Summary
여기서, 상기 프로토콜은 생체내 복강 내 투여를 위한 나린제닌 용액의 제조를 제시한다. 나린제닌은 디메틸설폭사이드, 트윈 80 및 식염수의 혼합물에 완전히 용해된다. 나린제닌의 항당뇨병성 골다공증 효과는 혈당 검사, 주석산 내성 산 포스파타제 염색 및 효소 결합 면역 흡착 분석에 의해 평가되었습니다.
Abstract
화합물(파이토케미컬) 용액의 제조는 약물 스크리닝과 같은 연구에 적용되기 전에 간과되지만 중요한 단계입니다. 화합물의 완전한 가용화는 안전한 사용과 비교적 안정적인 결과를 위해 필요합니다. 여기서, 고지방 식이에서 나린제닌 용액을 제조하고 이의 복강내 투여를 위한 프로토콜과 스트렙토조토신(STZ) 유도 당뇨병 모델을 예로 들 수 있다. 소량의 나린제닌(3.52-6.69mg)을 사용하여 각각 에탄올, 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 DMSO 플러스 생리 식염수(PS)로 재구성한 트윈 80을 포함한 용매에서 가용화를 테스트했습니다. 화합물의 완전한 가용화는 용액의 색상, 원심 분리 후 침전물의 존재 여부 (30 초 동안 2000 x g ) 또는 용액을 실온 (RT)에서 2 시간 동안 방치함으로써 결정된다. 안정한 화합물 / 식물 화학 용액을 얻은 후, 생체 내 연구에 필요한 화합물의 최종 농도 / 양은 용매 전용 (PS 없음) 스톡 용액에서 제조 한 다음 원하는대로 PS와 희석 / 혼합 할 수 있습니다. 마우스에서 나린제닌의 항당뇨병 골다공증 효과(20mg/kg BW, 2mg/mL에서 복강 내 투여)는 혈당, 골량(micro-CT) 및 골 흡수율(TRAP 염색 및 ELISA)을 측정하여 평가했습니다. 상세한 유기/식물화학 용액 준비를 원하는 연구원은 이 기술의 이점을 누릴 수 있습니다.
Introduction
약물 스크리닝을위한 식물 화학 화합물의 사용에 관한 연구가 증가함에 따라 최적의 효과를 평가하기 위해 식물 화학 용액을 준비하는 접근법에주의를 기울일 가치가 있습니다. 용해 방법, 투여량 및 농도와 같은 많은 측면이 화합물1을 제조할 때 고려되어야 한다.
용매 기반 용해는 유기 화합물 제조1에 널리 사용됩니다. 일반적으로 사용되는 용매에는 물, 오일, 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 메탄올, 에탄올, 포름산, 트윈, 글리세린 등이 포함됩니다2. 화합물이 위 위관영양에 의해 투여될 때 용해되지 않은 물질이 포함된 현탁액이 허용되지만, 완전히 용해된 용질은 정맥내 투여에 중요합니다. 오일 용액, 현탁액 및 에멀젼은 모세관 색전증을 유발할 수 있으므로, 특히 정맥 내, 근육 내 및 복강 내 주사를 투여 할 때 화합물 제조를위한 수용액이 제안됩니다3.
유효 용량 범위는 화합물마다 다르며 동일한 화합물로 치료되는 질병 사이에서도 다양합니다. 유효 및 안전한 용량과 농도의 결정은 문헌 및 예비 실험4에 의존한다. 여기서, 나린제닌 화합물의 제조가 예로서 입증된다.
폴리페놀 화합물인 나린제닌(4,5,7-트리하이드록시-플라바논)은 간 보호5, 항당뇨병6, 항염증제7 및 항산화 활성8에 대한 질병 치료에 연구되었습니다. 생체 내 적용의 경우, 나린제닌의 경구 투여가 일반적으로 사용됩니다. 이전 연구에서는 경구 위관 영양 9,10,11,12로 투여되는 50-100mg/kg의 0.5%-1% 카르복시메틸셀룰로오스, 0.5% 메틸셀룰로오스 용량, 0.01% DMSO 및 생리식염수(PS)에 나린제닌 용액을 준비하는 것을 보고했습니다. 게다가, 다른 연구에서는 3g/kg/d 3.6의 용량으로 경구 섭취를 위해13,14%(wt/wt)의 차우로 나린제닌을 보충했다고 보고했습니다. 연구에서는 에탄올 (0.5 % v / v), PS 및 DMSO를 사용하여 10-50 mg / kg15,16,17,18에서 복강 내 주사 용 나린 제닌을 용해시키는 것으로보고되었습니다. 측두엽 간질에 대한 연구에서, 마우스는 PS19에 용해 된 0.25 % 카르복시 메틸 셀룰로오스에 현탁 된 나린 제닌을 주사 받았다. 이러한 연구에서는 나린제닌 용액을 준비하기 위해 다른 용매를 사용했다고 보고하지만 용해 상태 및 동물 반응과 같은 자세한 내용은 보고되지 않았습니다.
이 프로토콜은 당뇨병 유발 골다공증에서 생체 내 적용을 위한 나린제닌 용액을 제조하는 절차를 소개합니다. 주사액의 제조는 용매 및 화합물의 제조, 투여량 추정, 용해 공정 및 여과를 포함한다. 투여량은 문헌 연구 및 예비 실험을 기반으로 3일 동안 매일 주사를 투여한 후 마우스를 모니터링하고 마우스 행동에 따라 투여량을 수정하여 결정하였다. 최종 선택된 농도 (20 mg / kg BW)는 고지방 식단과 스트렙토 조 토신 (STZ) 유발 당뇨병 마우스20,21에서 8 주 동안 주당 5 일 복강 내 투여되었습니다. 당뇨병성 골다공증에서 나린제닌의 효과는 혈당 검사, 마이크로 CT, 주석산 내성 산 포스파타제(TRAP) 염색 및 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 평가되었습니다.
전반적으로, 40-400 mg / mL의 농도 범위에서 나린 제닌은 에탄올 또는 DMSO 또는 5 % (에탄올 또는 DMSO)와 95 % PS (v / v)에 완전히 용해되지 않는 것으로 관찰되었다. 그러나, 나린제닌은 3.52% DMSO, 3.52% 트윈 80, 및 92.96% PS의 혼합물에 완전히 용해되었다. 자세한 절차는 연구자가 생체 내 적용을 위한 주사 용액으로 화합물을 준비하는 데 도움이 될 것입니다.
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Protocol
설명 된 조사는 국가 연구위원회의 실험 동물 관리 및 사용 지침을 준수했으며 상하이 중국 전통 의학 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 실험을 수행할 때 안전을 위해 실험실 코트, 일회용 니트릴 장갑 및 고글이 필요합니다.
1. 생체 내 적용에 필요한 용매의 제조 및 나린제닌의 추정
- 다음 용매를 준비하십시오 : 트윈 -80 (최종 농도 범위 : 0.5 % -1 %), DMSO, 글리세린 (최종 농도 범위 : 15 % -20 %), 에탄올 (최종 농도 범위 : 근육 주사의 경우 12 %)22 및 0.9 % PS.
- 복용량, 마우스 수 및 주사 빈도를 기준으로 필요한 나린제닌의 양을 추정합니다.
- 10 마리의 마우스 (C57BL / 6, 수컷, 5 주령, SPF)에게 8 주 동안 일주일에 5 일 나린 제닌을 투여하도록 주문하십시오. 마우스를 특정 병원체가 없는(SPF) 상태로 유지하십시오.
참고: 복강 주사에 필요한 용량은 20mg/kg b.w.23입니다. - 다음 계산에 따라 나린제닌 160mg의 무게를 측정합니다: 20mg/kg x 0.02kg/마우스 x 10마우스 x 5일/주 x 8주 = 160mg.
- 10 마리의 마우스 (C57BL / 6, 수컷, 5 주령, SPF)에게 8 주 동안 일주일에 5 일 나린 제닌을 투여하도록 주문하십시오. 마우스를 특정 병원체가 없는(SPF) 상태로 유지하십시오.
- 생체 내에서 주입할 나린제닌의 농도를 계산합니다.
- 마우스의 체중을 기준으로 권장 용량을 준비하십시오. 각 마우스에 적용되는 나린제닌의 권장 부피는 체중의 1%(0.3mL)입니다. 이 실험에서는 마우스 당 0.2mL를 사용했습니다.
- 총 부피를 계산합니다: 마우스당 0.2mL x 마우스 10마리 x 주 5일 x 8주 = 80mL.
- 재고에 있는 나린제닌의 농도를 계산하십시오: 160 mg/80 mL 용매 = 2 mg/mL.
- 매일 부피를 계산하십시오 : 마우스 당 0.2mL x 마우스 10 마리 = 2mL.
2. 해산
- 에탄올 용액
- 2mg/mL의 나린제닌 용액을 준비하려면 3.52mg의 나린제닌을 계량하고 2.0mL 튜브에 넣습니다.
참고: 2mg/mL의 농도를 달성하기 위해 필요한 총 부피는 1760μL입니다(계산: 3.52mg/1760μL = 2mg/mL). - 빠르게 스핀다운하여(2000초 동안 30 x g ) 나린제닌 분말이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다(그림 1A).
- 튜브에 8.8 μL의 100 % 에탄올을 첨가하여 필요한 총 부피에 대해 0.5 % (v / v) 용액을 준비합니다2. 나린제닌은 완전히 용해되지 않습니다(그림 1B).
- 튜브에 100% 에탄올 79.2μL를 계속 첨가하여 필요한 총 부피에 대해 5%(v/v) 용액을 준비합니다(계산: (79.2μL + 8.8μL) / 1760μL x 100% = 5%). 나린제닌은 완전히 용해되지 않습니다(그림 1B).
- 단계 2.1.4에 설명된 대로 5% 에탄올을 포함하는 튜브에 1672μL의 0.9% PS를 추가합니다. 이것은 에멀젼을 생성합니다 (그림 1D). 용액을 원심분리기(30초 동안 2000 x g )하여 나린제닌이 용액에 완전히 용해되었는지 확인하였다. 용해되지 않은 나린제닌의 백색 침전물이 용액에 나타납니다 (그림 1E).
- 2mg/mL의 나린제닌 용액을 준비하려면 3.52mg의 나린제닌을 계량하고 2.0mL 튜브에 넣습니다.
- DMSO 솔루션
- 2mg/mL의 나린제닌 용액을 준비하려면 3.95mg의 나린제닌을 칭량하고 2.0mL 튜브에 넣습니다.
참고: 2mg/mL의 농도를 달성하기 위해 필요한 총 부피는 1975μL입니다(계산: 3.95mg/1975μL = 2mg/mL). - 빠르게 스핀다운하여(2000초 동안 30 x g ) 나린제닌 분말이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.
- 튜브에 9.8μL의 DMSO를 추가하여 0.5%(v/v) 용액을 준비합니다(계산: 9.8μL/1975μL x 100% = 5%). 나린제닌은 완전히 용해됩니다(그림 2A).
- 88.2 μL의 DMSO를 튜브에 첨가하여 필요한 총 부피에 대해 5%(v/v) 용액을 준비합니다(계산: (88.2 μL + 9.8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). 나린제닌은 완전히 용해됩니다(그림 2B).
- 1877 μL의 0.9% PS(v/v 퍼센트 중 95%)를 단계 2.2.4에서 제조된 용액에 첨가한다. 에멀젼이 생성됩니다 (그림 1C). 용액을 원심분리기(30초 동안 2000 x g )하여 나린제닌이 용액에 완전히 용해되었는지 확인하였다. 용해되지 않은 나린제닌의 백색 침전물이 용액에 나타납니다 (그림 1D).
- 2mg/mL의 나린제닌 용액을 준비하려면 3.95mg의 나린제닌을 칭량하고 2.0mL 튜브에 넣습니다.
- 트윈-80 및 DMSO 솔루션
- 2mg/mL의 나린제닌 용액을 준비하려면 6.69mg의 나린제닌을 칭량하고 5.0mL 튜브에 넣습니다.
참고: 2mg/mL의 최종 농도를 달성하기 위해 필요한 총 용액 부피는 3345μL입니다(계산: 6.69mg/3345μL = 2mg/mL). - 빠르게 스핀다운하여(2000초 동안 30 x g ) 나린제닌 분말이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.
- 117.7 μL의 DMSO를 첨가하여 필요한 총 부피에 대하여 3.5%(v/v) 용액을 제조합니다(계산: 117.7 μL /3345 μL x 100% = 3.5%). 나린제닌은 완전히 용해됩니다(그림 3A).
- 2.3.3 단계에서 제조된 용액에 트윈 80 117.7μL를 첨가하여 3.5%(v/v) 트윈 80 및 3.5%(v/v) DMSO를 달성한다. 나린제닌의 완전한 용해를 관찰합니다(그림 3B).
- 2.3.4단계에서 준비한 용액을 0.9% PS(v/v 퍼센트 93%)의 3109.6μL가 포함된 5.0mL 튜브에 천천히 넣고 잘 흔들어 명백한 나린제닌 용액을 얻습니다(그림 3C).
- 2.3.5단계에서 제조된 용액을 실온(RT)에서 2시간 동안 그대로 두십시오. 해결책은 가시적 인 침전물없이 여전히 분명합니다 (그림 3D).
- 2mg/mL의 나린제닌 용액을 준비하려면 6.69mg의 나린제닌을 칭량하고 5.0mL 튜브에 넣습니다.
- 생체 내 투여를 위한 나린제닌 용액의 제조
- 단계 1.2.2에 따라 160mg의 나린제닌(160mg/2mg/mL = 80mL)의 무게를 잰다.
- 3.5%(v/v) 용액을 얻기 위해 2.8mL의 DMSO를 추가합니다(계산: 2.8mL / 80mL x 100% = 3.5%)
- 그런 다음 2.4.2단계에서 제조된 용액에 트윈 80 2.8mL를 추가하여 3.5%(v/v) 트윈 80 및 3.5%(v/v) DMSO를 얻습니다.
- 단계 2.4.3에서 제조된 용액을 4개의 튜브에 분취하고, 튜브 당 1.4 mL[(2.8 mL + 2.8 mL)/4 = 1.4 mL].
- 0.9% PS의 18.6mL를 5개의 15mL 튜브에 분취합니다.
- 단계 2.4.3에서 제조된 용액(원액) 및 2.4.5를 4°C(2.8 mL + 2.8 mL + 18.6 mL x 4 = 80 mL)에서 저장한다.
- 140μL의 원액(단계 2.4.3)을 취하여 1860μL의 0.9% PS와 혼합하여 1일 동안 투여할 2mL의 나린제닌 용액을 준비합니다.
- 0.2μm 필터를 통해 용액을 여과합니다.
3. 나린제닌 용액 투여
- 취급 및 구속
- 뚜껑을 열기 전에 케이지와 손에 70-75 % 알코올을 뿌리십시오. 꼬리 바닥을 잡고 마우스를 단단한 표면에 놓고 꼬리를 부드럽게 뒤로 배치합니다.
- 왼쪽 엄지 손가락과 검지로 귀 뒤의 목덜미를 잡고 작은 손가락과 약지 사이에 꼬리를 놓습니다. 뒤쪽 끝이 약간 올라간 상태에서 마우스를 앙와위 자세로 유지하십시오.
- 주사
- 복부 피부가 팽팽 해 지도록 마우스의 뒤쪽 피부를 잡으십시오.
- 방광, 간 또는 기타 내부 장기에 부딪히지 않도록 바늘과 복부 표면 사이, 복부의 오른쪽 아래 또는 왼쪽 사분면 사이에서 10° 각도로 바늘(인슐린 주사기)을 밀어 넣습니다.
- 바늘을 두개골 방향으로 3-5mm 피하 투여 한 다음 복강 내로 45 ° 각도로 삽입하십시오.
- 바늘이 복벽을 통과하고 저항이 사라지면 흡인을 수행하여 역류 물질이 빠져 나오지 않았는지 확인하십시오. 그런 다음 용액을 천천히 밉니다.
- 주입 후 바늘을 천천히 당겨 약간 돌려 누출을 방지하십시오. 권장 부피는 50-100 μL/10 g입니다.
- 남은 나린제닌은 생물학적 위험 용기에 폐기하십시오.
4. 혈당 검사
알림: 주사 1일 전과 주사 후 1개월 및 2개월 후에 혈당을 검사하십시오.
- 혈당 검사 전에 15 시간 동안 마우스를 금식하십시오. 물은 계속 제공 될 수 있습니다.
- 테스트 스트립을 열고 날짜를 표시하십시오. 개봉 후 3개월 이내에 테스트 스트립을 사용하십시오. 테스트 스트립을 2-30 °C에서 보관하십시오. 습기가 형성되지 않도록 스트립을 제거한 후 뚜껑을 단단히 닫으십시오.
- 동물을 유도 챔버에 넣습니다. 이소플루란의 경우 4%, 산소의 경우 4L/min의 유도 수준에서 기화기를 켭니다. 동물이 완전히 마취 된 후, 코 콘으로 마취제를 유지하고 마취제 전달을 이소 플루 란의 경우 1.5 %, 산소의 경우 0.4L / min 수준으로 유지하십시오.
- 70%-75% 알코올에 적신 면봉/면봉으로 꼬리를 닦습니다.
- 꼬리의 가장 낮은 지점에서 시작하여 25G 바늘 찌름으로 측면 꼬리 정맥에 작은 구멍을 뚫고 피 한 방울을 짜냅니다.
- 티슈 페이퍼로 혈액 방울을 닦으십시오.
- 다른 혈액 한 방울을 짜내고 테스트 스트립의 가장자리에 모으십시오.
- 혈당 측정기에 표시된 결과를 읽고 기록하십시오.
- 출혈을 멈추려면 멸균 거즈로 마우스 꼬리를 꼬집고 75 % 알코올로 해당 부위를 닦으십시오.
- 추가의 샘플은 꼬리를 두개골로 이동하는 유사한 기술에 의해 수득될 수 있다.
5. 트랩 염색
- 슬라이드 준비
- 일주일에 한 번 마우스에서 공복 혈당 검사를 수행하십시오. 혈당 수치가 11.1 mmol / L (성공적인 II 형 당뇨병 마우스 모델 24를 나타냄)≥ 때 CO2를 사용하여 마우스를 안락사시킨 다음 자궁 경부 전좌를 수행하고 요추 4-6일 (L4-L6) (공복 혈당 검사 중에는 안락사가 수행되지 않음).
- L4-L6 샘플을 4% 파라포름알데히드로 24시간 동안 고정한 다음(파라포름알데히드의 부피가 조직 부피의 >20배인지 확인) 수돗물의 연속 흐름에서 2시간 동안 세척합니다.
- 샘플을 석회질을 제거하려면 샘플이 연화 될 때까지 정적 조건에서 RT에서 2 주 동안 10 % 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액에 담그십시오. 석회질 제거 용액의 부피가 조직/샘플 부피의 20-30배인지 확인하십시오. EDTA 솔루션을 격일로 변경하십시오.
- 탈수기를 사용하여 샘플을 탈수하십시오.
- 표본을 조직 처리 내장 카세트에 넣습니다. 연필을 사용하여 카세트에 번호를 매기십시오.
- 탈수기 프로그램을 다음과 같이 설정하십시오 : 2 시간 동안 75 % 알코올, 1 시간 동안 85 % 알코올, 1 시간 동안 95 % 알코올, 2 시간 동안 95 % 알코올, 2 시간 동안 무수 에탄올 (I), 2 시간 동안 무수 에탄올 (II), 2 시간 동안 무수 에탄올 (III), 1 시간 동안 크실렌 (I), 1 시간 동안 크실렌 (II), 1 시간 동안 크실렌 (III), 파라핀 왁스 (I)는 2 시간 동안, 파라핀 왁스 (II)는 2 시간 동안 RT에서.
- 샘플을 파라핀 왁스에 삽입합니다.
- 파라핀 임베딩 스테이션의 카세트 트레이에 파라핀 왁스를 넣고 60 °C로 가열합니다. 탈수된 표본을 최소 2시간 동안 담그십시오.
- 티슈 카세트를 카세트 트레이에 넣고 예열합니다.
- 파라핀 저장소에 파라핀 왁스를 넣고 60 ° C로 가열합니다.
- 2시간 후 조직 카세트와 표본을 모두 작업 영역으로 가져갑니다. 예열 된 파라핀 왁스를 파라핀 저장소에서 조직 카세트에 붓습니다. 표본을 파라핀 왁스에 넣고 파라핀 왁스가 조직을 완전히 덮는지 확인한 다음 즉시 카세트를 착빙 스테이션으로 옮깁니다.
- 마이크로톰을 사용하여 파라핀이 내장된 샘플을 5-6μm 섹션으로 절단합니다. 섹션을 40°C의 따뜻한 물에 10초 미만 동안 펼칩니다. APS(아미노 실란) 코팅 유리 슬라이드에서 섹션을 수집합니다. 슬라이드를 RT에서 1시간 동안 건조시킨 다음 슬라이드를 60°C로 설정된 오븐으로 밤새 옮깁니다.
- 트랩 시약 준비
- 기본 스톡 배양 용액 준비: 무수 아세트산나트륨 9.2g, L-(+) 타르타르산 11.4g, 빙산 2.8mL를 증류수 1000mL에 녹입니다. pH를 4.7-5.0으로 조정하고 최대 6 개월 동안 RT에서 보관하십시오.
- 나프톨 에테르 용액 준비: 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 5mL에 나프톨 AS-BI 인산염 0.1g을 녹입니다. 4°C에서 최대 5주 동안 보관하십시오.
- 아질산나트륨 용액 준비: 아질산나트륨 1g을 증류수 25mL에 녹입니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 파라로사닐린 염료 준비: 2N HCl 20mL(물 417mL에 HCl 83mL)에 파라로사닐린 염기 1g을 추가합니다. 교반 플레이트를 사용하여 베이스를 녹이고 사용하기 전에 여과하십시오.
- 트랩 염색
- 두 개의 코플린 병에 50mL의 기본 스톡 배양 용액을 채우고 37°C 오븐에 2시간 동안 둡니다.
- 코플린 병 1 개를 가져 와서 0.5mL의 나프톨 에테르 용액을 첨가하십시오.
- 슬라이드를 Coplin 병에 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
참고: 각 그룹에 대해 최소 3개의 슬라이드를 준비합니다. - 배양 시간이 끝나기 몇 분 전에 아질산 나트륨 용액 1mL와 파라로 사닐린 염료 1mL를 첨가하십시오. 30초 동안 부드럽게 섞고 2분 동안 그대로 두십시오.
- 5.2.2단계에서 준비한 용액을 기본 저장 용액이 들어 있는 예열된 다른 Coplin 병에 추가합니다. 용액을 잘 혼합하고 5.3.3 단계에서 Coplin 용기에서 슬라이드를 삽입합니다.
- RT에서 15-20 분 동안 배양하십시오.
- 다른 코플린 병에 200mL의 PBS로 슬라이스를 5분 동안 헹굽니다.
- Coplin 병에 100 초 동안 30 % 헤 마톡실린으로 슬라이스를 카운터 염색합니다.
- 슬라이스를 85%, 95%, 100% 알코올(200mL)로 각각 2분 동안 탈수하고 크실렌(200mL)에서 2분 동안 3회 처리합니다. 코플린 병을 사용하여 각 단계를 수행하십시오.
- 수지를 사용하여 커버 슬립으로 커버 유리의 섹션을 고정합니다. 기포가 끼이지 않도록하십시오.
6. 엘리사
- 샘플 준비
- 마우스의 대퇴골과 경골에서 연조직을 제거하십시오. 거즈로 뼈를 청소하십시오.
- 뼈 샘플을 1mL 미세 원심분리 튜브에 넣고 샘플 튜브를 -80°C에서 보관합니다.
알림: 샘플은 액체 질소 탱크에 6 개월 이상 보관할 수도 있습니다. - 뼈 샘플의 무게를 잰다. 1:10의 비율로 0.9 % PS로 희석하십시오. 예를 들어, 0.1g의 뼈를 1mL의 PS로 희석하십시오.
- 튜브에 3mm 지르코니아 비드를 추가하고 샘플을 70Hz에서 30초 동안 3x 분쇄하고 그 사이에 20초 휴식을 취합니다.
- 샘플을 4°C 및 12,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 수집하십시오.
- 엘리사 분석 키트
알림: 제조업체에서 지정한 분석 프로토콜에 따라 ELISA를 수행하십시오.- 표준물질, 블랭크 및 시료의 각 희석액 100μL를 적절한 웰에 추가합니다. 37°C에서 90분 동안 배양한다.
- 각 웰에서 액체를 따라 내고 100μL의 비오티닐화 검출 항체 작업 용액을 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 용액을 따라 내고 각 웰에 350 μL의 세척 완충액을 첨가한다. 1 분 동안 담그고 3 번 반복하십시오.
- 각 웰에 100μL의 HRP 접합체 작업 용액을 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 솔루션을 따라 내십시오. 6.2.3단계에 설명된 대로 세척 과정을 5회 반복합니다.
- 기질 시약 90μL를 추가합니다. 빛으로부터 보호되는 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 정지 용액 50μL를 추가합니다.
- 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 각 웰의 흡광도를 기록합니다.
- 표준 곡선 생성
- 연속적으로 희석된 단백질 농도에 대한 각각의 평균 흡광도 값을 플로팅합니다.
- 점을 결합하여 최적 맞춤 곡선을 만듭니다. 적절한 컴퓨터 응용 프로그램(스프레드시트)을 사용하여 표준 곡선 방정식을 생성합니다.
- 각 시료의 흡광도 값을 표준곡선 방정식에 대입하여 각 시료의 농도를 구한다.
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Representative Results
고지방 식이 및 STZ 유발 당뇨 마우스의 체중은 STZ 처리 후 0-8주에서 대조군과 비교하였을 때 감소하는 것으로 나타났다. 나린제닌 처리된 마우스의 체중 감소는 4주차에 처리되지 않은 마우스(STZ 그룹)에 비해 유의했습니다. 대조군과 STZ 그룹은 동일한 부피의 PS를 투여하였다(표 1). 당뇨병 마우스의 혈당 수치는 STZ 유도 후 1 개월 이내에 극적으로 증가했습니다. 그런 다음 동물 모델이 확립되었을 때 2 개월 전에 관찰 된 수준으로 자동으로 감소했습니다. 나린제닌 치료는 1개월과 2개월에 혈당 수치를 각각 51.8% 및 34.8% 낮췄습니다(표 2). STZ 유발 당뇨병 마우스는 각각 뼈 부피/조직 부피(BV/TV)(30.97%) 및 섬유주 수(Tb.N)(11.4%)의 감소로 나타난 바와 같이 골 손실을 나타냈습니다. 이 두 매개 변수 값의 변화는 나린제닌 치료가 뼈 손실을 크게 구출했음을 시사합니다 (표 3). N.oc/Tb.Ar(섬유주 뼈 면적당 파골세포 수)로 표시된 파골세포 활성은 고지방 식이 및 STZ 유발 당뇨병 마우스에서 증가했지만 대조군과 질병 모델 간에 통계적 유의성은 관찰되지 않았습니다. 나린제닌 처리는 도 4 및 표 4에 나타낸 바와 같이 파골세포 활성을 유의하게 감소시켰다. I 형 콜라겐 (CTIX)의 C- 말단 텔로 펩타이드와 I 형 프로 콜라겐 (PINP)의 N- 말단 프로 펩타이드는 당뇨병 동물에서 각각 68.09 % 및 204.88 % 증가하여 골 흡수율이 급격히 증가했음을 나타냅니다. 나린제닌은 골 흡수율의 두 지표 모두 유의하게 감소시켰다(표 5).
그림 1: 에탄올에 나린제닌 용해. (A) 스핀 다운 후 튜브의 나린제닌 분말. (B) 나린제닌 + 에탄올(400mg/mL - 에탄올 8.8μL 중 나린제닌 3.52mg). (C) 나린제닌 + 에탄올(40mg/mL - 에탄올 8.8μL 중 나린제닌 3.52mg) (D) 5%(v/v) 에탄올 및 95% PS(0.9%)의 나린제닌. (E) 스핀 다운 후 D에서 침전됩니다. (F) 그림 1, 그림 2 및 그림 3에 대한 스케일 바를 얻기 위한 측정. 나르: 나린제닌. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DMSO에 나린제닌 용해. (A) 나린제닌 + DMSO (400 mg/mL - 9.8 μL의 DMSO 중 3.95 mg의 나린제닌). (B) 나린제닌 + DMSO (40 mg/mL- 98 μL의 DMSO 중 나린제닌 3.95 mg). (C) 5 % (v / v) DMSO 및 95 % PS (0.9 %)의 나린 제닌. (D) 스핀 다운 후 C 에서 침전된다. 나르: 나린제닌. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DMSO 및 트윈 80에 나린제닌 용해. (A) 나린제닌 + DMSO (57.2 mg/mL - DMSO 117.7 μL 중 나린제닌 6.69 mg). (B) 나린제닌 + DMSO + 트윈(57.2mg/mL - DMSO 117.7μL 및 트윈 80 117.7μL 중 나린제닌 6.69mg). (C) 3.5 % (v / v) DMSO, 3.5 % (v / v) 트윈 80 및 93 % PS (0.9 %)의 혼합물에서 나린 제닌. (D) 스핀 다운 후 C 에 침전물이 없다. 나르: 나린제닌. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 고지방 사료 공급 및 STZ 주사(STZ) 마우스의 파골세포 활성에 대한 나린제닌의 효과. 섬유주 뼈와 L4 척추의 파골 세포의 TRAP 염색. 삼각형은 파골 세포를 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 수치는 Liu et al.25에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| (지) | 0 주 | 1 주 | 2 주 | 4 주 | 5 주 | 6 주 | 8 주 |
| 제어 | 0.2± 23.7 | 25.1 ± 1.3 | 1.0± 26.2 | 27.7 ± 0.5 | 31.1 ± 0.7 | 31.7 ± 0.8 | 32.7 ± 1.3 |
| 증권 시세 표시기 | 16.8 ± 1.7** | 18.2 ± 2.5** | 18.6 ± 2.5** | 18.2 ± 1.4** | 21.3 ± 1.6** | 22.0 ± 1.4** | 20.8 ± 1.4** |
| 나린제닌 | 16.6 ± 1.1** | 17.6 ± 1.5** | 17.4 ± 1.7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0.01 대 대조군 | |||||||
| ΔΔ p < 0.01 대 STZ | |||||||
표 1: 그룹 및 기간에 따른 고지방 식이 공급 및 STZ 주사(STZ) 마우스의 체중. 데이터는 평균± s.d. ** p < 0.01 대 대조군, ΔΔ p < 0.01 대 평균으로 나타내 었다. 증권 시세 표시기.
| (밀리텔/리터) | 0 개월 | 1 개월 | 2 개월 |
| 제어 | 4.9 ± 0.9 | 8.4 ± 0.7 | 8.3 ± 0.5 |
| 증권 시세 표시기 | 12.8 ± 4.2** | 22.8 ± 4.3** | 15.5 ± 2.7* |
| 나린제닌 | 13.2 ± 3.5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0.05, ** p < 0.01 대 대조군 | |||
| ΔΔ p < 0.01 대 STZ | |||
표 2: 그룹 및 기간에 걸친 STZ 마우스의 공복 혈당. 데이터는 평균 ± s.d. * p < 0.05 ** p < 0.01 대 대조군, ΔΔ p < 0.01 대 STZ로 나타내었다 .
| BV / TV (%) | 엔엔 (1 밀리미터) | |
| 제어 | 0.268 ± 0.046 | 5.35 ± 0.31 |
| 증권 시세 표시기 | 0.185 ± 0.081* | 4.74 ± 0.77* |
| 나린제닌 | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0.05 대 대조군 | ||
| Δ p < 0.05, ΔΔ p < 0.01 대 STZ | ||
표 3: 그룹 간 STZ 마우스의 골량 관련 파라미터. 데이터는 평균 ± s.d. * p < 0.05 대 대조군, Δp < 0.05, ΔΔ p < 0.01 대 STZ로 나타내었다.
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| 제어 | 0.000182 ± 8.84E-05 |
| 증권 시세 표시기 | 0.00024 ± 2.06E-05 |
| 나린제닌 | 0.000156 ± 3.88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0.01 대 STZ | |
표 4: 그룹 간 STZ 마우스의 파골세포 활성. 데이터는 평균 ± s.d. ΔΔ p < 0.01 대 STZ로 나타내었다.
| 응/밀리람베르트 | 증권 시세 표시기 | 핀프 |
| 제어 | 22 ± 8.98 | 1.64 ± 0.95 |
| 증권 시세 표시기 | 36.98 ± 22.57 | 5 ± 2.33 * |
| 나린제닌 | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0.05 대 대조군 | ||
| ΔΔ p < 0.01 대 STZ | ||
표 5: 그룹 간 STZ 마우스의 골 흡수율. 데이터는 평균 ± s.d. * p < 0.05 대 대조군, ΔΔ p < 0.01 대 STZ로 나타내었다.
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Discussion
식물 화학 용액의 제조는 생체 내에서의 적용을위한 기초입니다. 이 프로토콜에서, 나린제닌 용액의 제조는 에탄올, DMSO, Tween 80 및 0.9% PS와 같은 상이한 용매를 사용하여 입증되었다. 완전히 용해된 상태의 용액은 몇 시간 동안 실온에 유지되도록 하여 추가로 모니터링한 다음 생체 내에서 사용하기 전에 여과해야 합니다.
용매 측정은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 화합물을 용해시키기위한 많은 용매 옵션이 있으며, 그 중 에탄올, DMSO 및 PS가 가장 널리 사용됩니다. 에탄올은 극성이 높은 특성으로 인해 많은 수 불용성 화합물을 용해시켜 수소 결합을 허용하여 극성 및 비극성 물질을 모두 용해시킬 수 있습니다. 또한, 에탄올의 농도는 식물 화학 화합물의 특성을 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 75 중량 % 에탄올 / 물 용매는 폴리 페놀의 가장 높은 수율을 추출하는 데 가장 적합한 것으로 간주되며 가장 강력한 항산화 특성을 가지고 있습니다26. 또 다른 연구에 따르면 폴리 페놀 추출물이 항산화 특성을 나타내기 위해 에탄올 농도를 150 ° C에서 32.5 %로 낮출 수 있습니다27. 그러나 고농도의 에탄올은 신경 독성 및 간독성을 유발할 수 있습니다28. 8 % -32 % v / v 농도 범위의 에탄올 주입 (i.p.)은 일반적으로 행동 평가에 사용되며 조건부 미각 혐오감과 저체온증을 유발할 수 있습니다29. DMSO는 극성이 높은 쌍극성 비양성자성 용매이며 수많은 유기 화합물을 용해시키는 용매로 사용됩니다. 비교 연구에 따르면 DMSO / 메탄올 (50 : 50 v / v)은 감귤류 껍질30에서 페놀 산의 최적 수율을 가져 왔습니다. 그러나 용량, 농도 및 빈도는 DMSO가 동물에게 전달 될 때 무시할 수있는 요소가 아닙니다. 마우스에서 복강 내 투여 된 17.7 g / kg 용량은 LD50을 달성했으며 마우스에서 6 주 동안 용량을 2.5 g / kg으로 낮추면 관찰 가능한 부작용이 발생하지 않았습니다31. 제안 된 DMSO 농도는 0.5 % -5 %이지만 DMSO는 많은 화합물을 용해시킬 수 없습니다. Colucci et al. 마우스에서 뇌실 내 및 경구 투여에 의해 DMSO 및 DMSO 함유 식염수의 효과를 다양한 농도로 테스트했습니다. 이 연구는 식염수에 25 % DMSO 용액이 동물 행동 반응을 변화시키지 않는다는 것을 입증했습니다32. 트윈 (80)은 비이 온성 계면 활성제이며, 난용성 약물의 용해도를 증가시키고 약물 동력 학적 특징을 향상시키기위한 보조 용매로서 널리 사용된다33. 1% Tween 80의 농도는 안전성33을 고려하여 선택되었다. 따라서, 복강내 투여를 위해 나린제닌을 완전히 가용화하기 위해 상이한 농도의 상기 용매 및 계면활성제를 사용하였다.
고려할 몇 가지 제안 사항이 여기에 나열되어 있습니다. 첫째, 소비 비용을 고려한 예비 실험을 위해 소량의 식물 화학 화합물부터 시작하는 것이 좋습니다. 둘째, 솔루션을 준비하기 전에 포괄적 인 문헌 연구, 특히 동물 종, 질병, 투여 경로 및 빈도에 관한 면밀한 연구를 수행해야합니다. 셋째, 계면활성제와 같은 용매 및 공용매의 농도 범위는 이용 가능한 문헌, 예비 실험 및 연구 설계의 목적에 따라 달라집니다. 넷째, 비교적 높은 투여 빈도로 인한 주사 손상을 줄이기 위해 일반 주사기 대신 인슐린 주사기를 사용하는 것이 좋습니다. 다섯째, 멸균 상태를 유지하기 위해 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 살아있는 동물에게 용액을 주입 할 때 알코올에 적신 멸균 주사기와 면봉을 사용하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 장점은 간단한 조작과 저렴한 비용입니다. 요약하면, 프로토콜은 나린 제닌을 예로 들어 마우스에서 복강 내 투여를위한 식물 화학 용액의 제조를 보여줍니다. 이 프로토콜은 약물 스크리닝 또는 약리학을 다루는 연구자에게 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81973607 및 81573992)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
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