ取り、0.5mLのナプトールエーテル溶液を加えます。
- スライドをコプリンジャーに入れ、37°Cで1時間インキュベートします。
注:グループごとに少なくとも3つのスライドを準備します。 - インキュベーション時間が終了する数分前に、1 mLの亜硝酸ナトリウム溶液と1 mLのパラロサニリン染料を加えます。30秒間穏やかに混合し、2分間放置します。
- ステップ5.2.2で準備した溶液を、塩基性ストック溶液を含む他の予熱されたCoplinジャーに追加します。溶液をよく混合し、ステップ5.3.3でCoplinジャーからスライドを挿入します。
- RTで15〜20分間インキュベートします。
- スライスを別のコプリンジャーで200 mLのPBSで5分間すすぎます。
- コプリンジャーでスライスを100%ヘマトキシリンで30秒間対比染色します。
- スライスを85%、95%、および100%アルコール(200 mL)でそれぞれ2分間脱水し、キシレン(200 mL)で2分間3回処理します。 コプリンジャーを使用して各ステップを実行します。
- カバーガラスのセクションを樹脂を使用したカバーガラスで固定します。気泡の閉じ込めを避けてください。
6.エリサ
- サンプル調製
- マウスの大腿骨と脛骨から軟部組織を取り除きます。ガーゼで骨をきれいにします。
- 骨サンプルを1 mLの微量遠心チューブに入れ、サンプルチューブを-80°Cで保管します。
注:サンプルは、液体窒素タンクに6か月以内保管することもできます。 - 骨サンプルの重量を量ります。0.9%PSで1:10の比率で希釈します。例えば、0.1gの骨を1mLのPSで希釈する。
- 3 mmのジルコニアビーズをチューブに加え、サンプルを70 Hzで30秒間3倍に粉砕し、その間に20秒の休息を取ります。
- サンプルを4°C、12,000 x g で5分間遠心分離します。上清を集める。
- ELISA検査キット
注意: 製造元が指定したアッセイプロトコルに従ってELISAを実行してください。- 標準、ブランク、サンプルの各希釈液を100 μLずつ適切なウェルに加えます。37°Cで90分間インキュベートします。
- 各ウェルから液体をデカントし、100 μLのビオチン化検出抗体作業溶液を加えます。37°Cで1時間インキュベートします。
- 溶液をデカントし、350 μLの洗浄バッファーを各ウェルに加えます。1分間浸し、3回繰り返します。
- 100 μLのHRPコンジュゲート作業溶液を各ウェルに加えます。37°Cで30分間インキュベートします。
- ソリューションをデカントします。手順6.2.3の説明に従って、洗浄プロセスを5回繰り返します。
- 基質試薬を90 μL加えます。光から保護された37°Cで15分間インキュベートします。
- 50 μLのストップ溶液を加えます。
- プレートリーダーを使用して、450 nmにおける各ウェルの吸光度を記録します。
- 検量線の生成
- 段階希釈されたタンパク質濃度に対してそれぞれの平均吸光度値をプロットします。
- ポイントを結合して、最適なフィット曲線を作成します。任意の適切なコンピュータアプリケーション(スプレッドシート)を使用して、検量線方程式を生成します。
- 各試料の吸光度値を検量線式に代入し、それぞれの試料の濃度を求める。
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Representative Results
高脂肪食給餌およびSTZ誘発糖尿病マウスの体重は、STZ治療後0〜8週間から対照群の体重と比較して減少することが見出された。ナリンゲニン投与マウスの体重減少は、4週目の非処置マウス(STZ群)と比較して有意であった。対照群およびSTZ群には、同じ容量のPSを投与した(表1)。糖尿病マウスの血糖値は、STZ誘導後1か月以内に劇的に上昇しました。その後、動物モデルが確立された2か月前に観察されたレベルに自動的に減少しました。ナリンゲニン処理は、1ヶ月と2ヶ月でそれぞれ血糖値を51.8%と34.8%低下させました(表2)。STZ誘発糖尿病マウスは、それぞれ骨量/組織体積(BV/TV)の減少(30.97%)と小柱数(Tb.N)(11.4%)によって示されるように、骨量減少を示した。これら2つのパラメータの値の変化は、ナリンゲニン治療が骨量減少を有意に救ったことを示唆しています(表3)。N.oc/Tb.Ar(骨梁面積当たりの破骨細胞数)で示される破骨細胞活性は、高脂肪食およびSTZ誘発糖尿病マウスで増加したが、対照モデルと疾患モデルの間に統計学的有意性は観察されなかった。ナリンゲニン処理は、 図 4および 表4に示すように、破骨細胞活性を有意に低下させた。糖尿病動物では、I型コラーゲン(CTIX)のC末端テロペプチドとI型プロコラーゲン(PINP)のN末端プロペプチドがそれぞれ68.09%および204.88%上昇し、骨吸収率の劇的な増加を示しました。ナリンゲニンは、骨吸収速度の両方の指標を有意に低下させた(表5)。
図1:ナリンゲニンをエタノールに溶解する 。 (a)スピンダウン後のチューブ内のナリンゲニン粉末。(B)ナリンゲニン+エタノール(400 mg / mL - 8.8 μLのエタノール中の3.52 mgのナリンゲニン)。(C)ナリンゲニン+エタノール(40 mg / mL-8.8 μLのエタノール中の3.52 mgのナリンゲニン)(D)5%(v / v)エタノール中のナリンゲニンおよび95%PS(0.9%)。(e)スピンダウン後に D に析出する。(F)図 1、図 2、 および図3のスケールバーを取得するための測定。ナー:ナリンゲニン。スケールバー= 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ナリンゲニンをDMSOに溶解する。 (A)ナリンゲニン+ DMSO(400 mg / mL - 9.8 μLのDMSO中の3.95 mgのナリンゲニン)。(B)ナリンゲニン+ DMSO(98μLのDMSO中に40mg/mL〜3.95mgのナリンゲニン)。(C)5%(v / v)DMSOおよび95%PS(0.9%)中のナリンゲニン。(d)スピンダウン後に C 中に析出する。ナー:ナリンゲニン。スケールバー= 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ナリンゲニンをDMSOおよびトゥイーン80に溶解する。 (A)ナリンゲニン+ DMSO(57.2 mg / mL - 117.7 μLのDMSO中の6.69 mgのナリンゲニン)。(B)ナリンゲニン+ DMSO + トゥイーン(57.2 mg / mL-117.7 μLのDMSOおよび117.7 μLのトゥイーン80中の6.69 mgのナリンゲニン)。(C)3.5%(v / v)DMSO、3.5%(v / v)トゥイーン80、および93%PS(0.9%)の混合物中のナリンゲニン。(D)スピンダウン後の C に析出物がない。ナー:ナリンゲニン。スケールバー= 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:高脂肪食給餌およびSTZ注射(STZ)マウスの破骨細胞活性に対するナリンゲニンの効果。 L4椎骨の骨梁および破骨細胞のTRAP染色。三角形は破骨細胞を示した。スケールバー= 100μm。この図はLiuら25から修正されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| (g) | 0週間 | 1週間 | 2週間 | 4週間 | 5週間 | 6週間 | 8週間 |
| コントロール | 23.7± 0.2 | 25.1 ± 1.3 | 26.2 ± 1.0 | 27.7 ± 0.5 | 31.1 ± 0.7 | 31.7± 0.8 | 32.7 ± 1.3 |
| ティッカー | 16.8 ± 1.7** | 18.2 ± 2.5** | 18.6 ± 2.5** | 18.2 ± 1.4** | 21.3 ± 1.6** | 22.0 ± 1.4** | 20.8 ± 1.4** |
| ナリンゲニン | 16.6 ± 1.1** | 17.6 ± 1.5** | 17.4 ± 1.7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0.01 対コントロール | |||||||
| ΔΔ p < 0.01 対 STZ | |||||||
表1:高脂肪食給餌およびSTZ注射(STZ)マウスの群および期間にわたる体重。 データは、対照±平均** p < 0.01、ΔΔ p < 0.01対として示す。ティッカー
| (ミリモル/リットル) | 0ヶ月 | 1ヶ月 | 2ヶ月 |
| コントロール | 4.9 ± 0.9 | 8.4 ± 0.7 | 8.3 ± 0.5 |
| ティッカー | 12.8 ± 4.2** | 22.8 ± 4.3** | 15.5 ± 2.7※ |
| ナリンゲニン | 13.2 ± 3.5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0.05, ** p < 0.01 対コントロール | |||
| ΔΔ p < 0.01 対 STZ | |||
表2:群および期間にわたるSTZマウスの空腹時血糖。データは、対照±平均s.d. * p < 0.05 ** p < 0.01 対対照、ΔΔ p < 0.01対STZとして示される。
| BV/テレビ (%) | Tb.N (1/mm) | |
| コントロール | ±0.268± ±0.046 | 5.35± 0.31 |
| ティッカー | 0.185± 0.081* | 4.74 ± 0.77* |
| ナリンゲニン | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0.05 対コントロール | ||
| Δ p < 0.05, ΔΔ p < 0.01 対 STZ | ||
表3:群間のSTZマウスの骨量関連パラメータ。データは、対照±s.d. * p < 0.05、Δ p < 0.05、ΔΔ p < 0.01 対STZの平均として示されています。
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| コントロール | 0.000182 ± 8.84E-05 |
| ティッカー | 0.00024 ± 2.06E-05 |
| ナリンゲニン | 0.000156 ± 3.88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0.01 対 STZ | |
表4:群間のSTZマウスの破骨細胞活性。 データは、STZ±0.01
| ng/mL | ティッカー | ピンプ |
| コントロール | 22 ± 8.98 | 1.64 ± 0.95 |
| ティッカー | 36.98± 22.57 | 5 ± 2.33 * |
| ナリンゲニン | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0.05 対コントロール | ||
| ΔΔ p < 0.01 対 STZ | ||
表5:群間のSTZマウスの骨吸収率。 データは、対照±0.05
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Discussion
植物化学溶液の調製は、 インビボでのその適用の基礎である。このプロトコルでは、ナリンゲニン溶液の調製は、エタノール、DMSO、Tween 80、および0.9%PSなどの異なる溶媒を使用することによって実証されました。完全に溶解した状態の溶液は、室温で長時間放置し、 その後、in vivoで使用する前にろ過して、さらに監視する必要があります。
溶媒測定は、このプロトコルの重要なステップです。化合物を溶解するための多くの溶媒オプションがあり、そのうちエタノール、DMSO、およびPSが最も広く使用されています。エタノールは、その高い極性特性のために多くの水不溶性化合物を溶解することができ、水素結合を可能にし、したがって極性物質と非極性物質の両方を溶解する。さらに、エタノールの濃度は、植物化学物質の性質を決定し得る。たとえば、75重量%のエタノール/水溶媒は、ポリフェノールの最高の収率を抽出するのに最適であると考えられており、最も強い抗酸化特性を持っています26。別の研究では、ポリフェノール抽出物が抗酸化特性を発現するために、エタノール濃度を150°Cで32.5%に下げることができることがわかりました27。ただし、高濃度のエタノールは神経毒性と肝毒性を引き起こす可能性があります28。8%〜32%v / vの濃度の範囲のエタノール注射(i.p.)は、行動評価に一般的に使用され、条件付き味覚嫌悪および低体温症を引き起こす可能性があります29。DMSOは極性の高い双極性非プロトン性溶媒であり、多数の有機化合物を溶解する溶媒として使用されます。比較研究では、DMSO/メタノール(50:50 v / v)が柑橘類の皮のフェノール酸の最適収率をもたらすことが示されました30。ただし、DMSOが動物に送達されるとき、用量、濃度、および頻度は無視できない要因ではありません。マウスで腹腔内に投与された17.7 g / kg用量はLD50を達成しましたが、マウスでは6週間用量を2.5 g / kgに下げましたが、観察可能な副作用を引き起こしませんでした31。推奨されるDMSO濃度は0.5%〜5%ですが、DMSOは多くの化合物を溶解することはできません。Colucciらは、マウスの脳室内および経口投与により、異なる濃度のDMSOおよびDMSO含有生理食塩水の効果をテストしました。この研究は、生理食塩水中の25%DMSOの溶液が動物の行動反応を変えないことを示しました32。Tween 80は非イオン性界面活性剤であり、難溶性薬物の溶解性を高め、薬物動態学的特徴を高めるための共溶媒として広く使用されています33。安全性を考慮して1%トゥイーン80の濃度を選択しました33。したがって、異なる濃度の上記の溶媒および界面活性剤を、腹腔内投与のためにナリンゲニンを完全に可溶化するために使用した。
検討のために、いくつかの提案がここにリストされています。まず、消費コストを考慮した予備実験のために、少量のファイトケミカル化合物から始めることをお勧めします。第二に、溶液を調製する前に、包括的な文献調査、特に動物種、病気、投与経路、頻度に関する綿密な研究を行う必要があります。第三に、界面活性剤などの溶媒および共溶媒の濃度範囲は、入手可能な文献、予備実験、および研究デザインの目的に依存します。第四に、通常の注射器の代わりにインスリン注射器を使用することは、比較的高い投与頻度による注射傷害を軽減するために推奨される。第五に、無菌状態を維持するために、0.2μmフィルターを使用して溶液を滅菌し、溶液を生きた動物に注入するときは、アルコールに浸した滅菌注射器と綿棒を使用することをお勧めします。
プロトコルの利点は、その簡単な操作と低コストです。要約すると、プロトコルは、例としてナリンゲニンを用いて、マウスにおける腹腔内投与のための植物化学溶液の調製を実証する。このプロトコルは、薬物スクリーニングまたは薬理学を扱う研究者に利益をもたらします。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(81973607および81573992)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
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