Summary
学习和记忆是研究发育、疾病依赖或环境诱发的认知障碍的有力指标。大多数认知评估都需要专门的设备和广泛的时间承诺。然而，穿梭箱检测是一种关联学习工具，利用传统的凝胶盒快速可靠的评估成人斑马鱼认知。
Abstract
认知缺陷，包括学习和记忆受损，是各种发育和年龄相关的神经退行性疾病和创伤性脑损伤（TBI）的主要症状。斑马鱼是一个重要的神经科学模型，由于它们在发育过程中的透明度和神经创伤后强大的再生能力。虽然斑马鱼存在各种认知测试，但大多数认知评估都是快速检查非关联性学习的。同时，关联学习分析通常需要多日或数周。在这里，我们描述了一个快速的关联学习测试，它利用了不利的刺激（电击），并且需要最少的准备时间。这里介绍的穿梭箱检测简单，非常适合新手调查员，并且需要最少的设备。我们证明，在TBI之后，这个穿梭盒测试可以重复评估认知缺陷和从年轻到老斑马鱼的恢复。此外，检测适应性强，可检查即时或延迟内存。我们证明，单个 TBI 和重复的 TBI 事件都会对学习和即时记忆产生负面影响，但不会延迟记忆。因此，我们的结论是，穿梭盒检测可重复跟踪认知障碍的进展和恢复。
Introduction
学习和记忆经常被用作认知障碍的指标，这些障碍是由于衰老、神经退行性疾病或损伤造成的。创伤性脑损伤 （TBIs） 是导致认知缺陷的最常见损伤。TBI越来越受到关注，因为它们与几个神经退行性疾病有关，如前脑痴呆症和帕金森病1，2。此外，在一些TBI患者中观察到的β-淀粉样蛋白聚合增加表明，它可能也与阿尔茨海默病3，4的发展有关。TBI通常是钝力创伤的结果，跨越一系列的分离5，轻度脑损伤（miTBI）是最常见的。然而，miTBI往往没有报告和误诊，因为它们只导致轻微的认知障碍很短的时间，受伤的人通常完全恢复6。相比之下，反复发生的miTBI事件越来越受到关注，因为它在年轻人和中年人中非常普遍，可以随着时间的推移积累7，会损害认知发展，并加剧神经退行性疾病1，2，3，4，5，类似于经历中度或重度TBI8的人。
斑马鱼（Danio rerio）是探索神经科学中各种主题的有用模型，包括在整个中枢神经系统9、10、11、12、13中重建丢失或受损神经元的能力。神经再生也表现在脑脊膜中，它包含在正交内区域的原型。这个神经解剖区域类似于海马，可能是在鱼类和人类14，15，16的短时间记忆的认知所必需的。此外，斑马鱼的行为已被广泛的特点和编目17。学习已经通过各种技术，包括习惯到惊人的反应18，它可以代表一种快速形式的非关联学习时，执行短块和注意快速衰变时间19。更复杂的关联学习测试，如T盒，加迷宫，和视觉歧视20，21使用，但往往很费时，需要几天或几周的准备，并依靠浅滩或积极的强化。在这里，我们描述了一个快速的范式来评估关联学习以及即时或延迟记忆。这种穿梭盒检测使用逆向刺激和负强化调理来评估钝力TBI之后的认知缺陷和恢复。我们证明，未受损的控制成年斑马鱼（8-24个月）可重复学习避免在航天飞机箱中的20个试验（<20分钟的评估）内闯红灯，观察者之间高度一致。此外，使用穿梭盒，我们证明成人（8-24 个月大）的学习和记忆能力是一致的，并且对于在不同的 TBI 分离或重复 TBI 之间具有显著障碍的怀疑认知是有用的。此外，这种方法可以迅速用作衡量标准，以跟踪影响成人斑马鱼认知维持或恢复的药物干预措施的各种疾病进展或疗效。
在这里，我们提供了快速认知评估的教学概述，可以检查复杂的关联学习（第1节）和记忆在即时和延迟记忆方面。此范式提供了对学习的关联认知任务的短期和长期记忆的评估（第 2 节）。
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Protocol
斑马鱼是在弗雷曼生命科学中心的圣母院斑马鱼设施中饲养和饲养的。本手稿中描述的方法已得到圣母院大学动物护理和使用委员会（动物福利保障编号A3093-01）的批准。
1. 穿梭箱学习范式 （图1A）
注：学习范式提供了对关联学习认知的快速评估。
- 通过修改一个 30.5 x 19 x 7.5 厘米的凝胶盒，在两侧以 45° 角添加 5 x 19 厘米的水族级有机玻璃，为穿梭盒做好准备。划一条线，标记鱼缸的中间点，以评估鱼何时越过鱼缸中间（图1B）。
- 在航天飞机箱中加入 800 mL 的系统水。通过在 1 L 的去离子 RO 水中溶解 60 毫克的瞬时海洋来制造此水。将水灌注到水箱中间，深度为 5 厘米。
注：以每小时28°C或测试3条鱼后的淡水代替。 - 将 2-3 条鱼放入装有系统水的储罐中，该储罐位于一个黑暗的房间内，在那里将进行穿梭箱检测。
- 在黑暗的房间里，将1条鱼放在穿梭箱的中心，固定盖子，并将电极连接到电源上。
注意：在适应和测试期间，房间应尽可能保持黑暗。
- 在黑暗的房间里，将1条鱼放在穿梭箱的中心，固定盖子，并将电极连接到电源上。
- 将鱼在穿梭箱中适应15分钟。
注：调查员应在适应期间留在房间，或在测试前有充足的时间安静地返回测试室，以便鱼类适应调查员的存在。当鱼自由探索鱼缸时，可以考虑成功的适应。- 如果鱼不能探索，继续适应15分钟。如果鱼仍然不能适应穿梭箱，将鱼取出。不要用这种鱼来测试。
- 在适应后，手动照射 800 卢门红色镜头手电筒 +2 厘米，从鱼占据的侧面的凝胶盒壁上。
注：如果鱼在铂金线旁边靠在航天飞机箱深端附近的墙上，请不要开始试用。 - 将光线刺激直接照射到鱼身上，并手动跟随鱼的任何横向运动，确保刺激的连续可视化（图1C）。继续提供光刺激，直到满足以下任一条件。
- 如果鱼在 15s 的光照射下穿过水箱的中间点，则考虑路径是否成功。一旦鱼越过中间点，立即停止光刺激（图1D）。
- 如果鱼在 15s 内没有穿过盒子的中间点， 则将小径视为失败。在这种情况下，使用电泳电源应用负冲击刺激（20 mV：1 A）交替 2 s On， 2 s 关闭 15s 期间 （最大 4 冲击）， 或直到鱼通过框的中间点， 此时终止光和负刺激.
- 让鱼休息30s，重复步骤1.5-1.6.2。详细记录成功试验（1.6.1）和失败试验（1.6.2）的顺序。
注：在这里，我们定义学习是完成连续5次成功的试验。一旦学习得到证明，鱼应该从穿梭箱中取出，并人道地安乐死。
2. 记忆范式 （图1A）
注：此范式提供了对学习的关联认知任务的短期和长期记忆的评估。
- 培训期
- 在航天飞机箱中加入 800 mL 的系统水。通过在 1 L 的去离子 RO 水中溶解 60 毫克的瞬时海洋来制造此水。将水灌注到水箱中间，深度为 5 厘米。
注：水应更换为淡水系统水在28°C每小时或测试3条鱼后。 - 将 2-3 条鱼放入包含系统水的储罐中，该储罐位于一个黑暗的房间内，在那里将进行穿梭箱检测。
- 在黑暗的房间里，将1条鱼放在穿梭箱的中心，固定盖子，并将电极连接到电源上。
注意：在适应和测试期间，房间应尽可能保持黑暗。 - 在航天飞机箱中适应鱼15分钟。
注：调查员应在适应期间留在房间，或在测试前有充足的时间安静地返回测试室，以便鱼适应调查员的存在。当鱼自由探索鱼缸时，确定成功的适应。 - 如果鱼不能探索，继续适应15分钟。如果鱼仍然不能适应穿梭箱，请取出鱼，不要将其用于测试。
- 成功适应后，手动照射一个800卢门的红色镜头手电筒+2厘米的凝胶盒侧壁，在被鱼占据的穿梭盒的一侧。
- 将光线刺激直接照射到鱼身上，并跟随鱼的任何横向运动，确保鱼的刺激持续可视化。
- 当光线照耀在鱼身上时，同时应用不利的冲击刺激（20 mV：1 A）交替2 s On，2 s 关闭15s（最大4次冲击），或直到鱼通过盒子的中间点。一旦实现这一点，终止光和不利的刺激。
注：让鱼休息30s，然后重复步骤2.1.6-2.1.8为25次迭代（图1A）。
- 在航天飞机箱中加入 800 mL 的系统水。通过在 1 L 的去离子 RO 水中溶解 60 毫克的瞬时海洋来制造此水。将水灌注到水箱中间，深度为 5 厘米。
- 初始测试
- 训练期结束后，让鱼休息15分钟。不要从航天飞机箱中取出它们。在此休息期之后，通过将每个试用记录为严格通过/失败来测试初始内存保留。
- 仅应用 15s 的光刺激，并记录以下响应。
- 如果鱼在启动光刺激后在 15s 内穿过穿梭箱的中间点，则考虑试验是否成功。当鱼穿过中间点时，立即停止光线刺激。
- 如果鱼在启动光刺激后没有穿过穿梭箱 15s 的中间点，则将试验视为失败。15 岁以后停止光刺激。
注：在初始测试期间，尝试失败后不应用不利刺激。
- 重复步骤 2.2.2，在试验之间有 30 的休息时间，并在 25 次试验中记录成功的试验 （2.2.2.1） 和失败试验 （2.2.2.2）。此值将作为每条鱼的单独参考。
- 即时内存
- 通过首选损伤范式（例如，使用改良的 Marmarou 重量下降的钝力创伤）在初始测试期后立即诱导损伤） 。房子鱼单独为一个简单的识别。记录其初始测试值，并将鱼送回动物设施。
注：鱼被钝力TBI打伤，如前所述22。 - 在动物设施进行初始测试和/或受伤后 4 小时（或在相关实验时间范围内）收集 2-3 条未损坏或 TBI 鱼 4 小时。将所有鱼放在暗室中，放入含有系统水的单独水箱中。
- 将鱼放在穿梭箱的中心（用系统水（如1.1中所述）准备），一次放一条鱼，并固定盖子。连接电源，让鱼适应15分钟。
- 适应后，仅应用 15s 的光刺激来评估即时记忆（严格通过/失败），并记录以下响应。
- 如果鱼在 15s 测试期内越过盒子的中间点，则考虑试验是否成功。在越过中间点时终止光刺激。
- 如果鱼在启动光刺激后 15s 内没有穿过盒子的中间点，则将试验视为失败。15s 期结束后终止光刺激。
注：在此次受伤后测试中，在尝试失败后不应用不利的冲击刺激。
- 重复步骤 2.3.4，在试验之间有 30 的休息时间，并记录 25 次试验中成功的试验次数（2.3.4.1）和未通过的试验（2.3.4.2）。
- 使用方程计算受伤后与初始测试期的成功试验的百分比差异：
- 通过首选损伤范式（例如，使用改良的 Marmarou 重量下降的钝力创伤）在初始测试期后立即诱导损伤） 。房子鱼单独为一个简单的识别。记录其初始测试值，并将鱼送回动物设施。
- 延迟内存
- 将鱼送回动物设施，单独安置，以便于识别和记录其初始测试值，并在初始测试期后立即返回动物设施。
- 在初始测试和损伤和/或延迟记忆测试之间允许鱼 4 天（或相关实验时间框架）。
- 诱导损伤的首选伤害范式（如修改后的马尔马鲁体重下降，以诱导钝力创伤）。家养鱼单独为方便识别初始测试值，并返回鱼到动物设施。
注：鱼被钝力TBI打伤，如前所述22。 - 在动物设施进行初始测试和/或受伤后 4 小时（或在相关实验时间范围内）收集 2-3 条未损坏或 TBI 鱼 4 小时。
- 将所有鱼放在装有系统水的单独水箱的暗室中，并一次放置一个在穿梭箱的中心（用系统水（如 1.1 中所述）准备），固定盖子，连接电源，让鱼 15 分钟适应。
- 适应后，仅应用 15s 的光刺激来评估即时记忆（严格通过/失败），并记录以下响应：
- 如果鱼在 15s 测试期内穿过盒子的中间点，请考虑路径是否成功。在越过中间点时终止光刺激。
- 如果鱼在启动光刺激后 15 s 内没有穿过盒子的中间点，则将路径视为失败，终止光刺激。
注：在此次受伤后测试中，在尝试失败后不应用不利的冲击刺激。
- 重复步骤 2.4.6，在试验之间有 30 的休息时间，并记录 25 次试验中成功的试验次数（2.4.6.1）和失败试验（2.4.6.2）。
- 用方程计算受伤后试验成功与初始测试期的百分比差异：
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Representative Results
协议和示意图（图1）中概述的学习范式，对关联学习的认识进行了快速评估。此外，这种模式具有高度的严格性，将学习定义为连续 5 次积极试验的重复和一致显示。此范式也适用于各种年龄和伤害。8个月（年轻成人）、18个月（中年成人）和24个月（成年）未损坏鱼类需要类似数量的试验，以了解避免红灯的行为（未损坏8米：15.28±4.92试验， 18 米： 17.66 ± 5.5 试验， 24 米： 16.2 ± 4.79 试验， 8 米对 18 米 p=0.92， 8 米对 24 米 p=0.98， 18 米对 24 米 p=0.97，图 2A）。我们还利用了严重的钝力创伤性脑损伤（sTBI）模型22，并观察到不同年龄的鱼需要类似的试验次数，以掌握在受伤后1-5天的检测（dpi： 8 米 vs 18 米， p=0.09， 8 米 vs 24 米， p=0.96， 18 米 vs 24 米， p=0.12，图 2A）.在STBI之后的第一天，所有年龄（8、18和24米）的鱼需要同样数量的试验来学习这种行为（8米：73.3±9.45次试验， 18 米： 79.33 ± 6.35 试验， 24 米： 68.25 ± 6.65 试验， 8 米对 18 米 p =0.71， 8 米对 24 米 p=0.76， 18 米 vs. 24 m=0.28， 图2A）它们都明显大于未损坏的控件（p<0.01）。总的来说，这些数据表明，穿梭箱可以用来检查不同年龄段的损伤引起的认知缺陷，并表明成年斑马鱼可以在钝力损伤后恢复认知能力。
由于重复的 miTBI 事件会日益损害认知功能，我们使用穿梭盒检测作为指标，使用重复的 TBI 跟踪剂量依赖进展。我们使用此检测来评估在 miTBI 钝力损伤22 之后的学习情况，该损伤每天重复不同时间长度。如前所述，未受损的鱼迅速掌握了航天飞机箱，在16.4±3.5次试验中连续5次获得阳性试验（图2B）。单次miTBI之后的一天，鱼显示学习行为的试验次数显著增加（40.25±12.65次试验，第<0.05页， 图2B）。在 2 miTBI 事件（48 ± 14.9 试验）后，这一赤字增加，并在 3 miTBI 受伤后进一步增加（56.63 ± 12.75 试验， 图 2B）。此外，我们观察到，在受到单数损伤和3次损伤（p<0.05）的miTBI鱼之间的认知障碍显著增加。
我们还检查了在反复使用协议进行即时和延迟记忆范式（图 1A）后记忆受到的影响。天真无损的鱼被给予训练期和初步测试期，之后部分鱼受伤，立即记忆，其他人被送回鱼设施4天，以获得延迟记忆（图2C）。与初始测试期相比，未受损鱼类在即时记忆中成功试验的百分比（6.22%±4.7%）和延迟记忆（6.13%±5.57%）的差异略有增加。然后，我们检查了多个钝力TBI事件对记忆的影响。在即时记忆中观察到 miTBI 之后的显著缺陷，但在延迟记忆中未观察到显著缺陷。单次miTBI之后，鱼表现出明显的即时记忆缺陷（-26.77%±8.93%），而未受损的鱼（p<0.0001， 图2C）。这一趋势继续与反复伤害后，赤字增加后，2倍miTBI（-37.42%±10.01%）和3倍miTBI（-39.71%±11.39%）。此外，我们观察到用单一 （1 倍） miTBI 治疗的鱼和 3 倍 miTBI （p <0.05， 图 2C）治疗的鱼之间的剂量效应相似。这些数据表明，随着受伤人数的增加，miTBI鱼的学习和记忆力会降低，赤字显著增加，上面描述的穿梭箱检测和协议足够敏感，足以检测这些差异。
图1：航天飞机箱检测。 （A） 认知评估的学习和记忆范式的教学概述。（B） 航天飞机箱检测转换的大型DNA凝胶盒的示意图。（C，D）试验期间刺激应用的图形表示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：斑马鱼在钝力TBI之后表现出认知缺陷。（A）在STBI之后，8、18和24个月大的斑马鱼表现出不同年龄组之间的学习缺陷。与年龄匹配的对照组相比，学习航天飞机箱范式的试验次数显著增加，观察到 1 dpi 返回未损坏的水平 4-5 dpi。（B，C）重复的mitBI鱼显示学习（B） 和记忆（C） 赤字在剂量依赖的方式。SEM 的平均值±绘制在A和B中，而平均±标准偏差绘制在C中。所有三个图形上的每个数据点都表示一只成年斑马鱼。统计分析是通过单向或双向 ANOVA 进行，然后是 Tukey 后临时测试。# p<0.05 ， # <0.01 。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
认知障碍会对生活质量产生显著和负面影响。由于整个人群的能见度和脑震荡和创伤性脑损伤的发生增加，了解它们如何导致认知障碍以及如何将损害降到最低或逆转非常重要。由于这些原因，可以测试认知衰退的模型生物在这些研究中起着至关重要的作用。长期以来，啮齿动物一直是研究神经行为和认知的主要模型，然而，斑马鱼已成为一个有用的模型，具有许多不同的行为，以调查一系列发育，年龄相关，并获得认知缺陷17，20，23，24，25，26。从习惯形式的一维学习，到复杂的学习和空间记忆、新颖的对象和位置识别，以及决策18、19、20、21、27、28等，都采用了各种评估认知的方法。但是，这些认知测试仅限于测试非关联认知，或需要复杂的设置、设备的财务投资或在测试之前进行大量时间承诺。相比之下，这里描述的穿梭盒和学习和记忆范式采用了复杂的关联式学习测定，这种分析具有成本效益，评估迅速，并且很容易被新手调查员采用。最重要的是，与其他认知测试一致，我们的检测表明，未受损的鱼可以快速学习关联任务，并可以记忆任务几天后没有间歇性训练29。
检测的适应性为研究各种学习和记忆时间点作为疾病进展或机械干预的指标提供了途径。检测有两个主要特征。首先，方法很简单。检测工作迅速建立起来，对成功和失败的试验有明确和明确的终点，使一系列调查人员能够查阅。我们发现，由于这种检测的简单性，成功使用航天飞机箱所需的故障排除很少。其次，与其他认知测试相比，检测速度非常快，后者提供了灵活性或在一天中快速检查大量鱼类的能力。评估学习的时间至少为19.75分钟（图1），鱼需要15分钟才能适应穿梭箱（由坦克探索决定），然后是单次试验失败（15次轻刺激，15次厌恶刺激，30秒试验之间），以及5次直接和连续的阳性试验（<15次轻刺激）。在实践中，我们观察到未损坏的鱼需要6-30次试验（19.75分钟-43.75分钟），而在极端情况下（在严重的钝力创伤之后），最严重的缺陷可能需要100次试验（113.75分钟）。记忆研究也迅速进行。根据协议大纲，适应、训练和初始测试所需的最短时间为 67.5 分钟（15 分钟适应，15 秒的光和冲击迭代，试验之间的休息时间为 30 秒，在没有不良刺激的情况下重复进行初始测试）。虽然重新测试即时或延迟记忆只需要 33.75 分钟（15 分钟适应，25 次仅轻刺激 15 秒，30 次在试验之间休息），无论受伤、治疗或认知缺陷如何。
在评估神经行为时，各种范式利用积极或不利的刺激。食物或社交互动形式的积极刺激，通常用于经典的T盒迷宫，可以帮助对学习任务做出强烈反应。然而，利用积极关联的检测是以牺牲时间为代价的。相比之下，虽然对不利刺激的调理提供了快速的关联和强烈的行为反应，但它却以牺牲不利的刺激为代价。未受损的鱼经常快速学习穿梭箱检测，因此受到的冲击最少，因此似乎没有不良事件。然而，神经受损的鱼（TBI），具有严重的认知缺陷，需要大量的试验和电击。观察到这些多重冲击偶尔会导致补品克隆发作。任何在穿梭箱内出现补品克隆发作的鱼类应立即被移除，并按道德安乐死。安乐死鱼的所有试验，包括癫痫发作事件，应排除在任何统计分析中。此外，值得注意的是，对神经损伤的受试者的电击可能会造成受损鱼类之间的意外差异，而这种差异是和不是由穿梭箱造成的。因此，我们建议所有接受神经行为评估的鱼类不应用于任何其他定量指标（血清生物标志物、IHC 等）。同样重要的是要明白，这种学习方法是基于视觉刺激，不适合可能损害视觉电路的损伤，因为它会混淆结果。
我们的结果表明，在钝力TBI之后，斑马鱼表现出快速的认知缺陷，导致更多的试验，以掌握航天飞机箱测定中的关联任务。类似的即时赤字在TBI的啮齿动物模型中也可以看到，然而这些赤字可以减少，它们往往持续存在，并且仍然显著30。相比之下，斑马鱼在受伤后7天内表现出认知恢复。成年斑马鱼的再生能力有据可查，有据可查，9、10、11、12、13、14、15，在脑电图31、32的心室/下静脉区有已知的神经源利基。在 TBI 之后的测定中观察到的认知恢复提供了对所需检查的洞察，以确定这些神经源利基是否受到刺激，并在组织和认知恢复中发挥作用。
最后，穿梭箱提供了对关联学习和记忆认知的快速评估。检测使用最小和修道院设备，技术上很简单。未来的应用可用于评估基因和药理干预神经侮辱鱼的神经保护，以及其他伤害范式或神经退行模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢海德实验室成员的深思熟虑的讨论和弗雷曼生命科学中心斑马鱼护理和饲养的技术人员。这项工作得到了圣母大学斑马鱼研究中心、圣母大学干细胞和再生医学中心以及国家眼科研究所NIH R01-EY018417（DRH）、国家科学基金会研究生研究奖学金计划（JTH）、圣母大学LTC尼尔·海兰研究金（JTH） 的资助。 自由奖学金（JTH）和帕特·蒂尔曼奖学金（JTH）的哨兵。图1用 BioRender.com 制作的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
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