A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Leren en geheugen zijn krachtige maatstaven bij het bestuderen van ontwikkelings-, ziekteafhankelijke of door het milieu veroorzaakte cognitieve stoornissen. De meeste cognitieve beoordelingen vereisen gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide tijdsbestedingen. De shuttle box assay is echter een associatief leermiddel dat een conventionele gelbox gebruikt voor een snelle en betrouwbare beoordeling van de cognitie van volwassen zebravissen.

Abstract

Cognitieve tekorten, waaronder verminderd leren en geheugen, zijn een primair symptoom van verschillende ontwikkelings- en leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten en traumatisch hersenletsel (TBI). Zebravissen zijn een belangrijk neurowetenschappelijk model vanwege hun transparantie tijdens de ontwikkeling en robuuste regeneratieve mogelijkheden na neurotrauma. Hoewel er verschillende cognitieve tests bestaan bij zebravissen, onderzoeken de meeste cognitieve beoordelingen die snel zijn niet-associatief leren. Tegelijkertijd vereisen associatieve leertests vaak meerdere dagen of weken. Hier beschrijven we een snelle associatieve leertest die gebruik maakt van een ongunstige stimulus (elektrische schok) en minimale voorbereidingstijd vereist. De shuttle box-test, hier gepresenteerd, is eenvoudig, ideaal voor beginnende onderzoekers en vereist minimale apparatuur. We tonen aan dat, na TBI, deze shuttle box test reproduceerbaar cognitieve tekorten en herstel van jonge tot oude zebravissen beoordeelt. Bovendien is de test aanpasbaar om onmiddellijk of vertraagd geheugen te onderzoeken. We tonen aan dat zowel een enkele TBI als herhaalde TBI-gebeurtenissen een negatieve invloed hebben op het leren en het onmiddellijke geheugen, maar niet op vertraagd geheugen. We concluderen daarom dat de shuttle box assay reproduceerbaar de progressie en het herstel van cognitieve stoornissen volgt.

Introduction

Leren en geheugen worden routinematig gebruikt als metrieken van cognitieve stoornissen, die optreedt als gevolg van veroudering, neurodegeneratieve ziekte of letsel. Traumatisch hersenletsel (TBI’s) is het meest voorkomende letsel dat resulteert in cognitieve tekorten. TBI’s zijn van groeiende zorg vanwege hun associatie met verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zoals frontotemporale dementie en de ziekte van Parkinson^1,2. Bovendien suggereren de verhoogde bèta-amyloïde aggregaties waargenomen bij sommige TBI-patiënten dat het ook geassocieerd kan zijn met de ontwikkeling van de ziekte van Alzheimer^3,4. TBI’s zijn vaak het resultaat van stomp krachttrauma en omvatten een reeks ernst⁵, waarbij mild hersenletsel (miTBI) de meest voorkomende is. MiTBIs worden echter vaak niet gerapporteerd en verkeerd gediagnosticeerd omdat ze slechts voor een korte periode resulteren in kleine cognitieve stoornissen en de gewonde personen meestal volledig herstellen⁶. Daarentegen zijn herhaalde miTBI-gebeurtenissen een groeiende zorg omdat het veel voorkomt bij jonge en middelbare volwassenen, zich in de loop van de tijd kan ophopen⁷, de cognitieve ontwikkeling kan schaden en neurodegeneratieve ziekten kanverergeren^1,2,3,4,5,vergelijkbaar met personen die een matige of ernstige TBI ervaren⁸.

Zebravis (Danio rerio) is een nuttig model voor het verkennen van een verscheidenheid aan onderwerpen in de neurowetenschappen, waaronder het vermogen om verloren of beschadigde neuronen in het centrale zenuwstelsel te regenereren^{9,10,11,12,13}. Neurale regeneratie werd ook aangetoond in het telencephalon, dat het archipallium in het dorsaal-binnenste gebied bevat. Dit neuroanatomische gebied is analoog aan de hippocampus en is waarschijnlijk nodig voor cognitie bij vissen en voor het korte-tijd geheugen bij mensen^14,15,16. Verder is het gedrag van zebravissen uitgebreid gekarakteriseerd en gecatalogiseerd¹⁷. Leren is bestudeerd door middel van verschillende technieken, waaronder gewenning aan de schrikreactie¹⁸, die een snelle vorm van niet-associatief leren kan vertegenwoordigen wanneer het wordt uitgevoerd in korte blokken en met aandacht voor de snelle vervaltijd¹⁹. Meer complexe tests van associatief leren, zoals T-boxen, plus-doolhoven en visuele discriminatie^20,21 worden gebruikt, maar zijn vaak tijdrovend, vereisen dagen of weken voorbereiding en vertrouwen op scholen of positieve bekrachtiging. Hier beschrijven we een snel paradigma om zowel associatief leren als onmiddellijk of vertraagd geheugen te beoordelen. Deze shuttle box assay maakt gebruik van een aversieve stimulus en negatieve versterking conditionering om cognitieve tekorten en herstel na stompe kracht TBI te beoordelen. We tonen aan dat onbeschadigde controle volwassen zebravissen (8-24 maanden) reproduceerbaar leren om het rode licht te vermijden binnen 20 proeven (<20 minuten beoordeling) in de shuttlebox, met een hoge mate van consistentie tussen waarnemers. Bovendien tonen we met behulp van de shuttlebox aan dat leer- en geheugenvaardigheden bij volwassenen (8-24 maanden oud) consistent zijn en nuttig zijn voor het testen van cognitie met significante stoornissen tussen verschillende TBI-ernst of herhaalde TBI. Bovendien kan deze methode snel worden gebruikt als een metriek om een breed scala aan ziekteprogressies of werkzaamheid van medicamenteuze interventies te volgen die van invloed zijn op het behoud of herstel van cognitie bij volwassen zebravissen.

Hier geven we een instructief overzicht van een snelle cognitieve beoordeling die zowel complex associatief leren (sectie 1) als geheugen kan onderzoeken in termen van zowel onmiddellijk als vertraagd geheugen. Dit paradigma biedt een beoordeling van het korte- en langetermijngeheugen van een aangeleerde associatieve cognitieve taak (sectie 2).

Protocol

Zebravissen werden grootgebracht en onderhouden in de Notre Dame Zebrafish-faciliteit in het Freimann Life Sciences Center. De methoden beschreven in dit manuscript zijn goedgekeurd door de University of Notre Dame Animal Care and Use Committee (Animal Welfare Assurance Number A3093-01). 1. Shuttle box leerparadigma (Figuur 1A) OPMERKING: Het leerparadigma biedt een snelle beoordeling van cognitie met betrekking tot associatief leren. Bereid de shuttlebox voor door een gelbox van 30,5 x 19 x 7,5 cm aan te passen met een stuk plexiglas van 5 x 19 cm van aquariumkwaliteit dat aan elke kant is toegevoegd in een hoek van 45 °. Maak een lijn die het halverwege punt van de tank markeert om te beoordelen wanneer vissen het midden van de tank zijn overgestoken(figuur 1B). Voeg 800 ml systeemwater toe aan de shuttlebox. Maak dit water door 60 mg Instant Ocean op te lossen in 1 L gedeioniseerd RO-water. Vul het water in het midden van de tank tot een diepte van 5 cm.OPMERKING: Vervang door vers systeemwater bij 28 °C elke h of na het testen van 3 vissen. Plaats 2-3 vissen in een vuilwatertank met systeemwater, gelegen in een donkere kamer waar de shuttlebox-test zal worden uitgevoerd. Plaats in de donkere kamer 1 vis in het midden van de shuttlebox, bevestig het deksel en bevestig de elektroden aan een voeding.OPMERKING: De kamer moet zo donker mogelijk blijven tijdens het acclimatiseren en testen. Acclimeer de vis in de shuttle box gedurende 15 min.OPMERKING: De onderzoeker moet tijdens de acclimatisatieperiode in de kamer blijven of rustig terugkeren naar de testruimte met voldoende tijd voor het testen om vissen in staat te stellen zich aan te passen aan de aanwezigheid van de onderzoeker. Succesvolle acclimatisatie kan worden overwogen wanneer de vis vrijelijk de tank verkent. Als de vis niet kan verkennen, ga dan nog eens 15 minuten door met acclimatiseren. Als de vis nog steeds niet kan wennen aan de shuttlebox, verwijder dan de vis. Gebruik deze vis niet om te testen. Schijn handmatig een 800-lumen rode lens zaklamp ~ 2 cm van de gel box muur aan de kant bezet door de vis, na acclimatisatie.OPMERKING: Begin geen proef als de vis naast de platinadraad tegen de muur in de buurt van de diepe uiteinden van de shuttlebox rust. Laat de lichtprikkel rechtstreeks op de vis schijnen en volg handmatig elke zijwaartse beweging van de vis met het licht om een continue visualisatie van de stimulus te garanderen(figuur 1C). Blijf de lichtprikkel geven totdat aan een van de volgende voorwaarden is voldaan. Beschouw het pad als succesvol als de vis het halve punt van de tank oversteekt binnen de 15 s van blootstelling aan licht. Zodra de vis halverwege het punt is, stopt u de lichtprikkel onmiddellijk(figuur 1D). Beschouw het pad als mislukt als de vis niet in 15 s over het halve punt van de doos gaat. Gebruik in dit geval een elektroforese-voeding om een negatieve schokprikkel (20 mV: 1 A) toe te passen, afwisselend 2 s aan, 2 s uit gedurende een periode van 15 s (maximaal 4 schokken), of totdat de vis het halve punt van de doos passeert, waarna zowel de lichte als de negatieve stimulus eindigt. Laat de vis 30 s rusten en herhaal stap(en) 1.5-1.6.2. Houd een gedetailleerd overzicht bij van de volgorde van succesvolle onderzoeken (1.6.1) en mislukte onderzoeken (1.6.2).OPMERKING: Hier hebben we leren gedefinieerd als de voltooiing van 5 opeenvolgende succesvolle onderzoeken. Zodra het leren is aangetoond, moet de vis uit de shuttlebox worden verwijderd en op humane wijze worden geëuthanaseerd. 2. Geheugenparadigma (Figuur 1A) OPMERKING: Dit paradigma biedt een beoordeling van het korte- en langetermijngeheugen van een aangeleerde associatieve cognitieve taak. Trainingsperiode Voeg 800 ml systeemwater toe aan de shuttlebox. Maak dit water door 60 mg Instant Ocean op te lossen in 1 L gedeioniseerd RO-water. Vul het water in het midden van de tank tot een diepte van 5 cm.OPMERKING: Water moet worden vervangen door vers systeemwater bij 28 °C elke h of na het testen van 3 vissen. Plaats 2-3 vissen in een vuilwatertank die systeemwater bevat, gelegen in een donkere kamer waar de shuttlebox-test zal worden uitgevoerd. Plaats in de donkere kamer 1 vis in het midden van de shuttlebox, bevestig het deksel en bevestig de elektroden aan een voeding.OPMERKING: De kamer moet zo donker mogelijk blijven tijdens het acclimatiseren en testen. Acclimeer vis in de shuttle box gedurende 15 min.OPMERKING: De onderzoeker moet tijdens de acclimatisatieperiode in de kamer blijven of rustig terugkeren naar de testruimte met voldoende tijd voorafgaand aan het testen, zodat vissen zich kunnen aanpassen aan de aanwezigheid van de onderzoeker. Bepaal een succesvolle acclimatisatie wanneer de vis vrijelijk de tank verkent. Als de vis niet kan verkennen, ga dan nog eens 15 minuten door met acclimatiseren. Als de vis nog steeds niet kan wennen aan de shuttlebox, verwijder dan de vis en gebruik deze niet voor het testen. Na de succesvolle acclimatisatie schijnt handmatig een 800-lumen rode lenslantaarn ~ 2 cm van de zijwand van de gelbox, aan de zijkant van de shuttlebox die door de vis wordt bezet. Laat de lichtprikkel direct op de vis schijnen en volg elke zijwaartse beweging van de vis met het licht om te zorgen voor een voortdurende visualisatie van de stimulus door de vis. Terwijl het licht op de vis schijnt, past u tegelijkertijd de negatieve schokprikkel (20 mV: 1 A) toe, afwisselend 2 s aan, 2 s uit gedurende 15 s (maximaal 4 schokken), of totdat de vis halverwege de doos passeert. Zodra dit is bereikt, beëindigt u zowel het licht als de negatieve stimulus.OPMERKING: Laat de vis 30 s rusten en herhaal stap 2.1.6-2.1.8 voor 25 iteraties(Figuur 1A). Eerste testen Laat 15 minuten rust aan de vis na de trainingsperiode. Haal ze niet uit de shuttlebox. Test het initieel geheugenbehoud door elke proef te registreren als strikt geslaagd/mislukt, onmiddellijk na deze rustperiode. Pas alleen de lichtprikkel toe gedurende maximaal 15 s en noteer de reacties als volgt. Beschouw de proef als geslaagd als de vis binnen 15 s na het starten van de lichtprikkel over het halve punt van de shuttlebox gaat. Stop de lichtprikkel onmiddellijk wanneer de vis halverwege het punt is. Beschouw de proef als mislukt als de vis niet 15 s na het starten van de lichtprikkel over het halve punt van de shuttlebox gaat. Stop de lichtprikkel na 15 s.OPMERKING: Tijdens de eerste test wordt geen negatieve stimulus toegepast na een mislukte poging. Herhaal stap 2.2.2, met een rustperiode van 30 s tussen de proeven, en registreer succesvolle onderzoeken (2.2.2.1) en mislukte onderzoeken (2.2.2.2) in 25 onderzoeken. Deze waarde zal dienen als een individuele referentie voor elke vis. Onmiddellijke herinnering Induceer letsel onmiddellijk na de eerste testperiode door het gewenste schadeparadigma (bijvoorbeeld een stompkrachttrauma met behulp van de gemodificeerde Marmarou-gewichtsdaling). Huisvissen individueel voor een eenvoudige identificatie. Noteer hun initiële testwaarden en breng vissen terug naar de dierenfaciliteit.OPMERKING: Vissen werden gewond door stompe kracht TBI zoals eerder beschreven22. Verzamel 2-3 onbeschadigde of TBI-vissen 4 uur na de eerste test en/of 4 uur na het verwonding (of op het experimentele tijdsbestek in kwestie) uit de dierfaciliteit. Bewaar alle vissen in de donkere kamer in individuele tanks met systeemwater. Plaats de vis in het midden van de shuttlebox (bereid met systeemwater zoals beschreven in 1.1), één vis tegelijk en zet het deksel vast. Sluit de voeding aan en laat de vis 15 minuten acclimatiseren. Beoordeel na de acclimatisatie het onmiddellijke geheugen (strikt geslaagd /mislukt) door alleen de lichtprikkel gedurende maximaal 15 s toe te passen en de reacties als volgt vast te leggen. Beschouw de proef als geslaagd als de vis binnen de testperiode van 15 s over het halve punt van de doos gaat. Beëindig de lichtprikkel bij het passeren van het halverwege punt. Beschouw de proef als mislukt als de vis niet binnen 15 s na het starten van de lichtprikkel over het halve punt van de doos gaat. Beëindig de lichtprikkel nadat de periode van 15 s voorbij is.OPMERKING: Tijdens deze post-blessuretest wordt geen negatieve schokprikkel toegepast na een mislukte poging. Herhaal stap 2.3.4, met een rustperiode van 30 s tussen de proeven, en noteer het aantal succesvolle onderzoeken (2.3.4.1) en mislukte onderzoeken (2.3.4.2) in 25 onderzoeken. Bereken het procentuele verschil in succesvolle onderzoeken na het letsel ten opzichte van de eerste testperiode met behulp van de vergelijking: Vertraagd geheugen Breng vissen, die individueel zijn gehuisvest voor eenvoudige identificatie en registratie van hun oorspronkelijke testwaarden, onmiddellijk na de eerste testperiode terug naar de dierfaciliteit. Geef vissen 4 dagen (of het experimentele tijdsbestek in kwestie) tussen de eerste test en het letsel en/of vertraagde geheugentests. Induceer letsel door het gewenste schadeparadigma (zoals de gemodificeerde Marmarou-gewichtsdaling om een stomp krachttrauma te induceren). Huisvissen individueel voor eenvoudige identificatie van de initiële testwaarden en breng vissen terug naar de dierlijke faciliteit.OPMERKING: Vissen werden gewond door stompe kracht TBI zoals eerder beschreven22. Verzamel 2-3 onbeschadigde of TBI-vissen 4 uur na de eerste test en/of 4 uur na het verwonding (of op het experimentele tijdsbestek in kwestie) uit de dierfaciliteit. Bewaar alle vissen in de donkere kamer in individuele tanks met systeemwater en plaats één voor één in het midden van de shuttlebox (bereid met systeemwater zoals beschreven in 1.1), bevestig het deksel, bevestig de voeding en laat vissen 15 minuten acclimatiseren. Beoordeel na acclimatisatie het onmiddellijke geheugen (strikt geslaagd / mislukt) door alleen de lichtprikkel gedurende maximaal 15 s toe te passen en de volgende reacties op te nemen: Beschouw het parcours als succesvol als de vis binnen de testperiode van 15 s halverwege de doos oversteekt. Beëindig de lichtprikkel bij het passeren van het halverwege punt. Beschouw het spoor als mislukt als de vis niet binnen 15 s na het starten van de lichtprikkel het halve punt van de doos oversteekt, beëindig de lichtprikkel.OPMERKING: Tijdens deze post-blessuretest wordt geen negatieve schokprikkel toegepast na een mislukte poging. Herhaal stap 2.4.6, met een rustperiode van 30 s tussen de proeven, en noteer het aantal succesvolle onderzoeken (2.4.6.1) en mislukte onderzoeken (2.4.6.2) in 25 onderzoeken. Bereken het procentuele verschil in succesvolle onderzoeken van post-letsel tot de eerste testperiode met de vergelijking:

Representative Results

Het leerparadigma, geschetst in het protocol en schema (Figuur 1), biedt een snelle beoordeling van cognitie met betrekking tot associatief leren. Bovendien heeft dit paradigma een hoge mate van strengheid, door leren te definiëren als een herhaalde en consistente weergave van 5 opeenvolgende positieve onderzoeken. Dit paradigma is ook van toepassing op een reeks leeftijden en verwondingen. Onbeschadigde vissen na 8 maanden (jongvolwassene), 18 maanden (volwassene van middelbare leeftijd) e…

Discussion

Cognitieve stoornissen kunnen de kwaliteit van leven aanzienlijk en negatief beïnvloeden. Vanwege de verhoogde zichtbaarheid en het optreden van hersenschuddingen en traumatisch hersenletsel in de hele bevolking, is het belangrijk om te begrijpen hoe ze cognitieve stoornissen veroorzaken en hoe de schade kan worden geminimaliseerd of omgekeerd. Om deze redenen spelen modelorganismen die kunnen worden getest op cognitieve achteruitgang een cruciale rol in deze studies. Knaagdieren zijn al lang het primaire model om neuro…

Materials

Flashlight	Ultrafire	9145
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Large DNA Gel Box	Fisher Scientific	FB-SB-1316	Shuttle Box
Power Supply	Fisher Scientific	FB-105