Summary
Er wordt een protocol verstrekt voor het opzetten van een standaard confocale laserscanmicroscoop voor in vivo Förster resonantie energieoverdrachtsmetingen, gevolgd door gegevensevaluatie.
Abstract
Gesensibiliseerde emissie-gebaseerde Förster resonantie energieoverdracht (FRET) experimenten zijn eenvoudig uit te voeren, maar zijn afhankelijk van de microscopische opstelling. Confocale laserscanmicroscopen zijn een werkpaard geworden voor biologen. Commerciële systemen bieden een hoge flexibiliteit in laservermogensaanpassing en detectorgevoeligheid en combineren vaak verschillende detectoren om het perfecte beeld te verkrijgen. Het vergelijken van op intensiteit gebaseerde gegevens van verschillende experimenten en opstellingen is echter vaak onmogelijk vanwege deze flexibiliteit. Bioloogvriendelijke procedures zijn van voordeel en maken een eenvoudige en betrouwbare aanpassing van laser- en detectorinstellingen mogelijk.
Aangezien FRET-experimenten in levende cellen worden beïnvloed door de variabiliteit in eiwitexpressie en donor-acceptorverhoudingen, moeten eiwitexpressieniveaus bovendien in aanmerking worden genomen voor gegevensevaluatie. Hier wordt een eenvoudig protocol beschreven voor betrouwbare en reproduceerbare FRET-metingen, inclusief routines voor de schatting van eiwitexpressie en aanpassing van laserintensiteit en detectorinstellingen. Gegevensevaluatie zal worden uitgevoerd door kalibratie met een fluorofoorfusie van bekende FRET-efficiëntie. Om de eenvoud te verbeteren, zijn correctiefactoren vergeleken die zijn verkregen in cellen en door recombinante fluorescerende eiwitten te meten.
Introduction
Förster resonantie energieoverdracht ((F)RET) wordt meestal waargenomen door fluorescentiespectroscopie, hoewel het proces zelf niet beperkt is tot het optreden tussen fluoroforen. De onderliggende dipool-dipoolkoppeling vereist eenvoudigweg een lichtuitstralend donormolecuul en een lichtabsorberende acceptor. Dit is afgeleid van de vereiste spectrale overlap integraal J van de genormaliseerde donoremissie en acceptorabsorptiespectra1. Omdat RET echter concurreert met fluorescentie, wordt de energieoverdracht meetbaar door veranderingen in fluorescentie-emissie: RET induceert donorblussing en gesensibiliseerde acceptoremissie.
Fluorofoor-gebaseerde RET is fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) genoemd om het te scheiden van bioluminescentieresonantie-energieoverdracht (BRET). RET is sterk afhankelijk van de afstand tussen donor en acceptor, die breed in het bereik van 0,5-10 nm2 ligt en dus in hetzelfde bereik als de afmetingen van eiwitten en hun complexen. Ten tweede is RET afhankelijk van de dipool-dipool oriëntatie kappa in het kwadraat. Gecombineerd met het feit dat rotatievrijheid van eiwitgebonden fluoroforen kan worden verwaarloosd vanwege het molecuulgewicht en de langzame rotatierelaxatie, maakt RET de analyse van conformatieveranderingen mogelijk3.
De zogenaamde Förster-straal is gebaseerd op de spectrale overlapintegraal en het golflengtebereik van de overlap, zodat rood lichtabsorberende chromoforen resulteren in langere Förster-stralen dan blauw lichtabsorberende kleurstoffen. Omdat het dynamisch bereik van FRET-metingen beperkt is door 0,5 × R0 en 1,5 × R0, heeft het FRET-paar ECFP-EYFP een dynamisch bereik van 2,5-7,3 nm vanwege zijn R0 van 4,9 nm4.
De helderheid van een fluorofoor wordt bepaald door het product van zijn molaire extinctiecoëfficiënt en zijn kwantumopbrengst. Voor FRET-metingen is het voordelig om fluoroforen van bijna vergelijkbare helderheid te kiezen. Dit verbetert de detectie van donor quenching en gesensibiliseerde acceptor emissie. Het bevordert ook de kalibratie van het microscopiesysteem. Kijkend naar de veelgebruikte FRET-paren van cyaan en fluorescerende eiwitten, wordt de lagere helderheid van de cyaan fluorescerende eiwitten duidelijk (figuur 1A).
De levensduur van de acceptor moet echter lager zijn dan de levensduur van de donor, waardoor de beschikbaarheid van de acceptor voor energieoverdracht wordt gewaarborgd. Als de levensduur van de acceptor de levensduur van de donor overschrijdt, kan de acceptor zich nog steeds in de aangeslagen toestand bevinden wanneer de donor weer opgewonden is. Geavanceerde cyaan fluorescerende eiwitten zoals mTurquoise vertonen een langere levensduur en dragen zo bij aan een verhoogde kans op FRET (Figuur1B). De kans op FRET hangt ook af van de molaire extinctiecoëfficiënt van de acceptor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Voor het volgende protocol werd voorbijgaande transfectie van protoplasten uitgevoerd, zoals eerder beschreven12. Hieronder volgt een korte beschrijving.
1. Voorbijgaande transfectie van protoplasten
- Snijd ~4 g gezonde bladeren van Arabidopsis thaliana ecotype Columbia in plakjes van 1 mm en breng ze over in 20 ml enzymoplossing (1,5% cellulase; 0,4% macerozym; 0,1% runderserumalbuminefractie V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur (MES), pH 5,7; 10 mM CaCl2).
- Vacuüm-infiltreer de bladschijfjes gevolgd door een incubatie met agitatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Oogst de cellen door centrifugeren gedurende 3 minuten bij 100 × g.
- Was de protoplasten met W5-oplossing (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5,7) en resuspend ze in MMG-oplossing (0,4 M mannitol; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5,7).
- Voer de transfectie uit in een 8-well slide door osmotische shock in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG) 4000. Meng 20 μL van de protoplastsuspensie met 5 μL plasmide-DNA (5 μg/μL) en 25 μL PEG-oplossing (0,2 M mannitol, 0,1 M CaCl2, 40% PEG 4000).
- Keer de osmotische schok om door de osmotische omstandigheden voorzichtig aan te passen.
OPMERKING: Naast het monster van belang, is de expressie van donor alleen en acceptor alleen vereist om de spectrale doorbloeding van respectievelijk de donor en de acceptor te bepalen. Voor kalibratiedoeleinden moet ook een fusie-eiwit van de donor en de acceptor tot expressie worden gebracht. De fluorescerende eiwitexpressie stond onder controle van een bloemkoolmozaïekvirus 35S-promotor (pCaMV35S). Voor alle metingen werden twee confocale laserscanmicroscopen (LSM1 en LSM2) gebruikt. LSM1 heeft twee soorten detectoren: voor FRET-metingen werd het donorsignaal gedetecteerd door een GaAsP-detector, terwijl FRET- en acceptoremissies werden geregistreerd met een fotomultiplicator. LSM2 heeft twee fotomultipliers, die werden gebruikt voor de detectie van donor-, FRET- en acceptoremissie.
2. Laser-aanpassing
OPMERKING: Hier zijn 458 nm en 514 nm lijnen van een argon-ion laser toegepast voor FRET-analyse tussen enhanced cyan fluorescent protein (ECFP)- en enhanced yellow fluorescent protein (EYFP)-gelabelde eiwitten. Voor reproduceerbare data-acquisitie werden beide lijnen aangepast aan een vergelijkbare intensiteit. Dit werd bereikt door een transmissiefotomultiplicator of de reflectiemodus.
- Laseraanpassing met een transmissiefotomultiplicator
- Gebruik een lege put voor aanpassing.
- Kies de lijnscanmodus en de histogramweergave.
- Verlaag de laserintensiteit tot het minimum en pas de detectorversterking aan op detecteerbare achtergrondruis.
- Verhoog de laserintensiteit in stappen van 0,5% en neem het bijbehorende signaal op.
- Pas de routine toe voor beide laserlijnen.
- Laseraanpassing met reflectiemodus
- Gebruik een lege put voor aanpassing.
- Pas een reflectiefilter toe, schakel de reflectiemodus in, indien beschikbaar.
- Zorg ervoor dat het golflengtebereik van de detector de golflengte van de laser bedekt.
- Kies de lijnscanmodus en de histogramweergave.
- Verlaag de laserintensiteit tot het minimum en pas de detectorversterking aan op detecteerbare achtergrondruis.
- Verplaats het doel naar de laagste positie.
- Beweeg het doel omhoog totdat de weerspiegeling van de coverslip zichtbaar is.
- Verhoog de laserintensiteit in stappen van 0,5% en neem het bijbehorende signaal op.
- Pas de routine toe voor beide laserlijnen.
- Evaluatie van gegevens
- Tabelleer de gegevens en sorteer de gegevens op signaalintensiteiten.
- Zet de signaalintensiteiten uit tegen het relatieve laservermogen.
- Kies laserintensiteiten die resulteren in een vergelijkbare signaalintensiteit.
3. Aanpassing van fotomultipliers
OPMERKING: Na laseraanpassing werden de fotomultipliers aangepast aan individuele winsten om een vergelijkbare gevoeligheid te verkrijgen. Deze kalibratie werd uitgevoerd met de 514 nm laserlijn, die zich in het midden van het golflengtebereik bevindt.
- Gebruik een lege put voor aanpassing.
- Pas een reflectiefilter toe en schakel over naar de reflectiemodus, indien beschikbaar.
- Zorg ervoor dat het golflengtebereik van de detector de golflengte van de laser (514 nm) bedekt.
- Kies de lijnscanmodus en de histogramweergave.
- Verlaag de detectorversterking tot de helft van het maximum en pas de laserintensiteit aan op detecteerbare achtergrondruis.
- Verplaats het doel naar de laagste positie.
- Beweeg het doel omhoog totdat de weerspiegeling van de coverslip zichtbaar is.
- Verhoog de detectorversterking in stappen van 50 tot 100 V en neem het bijbehorende signaal op.
- Pas stap 3.1 tot en met 3.8 toe voor beide detectoren.
- Evaluatie van gegevens
- Zet de intensiteit uit tegen de detectorversterking voor elke detector.
- Kies de individuele detectorwinsten om een vergelijkbare gevoeligheid te verkrijgen.
4. FRET-beeldverwerving
OPMERKING: Begin met het voorbeeld van interesse voor het instellen van beeldacquisitie.
- Kies de juiste filters/dichroïsche spiegels, bijvoorbeeld een dubbele dichroïsche spiegel MBS 458/514 voor het FRET-paar ECFP/EYFP. Gebruik dezelfde dichroïsche spiegel voor alle kanalen om lijn-voor-regel scannen mogelijk te maken. Selecteer een onderdompelingsdoel voor de beeldvorming van levende cellen. Kies 12-bits of 16-bits scannen en een gemiddelde scansnelheid.
- Definieer het detectiebereik, bij voorkeur 470-510 nm voor donordetectie en 530-600 nm voor acceptor/FRET-detectie in het geval van ECFP/EYFP. Gebruik bij gebruik van een diodelaser van 445 nm of 440 nm 450 tot 510 nm als detectiebereik. In het geval van een acousto-optische bundelsplitser (AOBS), definieer donordetectie in het bereik van 450 tot 500 nm om ongewenste acceptordetectie te voorkomen.
- Pas de detectorinstelling toe volgens 3.10.2.
- Breng de laserinstelling aan volgens punt 2.3.2. Herzie de laserintensiteit indien nodig op basis van de verkregen laservermogenstabel. Zorg ervoor dat de signaal-ruisverhouding het volledige dynamische bereik van de detectoren bestrijkt (intensiteit variërend van 0 tot 4095 voor 12-bits scannen).
- Houd de laserintensiteiten en de detectorwinsten constant. Gebruik de diameter van het gaatje voor fijnafstelling.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat veranderingen in de diameter van het gaatje van invloed zijn op de ruimtelijke resolutie. - Voer de metingen uit (maak foto's van ten minste 20 cellen).
5. Bepaling van kruisverwijzingscorrecties
OPMERKING: Cellen die alleen de donor of de acceptor tot expressie brengen, zijn nodig om respectievelijk donorspectraal bloeddoorbloeding (DSBT) en acceptorspectrale bloedingsdoorvoer (ASBT) te bepalen. Houd dezelfde instellingen als beschreven in sectie 4.
- Voer FRET-metingen uit met cellen die de donorfluoofoor tot expressie brengen.
- Voer FRET-metingen uit met cellen die de acceptorfluoofoor tot expressie brengen.
6. Kalibratie van de metingen volgens Beemiller et al.13
OPMERKING: Cellen die een donor-acceptorfusie van bekende FRET-efficiëntie tot expressie brengen, zijn vereist. Hier is een ECFP-5 aa-EYFP-fusie met een FRET-efficiëntie van 0,46 gebruikt4. Houd dezelfde instellingen als beschreven in sectie 4.
- Voer FRET-metingen uit met cellen die de donor-acceptorfusie tot expressie brengen
7. Gegevensevaluatie
- Verkrijg lijnprofielen van de cellen en zorg ervoor dat elk profiel niet meer dan één cel bevat. Sla de profielen op als tekstbestanden.
- Importeer de tekstbestanden in een spreadsheet met de optie voor het importeren van tekstbestanden in de sectie Gegevens .
- Lees de maximale waarden uit door de functie Max toe te passen.
- Vermeld de verkregen waarden in een tabel, heb elk een kolom voor donoremissie-ID, FRET-emissie-IF, acceptoremissie-IA en ten minste vier datasets: donor only, acceptor only, donor-acceptor fusion en measurement.
OPMERKING: Excitatie van de donor resulteert ook in directe excitatie van de acceptor en veroorzaakt ASBT die wordt beschreven door de α waarde. - Bereken de ASBT-α waarden met de dataset met alleen acceptor met behulp van vergelijking (1).
(1)
OPMERKING: Gebruik de mediaan van alle α-waarden in de volgende vergelijkingen. De donor vertoont een breed emissiespectrum dat resulteert in emissiekruisspraak met de gesensibiliseerde emissie van de acceptor. Deze DSBT wordt gegeven door de β waarde. - Bereken de spectrale doorbloeding β swaarden van de donor met behulp van de donordataset met behulp van vergelijking (2).
(2)
OPMERKING: Gebruik de mediaan van alle β waarden in de volgende vergelijkingen. De kalibratiefactor ξ beschrijft de lineaire relatie van fret-afgeleide donor quenching en gesensibiliseerde emissie van de acceptor. Gebruik de medianen van 7,5 en 7,6 in de volgende vergelijkingen. - Bereken de kalibratiefactoren ξ met de donor-acceptorfusiedataset en de FRET-efficiëntie E (0,46) met behulp van vergelijking (3).
(3)
OPMERKING: Gebruik de mediaan van alle ξ-waarden in de volgende vergelijkingen. - Bereken de FRET-efficiëntie van het eiwitpaar met behulp van vergelijkingen (4) en (5).
(4)
(5) - Schat de effecten van expressiesterkte en/of donor-acceptorratio: zet de som van ID, IF en IA uit tegen de FRET-efficiëntie. Voer een lineaire regressie uit; merk op dat hoe steiler de grafiek en hoe hoger R2 is, hoe hoger de impact van het expressieniveau is of hoe groter het verschil in donor- en acceptor abundantie.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aanpassing van de confocale laserscanmicroscoop
De laseraanpassing toonde een lineaire toename van de emissie met toenemende laserintensiteit (figuur 2 en tabel 1). Zoals verwacht voor argon-ionlasers was de emissie van de 514 nm-lijn veel hoger dan de emissie van de 458 nm-lijn, zoals blijkt uit een steilere helling. Voor latere experimenten werd gekozen voor respectievelijk de 514 nm-lijn en de 458 nm-lijn een laservermogen van 4,5% en 6,5%. Dit resulteerde in een vrijwel gelijke emissie-intensiteit van 1123 (514 nm) en 1141 (458 nm).
Het variëren van de detectorwinsten bij constant laservermogen onthulde een exponentieel gedrag voor beide geanalyseerde detectoren. Vergelijkbare emissie-intensiteiten werden verkregen voor een winst van 700 V (figuur 3). Hoewel de aanpassing van laserlijnen profiteerde van het lineaire gedrag, wordt de aanpassing van de detectoren waarschijnlijk beïnvloed door het exponentiële gedrag, wat resulteert in duidelijke verschillen met kleine veranderingen in de versterking bij hogere spanningen. Helaas is dit hogere bereik van belang voor metingen in levende cellen, omdat het verhogen van het laservermogen cytotoxisch is en fotobleaching bevordert.
Spectrale doorbloeding bepalen
In eerste instantie werden de spectrale doorbloeding van de donor en de acceptor geanalyseerd met recombinant gezuiverde ECFP en EYFP; DSBT β = 0,498 en ASBT α = 0,100. Hetzelfde werd gedaan met cellen die ECFP of EYFP tot expressie brachten. Met LSM 2 was de geschatte DSBT β = 1,602 ± 0,207 (gemiddelde ± SD) en ASBT was α = 0,119 ± 0,018. De mediane waarden waren β = 1,506 en α = 0,120. Deze discrepantie tussen de gegevens verkregen in levende cellen en de gegevens verkregen met recombinant eiwit toont aan dat het onmogelijk is om de bepaling van spectrale doorbloeding in levende cellen weg te laten. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door cellulaire pigmenten.
De beelden tonen de hogere helderheid van EYFP in vergelijking met ECFP (figuur 4 en tabel 2). Het compenseren van de verschillen in helderheid door verschillende laserinstellingen verbetert het dynamisch bereik van de donor en het FRET-kanaal. Het leveren van de relatieve output door het meten van de laserintensiteiten, zoals gedaan voor de aanpassing, verhoogt nog steeds de reproduceerbaarheid van de metingen.
Voor LSM 1 β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 met medianen van α = 0,084 en β = 0,180. De bepaling van de ASBT is afhankelijk van de laseraanpassing en een enkele detector, en dus presteert de bepaling van ASBT goed. De DBST omvat twee detectoren, wat resulteert in enorm verschillende resultaten voor beide microscopen. Er moet aan worden herinnerd dat LSM 2 is uitgerust met twee fotomultipliers, terwijl LSM 1 een GaAsP-detector en een fotomultiplicator gebruikt, twee verschillende soorten detectoren met verschillende spectrale eigenschappen en gevoeligheid. Dienovereenkomstig werkt de aanpassing beter met twee identieke detectoren.
Kalibratie van de meting
Voor kalibratie werden de mediaanwaarden van α en β toegepast en werd een fusie van ECFP en EYFP gebruikt als de standaard voor bekende FRET-efficiëntie (E = 0,46). De kalibratie van recombinant en gezuiverd ECFP-EYFP resulteerde in een ξ-waarde van 13,44, terwijl de in vivo metingen een ξ-waarde van 1,525 ± 1,844 aan het licht brachten. De mediaan was 0,798, wat extreme uitschieters samen met de hoge standaarddeviatie aan het licht bracht. Voor LSM 1 waren de waarden ξ = 1,978 ± 0,807 met een mediaan van ξ = 1,883. Voor LSM 2 en LSM 1 waren de datasets verkregen voor de berekening van ξ (tabel 3) statistisch identiek, zoals bewezen door de t-test van Student (p > 0,2).
FRET meting
Als proof of concept werd de FRET-meting herhaald met de donor-acceptor fusie. De gemeten FRET-efficiëntie was 0,47 ± 0,07 voor het gezuiverde eiwit en 0,47 ± 0,06 in levende cellen met LSM 2 (tabel 4). De mediaan van de metingen in levende cellen was E = 0,45. Voor LSM 1 was de FRET-efficiëntie 0,46 ± 0,09 met een mediaan van E = 0,45 (tabel 4). Deze gegevens tonen de effectieve kalibratie aan met een FRET-constructie van bekende FRET-efficiëntie.
Effecten van expressieniveau en donor-acceptorratio
Voor de geanalyseerde dataset werden de FRET-efficiënties niet beïnvloed door het expressieniveau. Door de fusie van de donor en de acceptor was de verhouding ook constant. De opname van eerdere datasets onthulde in één geval een afhankelijkheid van het expressieniveau (figuur 5). De FRET-efficiëntie tussen de gelabelde vacuolaire ATPase (V-ATPase) subeenheden, VHA-A-ECFP en VHA-a-EYFP, nam af met toenemende signaalintensiteit. Daarentegen was de interactie tussen VHA-E1-ECFP en VHA-C-EYFP onafhankelijk van de signaalintensiteit. In het geval van VHA-A en VHA-a worden de drie exemplaren van VHA-A steeds vaker vervangen door VHA-A-ECFP, wat resulteert in een donoroverschot in vergelijking met het enkele exemplaar van VHA-a in het complex. Hoewel VHA-E1 aanwezig kan zijn in de vorm van drie exemplaren, zou de hoge oplosbaarheid van VHA-C dit effect in dit voorbeeld kunnen opheffen. Hier zijn de FRET-efficiënties relatief laag geweest. Deze eenvoudige aanpak maakt het mogelijk om expressie- en ratio-artefacten te testen.
Figuur 1: Overzicht van fluorescerende eiwit FRET-paren met cyaan-emitterende donoren. (A) De Förster-stralen van de paren en de helderheid van donor en acceptor worden gegeven voor goed gekarakteriseerde FRET-paren. (B) Vergelijking van het leven van donor en acceptor. Grijze sterretjes duiden op een multiexponentiaal verval. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; CFP = cyaan fluorescerend eiwit; GFP = groen fluorescerend eiwit; YFP = geel fluorescerend eiwit; mX = monomeer X; EX = verbeterde X; SX = super X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Laseraanpassing. De emissie van de lasers werd geregistreerd door de reflectie van de coverslip en uitgezet tegen de relatieve laserintensiteit zoals gemoduleerd door het acousto-optische afstembare filter van de LSM. Emissie van de 458 nm-lijn (A) en de 514 nm-lijn (B) van een argon-ionlaser wordt getoond. Afkortingen: LSM = laser scanning microscope; r.u. = relatieve eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Detectorwinst en emissie-intensiteit. De resulterende emissie-intensiteiten werden geregistreerd in de reflectiemodus voor detectorwinsten variërend van 300 tot 750 V en 300 tot 750 V voor respectievelijk detector 1 (A) en detector 2 (B). Afkorting = r.u. = relatieve eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Spectrale doorbloeding. Beelden werden verkregen in de donor, de FRET en de acceptorkanalen. (A) Afbeeldingen verkregen met gezuiverde fluorescerende eiwitten; schaalstaven = 100 μm; B) overeenkomstige afbeeldingen voor cellen die de fluorescerende eiwitten tot expressie brengen; schaalstaven = 10 μm. (C) Grafieken van de verkregen SBT-waarden; gemiddelde ± SD wordt gegeven. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; SBT = spectrale doorbloeding; ECFP = verrijkt cyaan fluorescerend eiwit; EYFP = verbeterd geel fluorescerend eiwit; LSM = laser scanning microscoop; ASBT = acceptor SBT; DSBT = donor SBT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effecten van expressieniveau en/of donor-acceptorverhouding. De som van de emissies in de donor-, FRET- en acceptorkanalen is uitgezet tegen de FRET-efficiëntie. Dit is gedaan voor VHA-E1-ECFP en VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP en VHA-a-EYFP (B), en de ECFP-EYFP fusie (C). Lineaire regressie werd uitgevoerd; de vergelijking en R2 worden gegeven. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; ECFP = verrijkt cyaan fluorescerend eiwit; EYFP = verbeterd geel fluorescerend eiwit; VHA = vacuolaire ATPase subunit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Donor en acceptor doorbloeding van ECFP en EYFP. De spectra van de fluorescerende eiwitten werden verkregen uit de FP-database14. (A) Tijdens sensibiliseerde emissie-experimenten worden de grote delen van de donor en de acceptor gedetecteerd door individuele fotomultipliers, respectievelijk PMT1 en PMT2 genoemd. ECFP-emissie is ook detecteerbaar door de acceptordetector bij excitatie met 458 nm. De berekende spectrale bloeding van de donor in PMT2 is 40,6% van de emissie gedetecteerd door PMT1. (B) Het emissiespectrum van EYFP toont aan dat EYFP directe excitatie vertoont bij 458 nm, die vaak wordt toegepast voor de excitatie van cyaandonoren. De verwachte excitatie-efficiëntie is 9,6% van de excitatie bij 514 nm. Afkortingen: FP = fluorescerend eiwit; ECFP = verrijkt cyaan fluorescerend eiwit; EYFP = verbeterd geel fluorescerend eiwit; PMT = fotomultiplicator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Laservermogen en signaalintensiteit. De signaalintensiteiten van de 458 nm-lijn worden in blauw gegeven, de signaalintensiteiten van de 514 nm-lijn in groen. De intensiteiten die voor het experiment zijn toegepast, zijn grijs gemarkeerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Signaalintensiteiten voor SBT-bepaling. Geregistreerde maxima en berekende α en β waarden worden gegeven. Afkortingen: SBT = spectrale doorbloeding; LSM = laser scanning microscoop; FRET = Förster resonantie energieoverdracht; ASBT = acceptor SBT; DSBT = donor SBT. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Signaalintensiteiten voor kalibratie. Er worden geregistreerde maxima en berekende ξ-waarden gegeven. Gecorrigeerde waarden komen overeen met de FRET-signaalintensiteiten minus SBT. Afkortingen: SBT = spectrale doorbloeding; LSM = laser scanning microscoop; FRET = Förster resonantie energieoverdracht. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Signaalintensiteiten voor FRET-metingen. Geregistreerde maxima en E-waarden worden gegeven. Gecorrigeerde waarden komen overeen met de FRET-signaalintensiteiten minus SBT. Gekalibreerde E-waarden werden berekend met kalibratie door ξ. Afkortingen: SBT = spectrale doorbloeding; LSM = laser scanning microscoop; FRET = Förster resonantie energieoverdracht; cal. = gekalibreerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Donorblussing en gesensibiliseerde acceptoremissie worden gekenmerkt door een lineaire relatie die een op donor of acceptor gebaseerde berekening van FRET mogelijk maakt. De overeenkomstige factoren van lineariteit worden ofwel G-factor (donor naar acceptor) of xi (acceptor naar donor) genoemd, wat wederkerige waarden zijn4. Het meten van FRET tussen fluorescerende eiwitten door fluorescentiemicroscopie vereist vaak correcties voor DSBT en ASBT vanwege de brede absorptie- en emissiespectra van de fluorescerende eiwitten. Veel correcties zijn echter afhankelijk van een meetbare ASBT, wat een factor is in de noemer van de vergelijkingen in protocolsectie 7, en een α = 0 resulteert in ongedefinieerde vergelijkingen5,6.
Een aanpassing van de laserintensiteiten wordt aanbevolen om dergelijke effecten te voorkomen. Dit maakt het gebruik van op acceptors gebaseerde berekeningen en eenvoudige detectie van onjuiste donor-acceptorverhoudingen mogelijk. In dit protocol is de vergelijking van Beemiller en collega's toegepast, wat het voordeel heeft van eenvoudige kalibratie door een enkele referentieconstructie van bekende FRET-efficiëntie. De aanpassing van de detectoren is van cruciaal belang, vooral wanneer twee verschillende soorten detectoren worden toegepast. Eerdere gegevens verkregen met twee identieke fotomultipliers en identieke winsten resulteerden in een constante β = 0,61 voor meerdere experimenten gedurende jaren7,8,9 en tonen aan dat detectoraanpassing voordelig is voor de reproduceerbaarheid. Als de detectoren geen betrouwbare aanpassing mogelijk maken, kan een sequentiële scan met een enkele detector in een frame-voor-frame-modus een optie zijn om vertekening van detectoreigenschappen te voorkomen.
Metingen in plantencellen worden beïnvloed door veel pigmenten, die resulteren in excitatielichtabsorptie en achtergrondautofluorescentie. De cellulaire pigmenten worden voornamelijk opgewonden door licht in het UV-blauwe bereik4,10. Dit verklaart de discrepantie tussen de metingen in cellen en die met gezuiverde eiwitten. De gezuiverde eiwitten kunnen dienen als een bewijs van aanpassing omdat de verwachte waarden voor ASBT-α en DSBT-β kunnen worden afgeleid uit respectievelijk het absorptiespectrum van de acceptor en het donoremissiespectrum (figuur 6). De waarden van ASBT zijn vergelijkbaar in cellen (α = 0,094) en met gezuiverde fluoroforen (α = 0,114) en dicht bij de verwachte waarde van 0,096 vanwege de lage cellulaire absorptie bij 514 nm. De DSBT van β = 0,498 met gezuiverde eiwitten ligt ook dicht bij de verwachtingswaarde van 0,406. De spectrale doorbloeding is verder afhankelijk van de opstelling; diodelasers van 445 of 440 nm verminderen de directe excitatie van EYFP en verminderen daarmee de ASBT. AOBSs worden gekenmerkt door een kleinere transmissiespleet dan dichroïsche spiegels. Zo wordt de detectie van EYFP verbeterd in het bereik van 500 tot 510 nm en kan dit resulteren in extra ASBT in het donorkanaal. Spectrale eigenschappen van EYFP wijzen echter op minder dan 1% emissie van de maximale piek, rekening houdend met zowel minder effectieve excitatie als lage emissie-intensiteit. De filterspleet is veel breder met dichroïsche spiegels, wat resulteert in een extra onderdrukking van dergelijke acceptoroverspraak.
Het gebruik van de waarden van gezuiverde eiwitten weerspiegelt niet de situatie in de cel. Hetzelfde geldt voor de kalibratie met de factor ξ. Hoewel de kalibratiefactor voor beide LSM vergelijkbaar was, was deze veel hoger in metingen met het recombinante eiwit, wat de impact van cellulaire pigmenten onthulde. Vermeld moet worden dat bij deze metingen het achtergrondgeluid verwaarloosbaar maar detecteerbaar was en geen invloed had op de waargenomen intensiteiten. In tegenstelling tot metingen van de levensduur van de donor, zijn gesensibiliseerde emissie-experimenten gevoelig voor de donor-acceptorverhouding, zodat een teveel aan donor resulteert in een verminderde FRET-efficiëntie.
De eiwitexpressie is echter onder controle geweest van de CaMV35S-promotor in de huidige experimenten. Deze promotor wordt vaak gebruikt voor de overexpressie van eiwitten in planten en kan resulteren in onfysiologisch hoge hoeveelheden eiwitten13. Onder dergelijke omstandigheden neemt de kans op interactie toe en kunnen vals-positieve resultaten optreden bij hogere eiwitconcentraties. Het uitzetten van de emissie-intensiteiten tegen de FRET-efficiëntie resulteert vervolgens in een toenemende FRET-efficiëntie met toenemende emissie-intensiteit en maakt een evaluatie van de FRET-gegevens met betrekking tot het expressieniveau mogelijk.
Het wordt aanbevolen om colocalisatie-experimenten met hoge resolutie te scheiden van FRET-metingen. Voor colocalisatie worden optimale instellingen gekozen voor elke fluorofoor, terwijl voor FRET-opname emissie-intensiteiten en fijnafstelling door de pinhole-diameter de optimale beeldomstandigheden verstoren. Niettemin zijn de scheiding van organellen en informatie over subcellulaire structuren nog steeds opgenomen in FRET-metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We zorgen ervoor dat alle auteurs alle belangenconflicten hebben bekendgemaakt en geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De experimenten werden uitgevoerd op het Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) van de Faculteit Biologie van de Universiteit van Bielefeld. Dit werk is gefinancierd door de Universiteit van Bielefeld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
