Summary
Hier stellt das Protokoll die Herstellung von Naringeninlösung für die intraperitoneale In-vivo-Verabreichung vor. Naringenin ist vollständig in einer Mischung aus Dimethylsulfoxid, Tween 80 und Kochsalzlösung gelöst. Die antidiabetischen osteoporotischen Wirkungen von Naringenin wurden durch Blutzuckertests, Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung und enzymgebundenen Immunassay beurteilt.
Abstract
Die Herstellung einer zusammengesetzten (phytochemischen) Lösung ist ein übersehener, aber kritischer Schritt vor ihrer Anwendung in Studien wie dem Arzneimittelscreening. Die vollständige Solubilisierung der Verbindung ist für ihre sichere Verwendung und relativ stabile Ergebnisse notwendig. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Naringeninlösung und deren intraperitonealer Verabreichung in einem fettreichen Diät- und Streptozotocin (STZ)-induzierten diabetischen Modell als Beispiel demonstriert. Eine kleine Menge Naringenin (3,52-6,69 mg) wurde verwendet, um seine Solubilisierung in Lösungsmitteln zu testen, einschließlich Ethanol, Dimethylsulfoxid (DMSO) und DMSO plus Tween 80, rekonstituiert in physiologischer Kochsalzlösung (PS). Die vollständige Solubilisierung der Verbindung wird durch Beobachtung der Farbe der Lösung, des Vorhandenseins von Ausfällen nach dem Zentrifugieren (2000 x g für 30 s) oder durch Stehen der Lösung für 2 h bei Raumtemperatur (RT) bestimmt. Nach Erhalt einer stabilen Verbindung/phytochemischen Lösung kann die endgültige Konzentration/Menge der für In-vivo-Studien erforderlichen Verbindung in einer reinen Lösungsmittel-Stammlösung (kein PS) hergestellt und dann wie gewünscht mit PS verdünnt/gemischt werden. Die antidiabetische osteoporotische Wirkung von Naringenin bei Mäusen (intraperitoneale Verabreichung bei 20 mg/kg Körpergewicht, 2 mg/ml) wurde durch Messung von Blutzucker, Knochenmasse (Mikro-CT) und Knochenresorptionsrate (TRAP-Färbung und ELISA) beurteilt. Forscher, die nach detaillierten organischen / phytochemischen Lösungspräparaten suchen, werden von dieser Technik profitieren.
Introduction
Mit zunehmenden Studien über die Verwendung von phytochemischen Verbindungen für das Arzneimittelscreening sind Ansätze zur Herstellung phytochemischer Lösungen zur Bewertung ihrer optimalen Wirkungen beachtenswert. Viele Aspekte wie die Auflösungsmethodik, Dosierung und Konzentration sind bei der Herstellung der Verbindung1 zu berücksichtigen.
Lösungsmittelbasierte Auflösung wird häufig für die Herstellung organischer Verbindungen verwendet1. Zu den üblicherweise verwendeten Lösungsmitteln gehören Wasser, Öl, Dimethylsulfoxid (DMSO), Methanol, Ethanol, Ameisensäure, Tween, Glycerin usw.2. Obwohl eine Suspension mit ungelösten Substanzen akzeptabel ist, wenn die Verbindung durch Magengavage verabreicht wird, ist ein vollständig gelöster gelöster gelöster Stoff für die intravenöse Verabreichung kritisch. Da Öllösung, Suspension und Emulsion Kapillarembolien verursachen können, wird eine wässrige Lösung zur Herstellung von Verbindungen empfohlen, insbesondere bei der Verabreichung intravenöser, intramuskulärer und intraperitonealer Injektionen3.
Der effektive Dosisbereich variiert zwischen Verbindungen und sogar zwischen Krankheiten, die mit derselben Verbindung behandelt werden. Die Bestimmung der effektiven und der sicheren Dosis sowie der Konzentration hängt von der Literatur und den Vorversuchen ab4. Hier wird beispielhaft die Herstellung der Verbindung Naringenin demonstriert.
Naringenin (4,5,7-Trihydroxyflavanon), eine polyphenolische Verbindung, wurde in der Krankheitsbehandlung auf seine hepatoprotektive5, antidiabetische6, entzündungshemmende7 und antioxidative Wirkung8 untersucht. Für In-vivo-Anwendungen wird üblicherweise die orale Verabreichung von Naringenin verwendet. Frühere Studien berichteten über die Herstellung von Naringeninlösung in 0,5%-1% Carboxymethylcellulose, 0,5% Methylcellulosedosis, 0,01% DMSO und physiologischer Kochsalzlösung (PS) bei 50-100 mg/kg, verabreicht durch orale Sonde 9,10,11,12. Darüber hinaus haben andere Studien berichtet, dass Naringenin mit Chow zu 3% (Gew./Gew.) zur oralen Einnahme in einer Dosis von 3,6 g/kg/d13,14 ergänzt wurde. Studien haben auch berichtet, dass Ethanol (0,5% v / v), PS und DMSO verwendet wurden, um Naringenin für die intraperitoneale Injektion bei 10-50 mg / kg 15,16,17,18 aufzulösen. In einer Studie zur Temporallappenepilepsie erhielten Mäuse eine Injektion von Naringenin, suspendiert in 0,25% Carboxymethylcellulose, gelöst in PS19. Obwohl diese Studien über die Verwendung verschiedener Lösungsmittel zur Herstellung von Naringeninlösungen berichten, wurden keine weiteren Details wie Auflösungsstatus und Tierreaktion berichtet.
Dieses Protokoll führt ein Verfahren zur Herstellung von Naringeninlösung für die In-vivo-Anwendung bei diabetischer Osteoporose ein. Die Herstellung der Injektionslösung umfasst die Herstellung von Lösungsmitteln und Verbindungen, die Dosierungsschätzung, den Lösungsprozess und die Filtration. Die Dosierung wurde auf der Grundlage von Literaturrecherchen und vorläufigen Experimenten bestimmt, indem Mäuse nach der täglichen Verabreichung von Injektionen für 3 Tage überwacht und die Dosierung entsprechend dem Verhalten der Maus geändert wurde. Die endgültige gewählte Konzentration (20 mg/kg Körpergewicht) wurde intraperitoneal 5 Tage pro Woche für 8 Wochen in einer fettreichen Diät verabreicht und Streptozotocin (STZ)-induzierte diabetische Mäuse20,21. Die Wirkungen von Naringenin bei diabetischer Osteoporose wurden durch Blutzuckertests, Mikro-CT, Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) -Färbung und Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bewertet.
Insgesamt wurde beobachtet, dass sich Naringenin in einem Konzentrationsbereich von 40-400 mg/ml weder in Ethanol noch DMSO oder 5% (Ethanol oder DMSO) plus 95% PS (v/v) vollständig löste. Naringenin löste sich jedoch vollständig in einer Mischung aus 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 und 92,96% PS. Das detaillierte Verfahren wird den Forschern helfen, die Verbindung als Injektionslösung für die In-vivo-Anwendung vorzubereiten.
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Protocol
Die beschriebenen Untersuchungen entsprachen den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Research Council und wurden vom Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Animal Care and Use Committee genehmigt. Bei der Durchführung der Experimente sind Laborkittel, Einweg-Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen aus Sicherheitsgründen erforderlich.
1. Herstellung von Lösungsmitteln und Abschätzung von Naringenin, das für die In-vivo-Anwendung erforderlich ist
- Die folgenden Lösungsmittel werden hergestellt: Tween-80 (Endkonzentrationsbereich: 0,5%-1%), DMSO, Glycerin (Endkonzentrationsbereich: 15%-20%), Ethanol (Endkonzentrationsbereich: 12% für intramuskuläre Injektion)22 und 0,9% PS.
- Schätzen Sie die erforderliche Menge an Naringenin basierend auf der Dosis, der Anzahl der Mäuse und der Injektionshäufigkeit.
- Bestellen Sie 10 Mäuse (C57BL/6, männlich, 5 Wochen alt, SPF) zur Verabreichung von Naringenin an 5 Tagen pro Woche für 8 Wochen. Halten Sie Mäuse unter bestimmten pathogenfreien (SPF) Bedingungen.
HINWEIS: Die für die intraperitoneale Injektion erforderliche Dosis beträgt 20 mg/kg Körpergewicht 23. - Wiegen Sie 160 mg Naringenin basierend auf der folgenden Berechnung: 20 mg/kg x 0,02 kg/Maus x 10 Mäuse x 5 Tage/Woche x 8 Wochen = 160 mg.
- Bestellen Sie 10 Mäuse (C57BL/6, männlich, 5 Wochen alt, SPF) zur Verabreichung von Naringenin an 5 Tagen pro Woche für 8 Wochen. Halten Sie Mäuse unter bestimmten pathogenfreien (SPF) Bedingungen.
- Berechnen Sie die Konzentration von Naringenin, das in vivo injiziert werden soll.
- Bereiten Sie das empfohlene Volumen basierend auf dem Körpergewicht der Mäuse vor. Das empfohlene Volumen von Naringenin, das auf jede Maus aufgetragen wird, beträgt 1% des Körpergewichts (0,3 ml). In diesem Experiment wurden 0,2 ml pro Maus verwendet.
- Berechnen Sie das Gesamtvolumen: 0,2 ml pro Maus x 10 Mäuse x 5 Tage/Woche x 8 Wochen = 80 ml.
- Berechnen Sie die Konzentration des Naringenin auf Lager: 160 mg/80 mL Lösungsmittel = 2 mg/ml.
- Berechnen Sie das Volumen für jeden Tag: 0,2 ml pro Maus x 10 Mäuse = 2 ml.
2. Auflösung
- Ethanol-Lösung
- Um Naringeninlösung bei 2 mg / ml herzustellen, wiegen Sie 3,52 mg Naringenin und geben Sie es in ein 2,0 ml Röhrchen.
HINWEIS: Um eine Konzentration von 2 mg/ml zu erreichen, beträgt das erforderliche Gesamtvolumen 1760 μL (Berechnung: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/ml). - Schnell herunterdrehen (2000 x g für 30 s), damit sich das Naringeninpulver am Boden des Röhrchens absetzt (Abbildung 1A).
- Fügen Sie 8,8 μl 100% Ethanol in das Röhrchen hinzu, um eine 0,5% (v/v) Lösung in Bezug auf das erforderliche Gesamtvolumen herzustellen2. Naringenin löst sich nicht vollständig auf (Abbildung 1B).
- Geben Sie weiterhin 79,2 μL 100% Ethanol in das Röhrchen, um eine 5% ige (v/v) Lösung in Bezug auf das erforderliche Gesamtvolumen herzustellen (Berechnung: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). Naringenin löst sich nicht vollständig auf (Abbildung 1B).
- 1672 μL 0,9 % PS in das Röhrchen geben, das 5 % Ethanol enthält, wie in Schritt 2.1.4 beschrieben. Dadurch entsteht eine Emulsion (Abbildung 1D). Zentrifugieren (2000 x g für 30 s) die Lösung, um zu überprüfen, ob Naringenin vollständig in der Lösung gelöst ist. In der Lösung erscheinen weiße Ausscheidungen von ungelöstem Naringenin (Abbildung 1E).
- Um Naringeninlösung bei 2 mg / ml herzustellen, wiegen Sie 3,52 mg Naringenin und geben Sie es in ein 2,0 ml Röhrchen.
- DMSO-Lösung
- Um Naringeninlösung bei 2 mg / ml herzustellen, wiegen Sie 3,95 mg Naringenin und geben Sie es in ein 2,0 ml Röhrchen.
HINWEIS: Um eine Konzentration von 2 mg/ml zu erreichen, beträgt das erforderliche Gesamtvolumen 1975 μL (Berechnung: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/ml). - Schnell herunterdrehen (2000 x g für 30 s), damit sich das Naringeninpulver am Boden des Röhrchens absetzt.
- 9,8 μL DMSO in das Röhrchen geben, um eine 0,5%ige (v/v) Lösung herzustellen (Berechnung: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). Naringenin löst sich vollständig auf (Abbildung 2A).
- Geben Sie 88,2 μL DMSO in das Röhrchen, um eine 5%ige (v/v) Lösung in Bezug auf das erforderliche Gesamtvolumen herzustellen (Berechnung: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). Naringenin löst sich vollständig auf (Abbildung 2B).
- 1877 μl 0,9 % PS (v/v % 95 %) zu der in Schritt 2.2.4 hergestellten Lösung zugeben. Es wird eine Emulsion hergestellt (Abbildung 1C). Zentrifugieren (2000 x g für 30 s) die Lösung, um zu überprüfen, ob Naringenin vollständig in der Lösung gelöst ist. In der Lösung erscheinen weiße Ausscheidungen von ungelöstem Naringenin (Abbildung 1D).
- Um Naringeninlösung bei 2 mg / ml herzustellen, wiegen Sie 3,95 mg Naringenin und geben Sie es in ein 2,0 ml Röhrchen.
- Tween-80- und DMSO-Lösung
- Um die Naringeninlösung bei 2 mg / ml herzustellen, wiegen Sie 6,69 mg Naringenin und geben Sie sie in ein 5,0 ml Röhrchen.
HINWEIS: Um die Endkonzentration von 2 mg/ml zu erreichen, beträgt das erforderliche Gesamtlösungsvolumen 3345 μL (Berechnung: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/ml). - Schnell herunterdrehen (2000 x g für 30 s), damit sich das Naringeninpulver am Boden des Röhrchens absetzt.
- Fügen Sie 117,7 μL DMSO hinzu, um eine 3,5%ige (v/v) Lösung in Bezug auf das erforderliche Gesamtvolumen herzustellen (Berechnung: 117,7 μL / 3345 μL x 100% = 3,5%). Naringenin löst sich vollständig auf (Abbildung 3A)
- Man gibt 117,7 μl Tween 80 zu der in Schritt 2.3.3 hergestellten Lösung, um 3,5 % (v/v) Tween 80 und 3,5 % (v/v) DMSO zu erhalten. Beobachten Sie die vollständige Auflösung von Naringenin (Abbildung 3B)
- Die in Schritt 2.3.4 vorbereitete Lösung wird langsam in ein 5,0-ml-Röhrchen mit 3109,6 μl 0,9 % PS (v/v % von 93 %) gegeben und gut geschüttelt, um eine scheinbare Naringeninlösung zu erhalten (Abbildung 3C).
- Die in Schritt 2.3.5 vorbereitete Lösung 2 h bei Raumtemperatur (RT) stehen lassen. Die Lösung ist immer noch ohne sichtbare Ausfällungen sichtbar (Abbildung 3D).
- Um die Naringeninlösung bei 2 mg / ml herzustellen, wiegen Sie 6,69 mg Naringenin und geben Sie sie in ein 5,0 ml Röhrchen.
- Herstellung von Naringenin-Lösung zur In-vivo-Verabreichung
- Gemäß Schritt 1.2.2 werden 160 mg Naringenin gewogen (160 mg / 2 mg/ml = 80 ml).
- Fügen Sie 2,8 ml DMSO hinzu, um eine Lösung von 3,5% (v/v) zu erhalten (Berechnung: 2,8 ml / 80 ml x 100% = 3,5%)
- Dann werden 2,8 ml Tween 80 zu der in Schritt 2.4.2 vorbereiteten Lösung gegeben, um 3,5 % (v/v) Tween 80 und 3,5 % (v/v) DMSO zu erhalten.
- Aliquot wird die in Schritt 2.4.3 hergestellte Lösung in vier Röhrchen 1,4 ml pro Röhrchen [(2,8 ml + 2,8 ml) / 4 = 1,4 ml] gegeben.
- Aliquot 18,6 mL von 0,9% PS auf fünf 15 mL Röhren.
- Die in Schritt 2.4.3 (Stammlösung) und 2.4.5 vorbereitete Lösung wird bei 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml) gelagert.
- Man nehme 140 μL der Stammlösung (Schritt 2.4.3) und mischt sie mit 1860 μL 0,9% PS, um 2 ml Naringeninlösung für 1 Tag der Verabreichung vorzubereiten.
- Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-μm-Filter.
3. Verwaltung der Naringenin-Lösung
- Handhabung und Zurückhaltung
- Besprühen Sie den Käfig und die Hände mit 70-75% Alkohol, bevor Sie den Deckel öffnen. Heben Sie die Maus an der Basis des Schwanzes an und legen Sie sie auf eine feste Oberfläche, um ihren Schwanz sanft nach hinten zu positionieren.
- Fassen Sie den Hals hinter den Ohren mit dem linken Daumen und Zeigefinger und positionieren Sie den Schwanz zwischen dem kleinen und dem Ringfinger. Halten Sie die Maus in Rückenlage mit leicht erhöhtem hinterem Ende.
- Injektion
- Fassen Sie die Rückenhaut der Maus so, dass die Bauchhaut straff ist.
- Drücken Sie die Nadel (Insulinspritze) in einem Winkel von 10° zwischen der Nadel und der Bauchoberfläche im unteren rechten oder linken Quadranten des Bauches ein, um zu vermeiden, dass die Blase, die Leber oder andere innere Organe getroffen werden.
- Führen Sie die Nadel subkutan in kranialer Richtung für 3-5 mm und führen Sie sie dann in einem Winkel von 45° in die Bauchhöhle ein.
- Wenn die Nadel durch die Bauchdecke geht und der Widerstand verschwindet, führen Sie eine Aspiration durch, um zu bestätigen, dass kein Rückflussmaterial zurückgezogen wird. Drücken Sie dann langsam die Lösung.
- Ziehen Sie nach der Injektion die Nadel langsam heraus und drehen Sie sie leicht, um ein Auslaufen zu vermeiden. Das empfohlene Volumen beträgt 50-100 μL/10 g.
- Entsorgen Sie übrig gebliebenes Naringenin in einem Biogefahrenbehälter.
4. Blutzuckertest
HINWEIS: Testen Sie den Blutzucker 1 Tag vor der Injektion und 1 und 2 Monate nach der Injektion.
- Beschleunigen Sie die Mäuse für 15 h vor dem Blutzuckertest. Wasser kann weiterhin zur Verfügung gestellt werden.
- Öffnen Sie die Teststreifen und markieren Sie das Datum. Nach dem Öffnen verwenden Sie die Teststreifen innerhalb von 3 Monaten. Lagern Sie die Teststreifen bei 2-30 °C. Schließen Sie den Deckel nach dem Entfernen des Streifens fest, um die Bildung von Feuchtigkeit zu verhindern.
- Legen Sie das Tier in die Induktionskammer. Schalten Sie den Vaporizer bei einem Induktionsniveau von 4% für Isofluran und 4 L/min für Sauerstoff ein. Nachdem das Tier vollständig betäubt wurde, halten Sie das Anästhetikum mit dem Nasenzapfen und der Anästhesieabgabe auf einem Niveau von 1,5% für Isofluran und 0,4 l / min für Sauerstoff.
- Wischen Sie den Schwanz mit Wattebällchen / Tupfern ab, die in 70% -75% Alkohol getränkt sind.
- Ausgehend vom tiefsten Punkt des Schwanzes machen Sie eine kleine Punktion an der seitlichen Schwanzvene mit einem 25G-Nadelstich und drücken Sie einen Tropfen Blut heraus.
- Wischen Sie den Blutstropfen mit einem Seidenpapier ab.
- Drücken Sie einen weiteren Tropfen Blut aus und sammeln Sie ihn am Rand eines Teststreifens.
- Lesen und notieren Sie das auf dem Blutzuckermessgerät angezeigte Ergebnis.
- Um die Blutung zu stoppen, kneifen Sie den Schwanz der Maus mit einer sterilen Gaze und wischen Sie den Bereich mit 75% Alkohol ab.
- Zusätzliche Proben können durch eine ähnliche Technik erhalten werden, die den Schwanz kranial nach oben bewegt.
5. TRAP-Färbung
- Folienvorbereitung
- Führen Sie einmal pro Woche Nüchternblutzuckertests an den Mäusen durch. Wenn der Blutzuckerspiegel 11,1 mmol / L ≥ (ein Hinweis auf erfolgreiche Typ-II-Diabetes-Mäuse Modell 24), euthanasieren Sie die Mäuse mit CO2, gefolgt von zervikaler Disklokation, und sammeln Sie die lumbalen 4th-6 th (L4-L6) (keine Euthanasie wird während des Nüchternblutzuckertests durchgeführt).
- Fixieren Sie die L4-L6-Proben mit 4% Paraformaldehyd für 24 h (stellen Sie sicher, dass das Volumen von Paraformaldehyd >20x des Volumens des Gewebes) ist, und waschen Sie dann 2 h lang im kontinuierlichen Fluss von Leitungswasser.
- Um die Proben zu entkalken, tauchen Sie sie in eine 10% ige Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung für 2 Wochen bei RT in statischem Zustand, bis die Proben weich sind. Stellen Sie sicher, dass das Volumen der Entkalkungslösung das 20- bis 30-fache des Volumens des Gewebes/der Probe beträgt. Ändern Sie die EDTA-Lösung jeden zweiten Tag.
- Dehydrieren Sie die Probe mit einem Dörrgerät.
- Legen Sie die Proben in Gewebeverarbeitungskassetten, die Kassetten einbetten. Nummerieren Sie die Kassette mit einem Bleistift.
- Stellen Sie das Dörrprogramm wie folgt ein: 75% Alkohol für 2 h, 85% Alkohol für 1 h, 95% Alkohol für 1 h, 95% Alkohol für 2 h, wasserfreies Ethanol (I) für 2 h, wasserfreies Ethanol (II) für 2 h, wasserfreies Ethanol (III) für 2 h, Xylol (I) für 1 h, Xylol (II) für 1 h, Paraffinwachs (I) für 2 h und Paraffinwachs (II) für 2 h bei RT.
- Die Proben in Paraffinwachs einbetten.
- Paraffinwachs in die Kassettenschale der Paraffineinbettstation geben und auf 60 °C erhitzen. Tauchen Sie die dehydrierten Proben für mindestens 2 h ein.
- Legen Sie die Taschentuchkassette in die Kassettenschale und heizen Sie vor.
- Paraffinwachs in den Paraffinbehälter geben und auf 60 °C erhitzen.
- Nach 2 h bringen Sie sowohl die Gewebekassette als auch die Proben in den Arbeitsbereich. Gießen Sie das vorgewärmte Paraffinwachs aus dem Paraffinreservoir in die Gewebekassette. Legen Sie die Probe in das Paraffinwachs, stellen Sie sicher, dass das Paraffinwachs das Gewebe vollständig bedeckt, und bewegen Sie die Kassette sofort auf eine Vereisungsstation.
- Verwenden Sie ein Mikrotom, um die paraffineingebetteten Proben in 5-6 μm Abschnitte zu schneiden. Die Abschnitte in 40 °C warmem Wasser für weniger als 10 s entfalten. Sammeln Sie die Abschnitte auf APS (Aminosilan) beschichteten Glasobjektträgern. Trocknen Sie die Objektträger bei RT für 1 h und stellen Sie die Objektträger dann über Nacht in einen auf 60 °C eingestellten Ofen.
- TRAP Reagenz Vorbereitung
- Basische Stamminkubationslösung vorbereiten: 9,2 g wasserfreies Natriumacetat, 11,4 g L-(+) Weinsäure und 2,8 ml Eissäure in 1000 ml destilliertem Wasser lösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,7-5,0 ein und lagern Sie ihn bis zu 6 Monate bei RT.
- Naphtholetherlösung vorbereiten: 0,1 g Naphthol-AS-BI-Phosphat in 5 mL Ethylenglykolmonoethylether lösen. Bei 4 °C bis zu 5 Wochen lagern.
- Natriumnitritlösung vorbereiten: 1 g Natriumnitrit in 25 ml destilliertem Wasser lösen. Bei 4 °C lagern.
- Pararosanilinfarbstoff vorbereiten: Fügen Sie 1 g Pararosanilinbase zu 20 ml 2N HCl (83 ml HCl in 417 ml Wasser) hinzu. Verwenden Sie eine Rührplatte, um die Basis aufzulösen und vor Gebrauch zu filtern.
- TRAP-Färbung
- Füllen Sie zwei Coplin-Gläser mit 50 ml Basis-Inkubationslösung und stellen Sie sie für 2 h in einen 37 °C-Ofen.
- Nehmen Sie ein Coplin-Glas und fügen Sie 0,5 ml Naptoletherlösung hinzu.
- Die Objektträger in das Coplin-Glas geben und 1 h bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Bereiten Sie mindestens drei Folien für jede Gruppe vor. - Einige Minuten vor Ablauf der Inkubationszeit 1 ml Natriumnitritlösung und 1 ml Pararosanilinfarbstoff hinzufügen. 30 s vorsichtig mischen und 2 min stehen lassen.
- Die in Schritt 5.2.2 vorbereitete Lösung wird in das andere vorgewärmte Coplin-Glas mit der Stammbasenlösung gegeben. Mischen Sie die Lösung gut und legen Sie die Objektträger aus dem Coplin-Glas in Schritt 5.3.3 ein.
- Inkubieren Sie für 15-20 min bei RT.
- Spülen Sie die Scheiben in einem anderen Coplin-Glas mit 200 ml PBS für 5 min ab.
- Die Scheiben mit 100% Hämatoxylin für 30 s in einem Coplin-Glas gegenfärben.
- Dehydrieren Sie die Scheiben mit 85%, 95% und 100% Alkohol (200 ml) für jeweils 2 min und behandeln Sie sie in Xylol (200 ml) für 2 min für 3x. Verwenden Sie Coplin-Gläser, um jeden Schritt auszuführen.
- Befestigen Sie den Abschnitt auf dem Deckglas mit einem Deckglas aus Harz. Achten Sie darauf, das Einfangen von Luftblasen zu vermeiden.
6. ELISA
- Probenvorbereitung
- Entfernen Sie die Weichteile aus dem Femur und der Tibia der Maus. Reinigen Sie die Knochen mit Gaze.
- Die Knochenproben in ein 1-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben und die Probenröhrchen bei -80 °C lagern.
HINWEIS: Die Proben können auch nicht länger als 6 Monate in einem Flüssigstickstofftank gelagert werden. - Wiegen Sie die Knochenprobe. Mit 0,9% PS im Verhältnis 1:10 verdünnen. Zum Beispiel verdünnen Sie 0,1 g Knochen mit 1 ml PS.
- 3 mm Zirkonia-Perlen in das Röhrchen geben und die Proben 3x bei 70 Hz für 30 s mit 20 s Pause dazwischen mahlen.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 4 °C und 12.000 x g für 5 min. Sammle den Überstand.
- ELISA-Assay-Kit
HINWEIS: Führen Sie den ELISA gemäß dem vom Hersteller angegebenen Assay-Protokoll durch.- Geben Sie 100 μL jeder Verdünnung von Standard, Blindprobe und Probe in die entsprechenden Vertiefungen. 90 min bei 37 °C inkubieren.
- Dekantieren Sie die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung und fügen Sie 100 μL biotinylierte Nachweisantikörper-Arbeitslösung hinzu. 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Dekantieren Sie die Lösung, geben Sie 350 μL Waschpuffer in jede Vertiefung. 1 min einweichen, 3x wiederholen.
- Fügen Sie 100 μL HRP-konjugierte Arbeitslösung in jede Vertiefung hinzu. 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Dekantieren Sie die Lösung. Wiederholen Sie den Waschvorgang 5x wie in Schritt 6.2.3 beschrieben.
- Fügen Sie 90 μL des Substratreagenzes hinzu. 15 min bei 37 °C lichtgeschützt inkubieren.
- Fügen Sie 50 μL der Stopplösung hinzu.
- Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Absorption jeder Vertiefung bei 450 nm aufzuzeichnen.
- Erzeugung von Standardkennlinien
- Die jeweiligen mittleren Extinktionswerte werden gegen die seriell verdünnten Proteinkonzentrationen aufgetragen.
- Verbinden Sie die Punkte, um die Best-Fit-Kurve zu erstellen. Verwenden Sie eine geeignete Computeranwendung (Tabellenkalkulation), um die Standardkurvengleichung zu generieren.
- Ersetzen Sie den Absorptionswert jeder Probe in der Standardkurvengleichung, um die Konzentration der jeweiligen Probe zu erhalten.
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Representative Results
Es wurde festgestellt, dass das Körpergewicht der fettreichen, mit Diät gefütterten und STZ-induzierten diabetischen Mäuse im Vergleich zu den Kontrollgruppen 0-8 Wochen nach der STZ-Behandlung abnahm. Der Gewichtsverlust von Naringenin-behandelten Mäusen war im Vergleich zu den unbehandelten Mäusen (STZ-Gruppe) in Woche 4 signifikant. Die Kontroll- und STZ-Gruppen wurden mit dem gleichen PS-Volumen verabreicht (Tabelle 1). Der Blutzuckerspiegel bei diabetischen Mäusen stieg innerhalb von 1 Monat nach STZ-Induktion dramatisch an. Es sank dann automatisch auf ein Niveau, das vor 2 Monaten beobachtet wurde, als das Tiermodell etabliert wurde. Die Behandlung mit Naringenin senkte den Blutzuckerspiegel nach 1 bzw. 2 Monaten um 51,8 % bzw. 34,8 % (Tabelle 2). STZ-induzierte diabetische Mäuse zeigten Knochenverlust, was durch die Abnahme des Knochenvolumens/Gewebevolumens (BV/TV) (30,97%) bzw. der Anzahl der Trabekeln (Tb.N) (11,4%) angezeigt wird. Die Veränderungen der Werte dieser beiden Parameter deuten darauf hin, dass die Naringenin-Behandlung den Knochenverlust signifikant gerettet hat (Tabelle 3). Die Osteoklastenaktivität gemäß N.oc/Tb.Ar (Osteoklastenzahl pro trabekulärer Knochenfläche) war bei fettreichen Diät- und STZ-induzierten diabetischen Mäusen erhöht, obwohl keine statistische Signifikanz zwischen dem Kontroll- und dem Krankheitsmodell beobachtet wurde. Die Behandlung mit Naringenin verringerte signifikant die Osteoklastenaktivität, wie in Abbildung 4 und Tabelle 4 gezeigt. Das C-terminale Telopeptid von Typ-I-Kollagen (CTIX) und das N-terminale Propeptid von Typ-I-Prokollagen (PINP) waren bei Diabetikern um 68,09% bzw. 204,88% erhöht, was auf einen dramatischen Anstieg der Knochenresorptionsrate hinweist. Naringenin verringerte beide Indikatoren der Knochenresorptionsrate signifikant (Tabelle 5).
Abbildung 1: Auflösen von Naringenin in Ethanol. (A) Naringeninpulver im Röhrchen nach dem Abdrehen. (B) Naringenin + Ethanol (400 mg/ml - 3,52 mg Naringenin in 8,8 μL Ethanol). (C) Naringenin + Ethanol (40 mg/ml - 3,52 mg Naringenin in 8,8 μL Ethanol) (D) Naringenin in 5% (v/v) Ethanol und 95% PS (0,9%). (E) fällt nach dem Abdrehen in D aus. (F) Messung zum Abrufen des Maßstabsbalkens für Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 3. Nar: Naringenin. Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Auflösen von Naringenin in DMSO. (A) Naringenin + DMSO (400 mg/ml - 3,95 mg Naringenin in 9,8 μL DMSO). (B) Naringenin + DMSO (40 mg / ml - 3,95 mg Naringenin in 98 μL DMSO). (C) Naringenin in 5% (v/v) DMSO und 95% PS (0,9%). (D) fällt nach dem Abdrehen in C aus. Nar: Naringenin. Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Auflösen von Naringenin in DMSO und Tween 80. (A) Naringenin + DMSO (57,2 mg/ml - 6,69 mg Naringenin in 117,7 μL DMSO). (B) Naringenin + DMSO + Tween (57,2 mg/ml - 6,69 mg Naringenin in 117,7 μL DMSO und 117,7 μL Tween 80). (C) Naringenin in der Mischung aus 3,5% (v/v) DMSO, 3,5% (v/v) Tween 80 und 93% PS (0,9%). (D) Keine Ausfällungen in C nach dem Abdrehen. Nar: Naringenin. Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Wirkung von Naringenin auf die Osteoklastenaktivität der fettreichen und STZ-injizierten (STZ) Mäuse. TRAP-Färbung von trabekulären Knochen und Osteoklasten von L4-Wirbeln. Dreiecke zeigten Osteoklasten an. Maßstabsbalken = 100 μm. Diese Zahl wurde von Liu et al.25 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| g) | 0 Woche | 1 Woche | 2 Wochen | 4 Wochen | 5 Wochen | 6 Wochen | 8 Wochen |
| Steuerung | 23,7 ± 0,2 | 25,1 ± 1,3 | 26,2 ± 1,0 | 27,7 ± 0,5 | 31,1 ± 0,7 | 31,7 ± 0,8 | 32,7 ± 1,3 |
| STZ | 16,8 ± 1,7** | 18,2 ± 2,5** | 18,6 ± 2,5** | 18,2 ± 1,4** | 21,3 ± 1,6** | 22,0 ± 1,4** | 20,8 ± 1,4** |
| Naringenin | 16,6 ± 1,1** | 17,6 ± 1,5** | 17,4 ± 1,7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0,01 vs. Kontrolle | |||||||
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | |||||||
Tabelle 1: Körpergewicht von fettreichen, mit Diät gefütterten und STZ-injizierten (STZ) Mäusen über Gruppen und Perioden hinweg. Die Daten werden als Mittelwert ± s.d. ** p < 0,01 vs. Control, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| (mmol/L) | 0 Monat | 1 Monat | 2 Monate |
| Steuerung | 4,9 ± 0,9 | 8,4 ± 0,7 | 8,3 ± 0,5 |
| STZ | 12,8 ± 4,2** | 22,8 ± 4,3** | 15,5 ± 2,7* |
| Naringenin | 13,2 ± 3,5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0,05, ** p < 0,01 vs. Control | |||
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | |||
Tabelle 2: Nüchternblutzucker von STZ-Mäusen über Gruppen und Zeiträume hinweg. Die Daten werden als Mittelwert ± s.d. * p < 0,05 ** p < 0,01 vs. Control, ΔΔ p < 0,01 vs . STZ angezeigt.
| BV/TV (%) | Tb.N (1/mm) | |
| Steuerung | 0,268 ± 0,046 | 5,35 ± 0,31 |
| STZ | 0,185 ± 0,081* | 4,74 ± 0,77* |
| Naringenin | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0,05 vs. Kontrolle | ||
| Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | ||
Tabelle 3: Knochenmassebezogene Parameter von STZ-Mäusen über Gruppen hinweg. Die Daten werden als Mittelwert ± s.d. * p < 0,05 vs. Control, Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ angezeigt.
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| Steuerung | 0,000182 ± 8,84 E-05 |
| STZ | 0,00024 ± 2,06E-05 |
| Naringenin | 0,000156 ± 3,88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | |
Tabelle 4: Osteoklastenaktivität von STZ-Mäusen über Gruppen hinweg. Die Daten werden als Mittelwert ± s.d. ΔΔ p < 0,01 vs. STZ angezeigt.
| ng/ml | CTIX | PINP |
| Steuerung | 22 ± 8,98 | 1,64 ± 0,95 |
| STZ | 36,98 ± 22,57 | 5 ± 2,33 * |
| Naringenin | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0,05 vs. Kontrolle | ||
| ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | ||
Tabelle 5: Knochenresorptionsrate von STZ-Mäusen über Gruppen hinweg. Die Daten werden als Mittelwert ± s.d. * p < 0,05 vs. Control, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ angezeigt.
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Discussion
Die Herstellung der phytochemischen Lösung ist die Grundlage für ihre Anwendung in vivo. In diesem Protokoll wurde die Herstellung von Naringeninlösung unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel wie Ethanol, DMSO, Tween 80 und 0,9% PS demonstriert. Die Lösung im vollständig gelösten Zustand muss weiter überwacht werden, indem sie für einige längere Stunden bei Raumtemperatur bleibt und dann gefiltert wird, bevor sie in vivo verwendet wird.
Die Lösungsmittelbestimmung ist ein kritischer Schritt in diesem Protokoll. Es gibt viele Lösungsmitteloptionen zum Lösen von Verbindungen, von denen Ethanol, DMSO und PS am häufigsten verwendet werden. Ethanol kann aufgrund seiner hochpolaren Eigenschaften viele wasserunlösliche Verbindungen lösen, wodurch Wasserstoffbrücken gebunden werden und somit sowohl polare als auch unpolare Substanzen gelöst werden. Darüber hinaus kann die Konzentration von Ethanol die Eigenschaften der phytochemischen Verbindung bestimmen. Zum Beispiel gilt 75 Gew.% Ethanol / Wasser-Lösungsmittel als das beste für die Extraktion der höchsten Ausbeute an Polyphenolen und hat die stärksten antioxidativen Eigenschaften26. Eine andere Studie ergab, dass die Ethanolkonzentration bei 150 °C auf 32,5% gesenkt werden konnte, damit Polyphenolextrakte eine antioxidative Eigenschaft exprimieren27. Eine hohe Konzentration von Ethanol kann jedoch Neurotoxizität und Hepatotoxizität verursachen28. Ethanolinjektion (i.p.) in einem Konzentrationsbereich von 8% -32% v/v wird üblicherweise zur Verhaltensbewertung verwendet und kann bedingte Geschmacksabneigung und Hypothermie verursachen29. DMSO ist ein dipolares aprotisches Lösungsmittel mit hoher Polarität und wird als Lösungsmittel zum Lösen zahlreicher organischer Verbindungen verwendet. Eine Vergleichsstudie ergab, dass DMSO/Methanol (50:50 v/v) zu einer optimalen Ausbeute an Phenolsäuren in Zitrusschalenführte 30. Dosis, Konzentration und Häufigkeit sind jedoch keine ignorierenden Faktoren, wenn DMSO an Tiere abgegeben wird. Eine intraperitoneale Dosis von 17,7 g/kg bei Mäusen erreichte LD50, während die Dosis bei Mäusen für 6 Wochen auf 2,5 g/kg gesenkt wurde, keine beobachtbaren Nebenwirkungen31. Obwohl die empfohlene DMSO-Konzentration 0,5% -5% beträgt, ist DMSO nicht in der Lage, viele Verbindungen aufzulösen. Colucci et al. testeten die Wirkungen von DMSO und DMSO-haltiger Kochsalzlösung in verschiedenen Konzentrationen durch intrazerebroventrikuläre und orale Verabreichung an Mäusen. Die Studie zeigte, dass eine Lösung von 25% DMSO in Kochsalzlösung die Verhaltensreaktionen der Tiere nicht veränderte32. Tween 80 ist ein nichtionisches Tensid und wird häufig als Co-Lösungsmittel verwendet, um die Löslichkeit von schwer löslichen Arzneimitteln zu erhöhen und pharmakokinetische Eigenschaften zu verbessern33. Unter Berücksichtigung der Sicherheit33 wurde eine Konzentration von 1% Tween 80 gewählt. Daher wurden die oben genannten Lösungsmittel und Tenside in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet, um Naringenin für die intraperitoneale Verabreichung vollständig zu lösen.
Einige Vorschläge sind hier zur Prüfung aufgeführt. Erstens schlagen wir vor, von einer kleinen Menge phytochemischer Verbindung für vorläufige Experimente unter Berücksichtigung der Verbrauchskosten zu beginnen. Zweitens ist es notwendig, vor der Herstellung der Lösung eine umfassende Literaturrecherche durchzuführen, insbesondere genaue Studien zu Tierarten, Krankheiten, Verabreichungswegen und Häufigkeit. Drittens sind die Konzentrationsbereiche von Lösungsmitteln und Co-Lösungsmitteln wie Tensiden abhängig von der verfügbaren Literatur, den Vorversuchen und dem Zweck des Studiendesigns. Viertens wird die Verwendung einer Insulinspritze anstelle einer normalen Spritze empfohlen, um die Injektionsverletzung von einer relativ hohen Verabreichungshäufigkeit zu reduzieren. Fünftens, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, wird empfohlen, die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter zu sterilisieren und sterile Spritzen und Wattestäbchen zu verwenden, die in Alkohol getränkt sind, wenn die Lösung in lebende Tiere injiziert wird.
Die Vorteile des Protokolls sind seine einfache Bedienung und niedrige Kosten. Zusammenfassend zeigt das Protokoll die Herstellung einer phytochemischen Lösung zur intraperitonealen Verabreichung bei Mäusen am Beispiel von Naringenin. Das Protokoll wird den Forschern zugute kommen, die sich mit Drogenscreening oder Pharmakologie befassen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81973607 und 81573992) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
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