Summary
In vivo Förster rezonans enerji transferi ölçümleri için standart bir konfokal lazer tarama mikroskobu kurmak ve ardından veri değerlendirmesi için bir protokol sağlanmıştır.
Abstract
Hassaslaştırılmış emisyon bazlı Förster rezonans enerji transferi (FRET) deneyleri kolayca yapılır, ancak mikroskobik kuruluma bağlıdır. Konfokal lazer tarama mikroskopları biyologlar için bir çalışma atı haline gelmiştir. Ticari sistemler lazer güç ayarı ve dedektör hassasiyetinde yüksek esneklik sunar ve genellikle mükemmel görüntüyü elde etmek için farklı dedektörleri birleştirir. Ancak, farklı denemelerden ve kurulumlardan gelen yoğunluğa dayalı verilerin karşılaştırılması genellikle bu esneklik nedeniyle imkansızdır. Biyolog dostu prosedürler avantajlıdır ve lazer ve dedektör ayarlarının basit ve güvenilir bir şekilde ayarlanmasında izin verir.
Ayrıca canlı hücrelerde yapılan FRET deneyleri protein ekspresyosu ve donör-kabul edici oranlarındaki değişkenliklerden etkilendiği için veri değerlendirmesi için protein ekspresyon düzeylerinin göz önünde bulundurulmalıdır. Burada, protein ekspresyonunun tahmini ve lazer yoğunluğunun ve dedektör ayarlarının ayarlanması için rutinler de dahil olmak üzere güvenilir ve tekrarlanabilir FRET ölçümleri için basit bir protokol açıklanmıştır. Veri değerlendirmesi, bilinen FRET verimliliğinin florofor füzyonu ile kalibrasyon ile yapılacaktır. Basitliği artırmak için hücrelerde ve rekombinant floresan proteinlerin ölçülerek elde edilen düzeltme faktörleri karşılaştırılmıştır.
Introduction
Förster rezonans enerji transferi ((F)RET) tipik olarak floresan spektroskopisi ile gözlenir, ancak sürecin kendisi floroforlar arasında meydana gelmekle sınırlı değildir. Alttaki dipol-dipol bağlantısı sadece ışık yayan bir donör molekülü ve ışık emici bir alıcı gerektirir. Bu, normalleştirilmiş donör emisyonu ve alıcı emici absorbans spektrumunun gerekli spektral örtüşümü integral J'den türetilmiştir1. Bununla birlikte, RET floresan ile rekabet ettiği için, enerji transferi floresan emisyonundaki değişikliklerle ölçülebilir hale gelir: RET, donörlerin söndürülmesine ve duyarlı kabul edilebilir emisyona neden olur.
Florofor bazlı RET, biyolüminesans rezonans enerji transferinden (BRET) ayırmak için floresan rezonans enerji transferi (FRET) olarak adlandı. RET, donör ve alıcı arasındaki mesafeye bağlıdır, bu da yaygın olarak 0.5-10 nm2 aralığındadır ve böylece proteinlerin boyutları ve kompleksleri ile aynı aralıktadır. İkinci olarak, RET dipol-dipol oryantasyon kappa kare bağlıdır. Moleküler ağırlık ve yavaş dönme gevşemesi nedeniyle proteine bağlı floroforların dönme özgürlüğünün ihmal edilebildiği gerçeğiyle birleştiğinde, RET konformasyonel değişikliklerin analizine izin verir3.
Förster yarıçapı, spektral örtüşme integraline ve örtüşmenin dalga boyu aralığına dayanır, böylece kırmızı ışık emici kromoforlar mavi ışık emici boyalardan daha uzun Förster yarıçapı ile sonuçlanır. FRET ölçümlerinin dinamik aralığı R0 × 0,5 ve R0 × 1,5 ile sınırlı olduğundan, FRET çifti ECFP-EYFP 4,9 nm4 R0 nedeniyle 2,5-7,3 nm dinamik aralığına sahiptir.
Bir floroforun parlaklığı, azı dişi yok olma katsayısının ve kuantum veriminin ürünü ile verilir. FRET ölçümleri için, neredeyse benzer parlaklığa sahip floroforları seçmek avantajlıdır. Bu, donör söndürme ve duyarlı kabul eden emisyonun tespitini artırır. Ayrıca mikroskopi sisteminin kalibrasyonunu da tercih eder. Sık kullanılan FRET siyan ve floresan protein çiftlerine bakıldığında, siyan floresan proteinlerin daha düşük parlaklığı belirgin hale gelir (Şekil 1A).
Bununla birlikte, alıcının ömrü, bağışçının enerji transferi için kullanılabilirliğini sağlamak için donörün ömründen daha düşük olmalıdır. Kabul edenin ömrü donörün ömrünü aşarsa, bağışçı tekrar heyecanlandığında kabul eden kişi hala heyecanlı durumda olabilir. mTurquoise gibi gelişmiş siyan floresan proteinler uzun bir ömür gösterir ve böylece FRET olasılığının artmasına katkıda bulunur (Şekil1B). FRET olasılığı da kabul edenin azı dişi yok olma katsayısına bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıdaki protokol için, daha önce açıklandığı gibi protoplastların geçici transfeksiyonı gerçekleştirildi12. Aşağıda kısa bir açıklama verilmiştir.
1. Protoplastların geçici transfeksiyon
- Arabidopsis thaliana ecotype Columbia'nın ~4 g sağlıklı yapraklarını 1 mm dilimler halinde kesin ve 20 mL enzim çözeltisine (%1,5 selüloz) aktarın; %0.4 macerozim; %0.1 sığır serum albümin Fraksiyonu V; 0.4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino)etanesülfonic asit (MES), pH 5.7; 10 mM CaCl2).
- Yaprak dilimlerine vakumla sızın ve ardından oda sıcaklığında 2 saat boyunca ajitasyonlu bir inkübasyon. Hücreleri 100 × g'da 3 dakika santrifüjleme ile hasat edin.
- Protoplastları W5 çözeltisi (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5.7) ile yıkayın ve MMG çözeltisinde (0.4 M mannitol; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5.7) yeniden kullanın.
- Polietilenglikkol (PEG) 4000 varlığında osmotik şok ile 8 kuyu kaydırakta transfeksiyonu gerçekleştirin. Protoplast süspansiyonunun 20 μL'sini 5 μL plazmid DNA (5 μg/μL) ve 25 μL PEG çözeltisi (0,2 M mannitol, 0,1 M CaCl2, %40 PEG 4000) ile karıştırın.
- Ozmotik koşulların hafifçe yeniden düzenlenerek ozmotik şoku tersine çevirin.
NOT: İlgi örneğinin yanı sıra, donörün ve kabul edenin spektral kanamasını belirlemek için tek başına donör ve tek başına alıcı ifadesi gereklidir. Donörün ve alıcının bir füzyon proteini de kalibrasyon amacıyla ifade edilmelidir. Floresan protein ifadesi karnabahar mozaik virüs 35S promotörünün (pCaMV35S) kontrolü altındaydı. Tüm ölçümlerde iki konfokal lazer tarama mikroskobu (LSM1 ve LSM2) kullanılmıştır. LSM1'in iki tür dedektörü vardır: FRET ölçümleri için donör sinyali bir GaAsP dedektörü tarafından tespit edilirken, FRET ve alıcı emisyonu bir fotomultiplier ile kaydedildi. LSM2 donör, FRET ve kabul eden emisyonun tespiti için kullanılan iki fotomultipliere sahiptir.
2. Lazer ayarı
NOT: Burada gelişmiş camgöbeği floresan proteini (ECFP) ve gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) etiketli proteinler arasında FRET analizi için 458 nm ve 514 nm çizgi argon-iyon lazer uygulanmıştır. Tekrarlanabilir veri toplama için her iki satır da benzer yoğunluğa göre ayarlandı. Bu, bir iletim fotomultiplier veya yansıma modu ile elde edildi.
- İletim fotomultiplier ile lazer ayarı
- Ayarlama için boş bir kuyu kullanın.
- Çizgi tarama modunu ve histogram görünümünü seçin.
- Lazer yoğunluğunu minimuma düşür ve dedektör kazancını tespit edilebilir arka plan gürültüsüne ayarlayın.
- Lazer yoğunluğunu % 0,5'lik adımlarla artırın ve ilgili sinyali kaydedin.
- Her iki lazer çizgisi için de rutini uygulayın.
- Yansıma modu ile lazer ayarı
- Ayarlama için boş bir kuyu kullanın.
- Yansıma filtresi uygulayın, varsa yansıma modunu kapatın.
- Dedektör dalga boyu aralığının lazerin dalga boylarını kapsadığından emin olun.
- Çizgi tarama modunu ve histogram görünümünü seçin.
- Lazer yoğunluğunu minimuma düşür ve dedektör kazancını tespit edilebilir arka plan gürültüsüne ayarlayın.
- Hedefi en düşük konuma getirin.
- Kapak parçasının yansıması görünene kadar hedefi yukarı taşıyın.
- Lazer yoğunluğunu % 0,5'lik adımlarla artırın ve ilgili sinyali kaydedin.
- Her iki lazer çizgisi için de rutini uygulayın.
- Veri değerlendirmesi
- Verileri tablolayın ve verileri sinyal yoğunluklarına göre sıralayın.
- Göreceli lazer gücüne karşı sinyal yoğunluklarını çizin.
- Benzer sinyal yoğunluğuna neden olan lazer yoğunluklarını seçin.
3. Fotomultipliers ayarı
NOT: Lazer ayarlamadan sonra fotomultiplierler benzer hassasiyet elde etmek için bireysel kazanımlara göre ayarlandı. Bu kalibrasyon, dalga boyu ilgi aralığının merkezinde yer alan 514 nm lazer hattı ile yapıldı.
- Ayarlama için boş bir kuyu kullanın.
- Yansıma filtresi uygulayın ve varsa yansıma moduna geçin.
- Dedektör dalga boyu aralığının lazerin dalga boylarını (514 nm) kapsadığından emin olun.
- Çizgi tarama modunu ve histogram görünümünü seçin.
- Dedektör kazancını maksimumun yarısına düşürün ve lazer yoğunluğunu algılanabilir arka plan gürültüsüne ayarlayın.
- Hedefi en düşük konuma getirin.
- Kapak parçasının yansıması görünene kadar hedefi yukarı taşıyın.
- 50 ila 100 V'lik adımlarla dedektör kazancını artırın ve ilgili sinyali kaydedin.
- Her iki dedektör için de 3.1 ile 3.8 arasında bir adım uygulayın.
- Veri değerlendirmesi
- Her dedektör için dedektör kazancına karşı yoğunluğu çizin.
- Benzer hassasiyet elde etmek için bireysel dedektör kazanımlarını seçin.
4. FRET görüntü alımı
NOT: Görüntü alımını ayarlamak için ilgi çekici örnekle başlayın.
- FRET çifti ECFP/EYFP için uygun filtreleri/dikroik aynaları seçin, örneğin çift dikroik ayna MBS 458/514. Satır satır taramayı etkinleştirmek için tüm kanallar için aynı dikroik aynayı kullanın. Canlı hücrelerin görüntülenmesi için bir su daldırma hedefi seçin. 12 bit veya 16 bit tarama ve orta tarama hızı seçin.
- Ecfp/EYFP durumunda tercihen donör tespiti için 470-510 nm ve kabul eden/FRET tespiti için 530-600 nm algılama aralığını tanımlayın. 445 nm veya 440 nm diyot lazer kullanırken, algılama aralığı olarak 450 ila 510 nm kullanın. Bir acousto-optik ışın ayırıcısı (AOBS) durumunda, istenmeyen alıcı tespitini önlemek için 450 ila 500 nm aralığında donör algılamasını tanımlayın.
- Dedektör ayarını 3.10.2'ye göre uygulayın.
- Lazer ayarını 2.3.2'ye göre uygulayın. Gerekirse, elde edilen lazer güç tablosuna göre lazer yoğunluğunu gözden geçirin. Sinyal-gürültü oranının dedektörlerin tüm dinamik aralığını (12 bit tarama için 0 ile 4095 arasında değişen yoğunluk) kapsadığından emin olun.
- Lazer yoğunluklarını ve dedektör kazanımlarını sabit tutun. İnce ayar için iğne deliği çapını kullanın.
NOT: İğne deliği çapındaki değişikliklerin uzamsal çözünürlüğü etkilediğini unutmayın. - Ölçümleri gerçekleştirin (en az 20 hücrenin görüntülerini alın).
5. Çapraz konuşma düzeltmelerinin belirlenmesi
NOT: Donör spektral kanamayı (DSBT) ve kabul eden spektral kanamayı (ASBT) sırasıyla belirlemek için sadece bağışçıyı veya kabul edeni ifade eden hücreler gereklidir. Bölüm 4'te açıklanan ayarları koruyun.
- Donör floroforu ifade eden hücrelerle FRET ölçümleri gerçekleştirin.
- Kabul eden floroforu ifade eden hücrelerle FRET ölçümleri gerçekleştirin.
6. Ölçümlerin Beemiller ve ark.13'e göre kalibrasyonu
NOT: Bilinen FRET verimliliğinin donör-alıcı füzyonunu ifade eden hücreler gereklidir. Burada 0,46 FRET verimli bir ECFP-5 aa-EYFP-füzyon kullanılmıştır4. Bölüm 4'te açıklanan ayarları koruyun.
- Donör-alıcı füzyonunu ifade eden hücrelerle FRET ölçümleri gerçekleştirin
7. Veri değerlendirmesi
- Her profilin birden fazla hücre içermemesini sağlayarak hücrelerin çizgi profillerini elde edin. Profilleri metin dosyaları olarak kaydedin.
- Veri bölümündeki metin dosyası içe aktarma seçeneğini kullanarak metin dosyalarını elektronik tabloya alın.
- Max işlevini uygulayarak en büyük değerleri okuyun.
- Elde edilen değerleri bir tabloda listeleyin, her biri donör emisyon kimliği, FRET emisyon IF, kabul eden emisyon IA ve en az dört veri kümesi için bir sütuna sahip olun: yalnızca donör, yalnızca kabul eden, bağışçı-alıcı füzyonu ve ölçüm.
NOT: Donörün çıkarılması da kabul edenin doğrudan çıkarılmasına neden olur ve α değeri ile tanımlanan ASBT'ye neden olur. - ASBT α değerlerini denklemi (1) kullanarak yalnızca alıcı veri kümesiyle hesaplayın.
(1)
NOT: Aşağıdaki denklemlerde tüm α değerlerin ortancasını kullanın. Donör, kabul edenin duyarlı emisyonu ile emisyon çapraz sap ile sonuçlanan geniş bir emisyon spektrumu gösterir. Bu DSBT β değeri tarafından verilir. - Denklemi kullanarak donör spektral kanama β değerlerini yalnızca donör veri kümesiyle hesaplayın (2).
(2)
NOT: Aşağıdaki denklemlerde tüm β değerlerin ortancasını kullanın. Kalibrasyon faktörü ξ, FRET türevi donör söndürme ve alıcının duyarlı emisyonunun doğrusal ilişkisini açıklar. Aşağıdaki denklemlerde 7,5 ve 7,6 ortancalarını kullanın. - Donör-alıcı füzyon veri kümesi ve FRET verimliliği E (0,46) ile ξ kalibrasyon faktörlerini denklemi (3) kullanarak hesaplayın.
(3)
NOT: Aşağıdaki denklemlerde tüm ξ değerlerin ortancasını kullanın. - (4) ve (5) denklemlerini kullanarak protein faiz çiftinin FRET verimliliklerini hesaplayın.
(4)
(5) - İfade gücünün ve/veya donör-alıcı oranının etkilerini tahmin edin: FRET verimliliklerine karşı kimlik, IF ve IA toplamını çizin. Doğrusal bir gerileme gerçekleştirin; grafik ne kadar dikse ve R2 ne kadar yüksekse, ifade seviyesinin etkisi o kadar yüksek veya donör ve alıcı bolluğu farkı o kadar büyüktür.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konfokal lazer tarama mikroskopunun ayarlanmasında
Lazer ayarı, artan lazer yoğunluğu ile emisyonun doğrusal bir artışını ortaya koydu (Şekil 2 ve Tablo 1). Argon iyon lazerler için beklendiği gibi, 514 nm hattının emisyonu, daha dik bir eğimin kanıt ettiği gibi, 458 nm hattının emisyonunun çok daha yüksekti. Sonraki deneyler için sırasıyla 514 nm hattı ve 458 nm hattı için %4,5 ve %6,5 lazer gücü seçilmiştir. Bu, 1123 (514 nm) ve 1141 (458 nm) neredeyse eşit emisyon yoğunluğuna neden oldu.
Dedektör kazanımlarının sürekli lazer gücüyle farklı şekilde farklılanarak analiz edilen her iki dedektör için de üstel bir davranış ortaya çıktı. Benzer emisyon yoğunlukları 700 V kazanç için elde edilmiştir (Şekil 3). Lazer hatlarının ayarlanmasında doğrusal davranıştan yararlanılsa da, dedektörlerin ayarlanmasında üstel davranıştan etkilenmesi muhtemeldir, bu da daha yüksek voltajlardaki kazançta küçük değişikliklerle belirgin farklılıklara neden olabilir. Ne yazık ki, lazer gücünü artırmak sitotoksik olduğu ve fotobleaching teşvik ettiği için, bu daha yüksek aralık canlı hücrelerdeki ölçümler için ilgi çekicidir.
Spektral kanamayı belirleme
İlk başta, donörün ve kabul edenin spektral kanaması rekombinant saflaştırılmış ECFP ve EYFP ile analiz edildi; DSBT β = 0.498 ve ASBT α = 0.100. Aynı şey ECFP veya EYFP'yi ifade eden hücreler için de yapıldı. LSM 2 ile tahmini DSBT β = 1.602 ± 0.207 (ortalama ± SD) ve ASBT α = 0.119 ± 0.018 idi. Ortanca değerler β = 1.506 ve α = 0.120 olarak belirlendi. Canlı hücrelerde elde edilen veriler ile rekombinant protein ile elde edilen veriler arasındaki bu tutarsızlık, canlı hücrelerde spektral kanamanın belirlenmesini atlamanın mümkün olmadığını göstermektedir. Bu muhtemelen hücresel pigmentlerden kaynaklanır.
Görüntüler, EYFP'nin ECFP'ye kıyasla daha yüksek parlaklığını ortaya koymaktadır (Şekil 4 ve Tablo 2). Parlaklıktaki farklılıkların farklı lazer ayarlarıyla telafi edilmesi, donörün ve FRET kanalının dinamik aralığını artırır. Ayarlama için yapıldığı gibi lazer yoğunluklarını ölçerek bağıl çıkışı sağlamak, ölçümlerin tekrarlanabilirliğini hala arttırır.
LSM 1 için β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 α = 0,084 ve β = 0,180 arasında ortanca. ASBT'nin belirlenmesi lazer ayarına ve tek bir dedektöre bağlıdır ve böylece ASBT'nin belirlenmesi iyi performans gösterir. DBST iki dedektör içerir ve her iki mikroskop için de çok farklı sonuçlar elde eder. LSM 2'nin iki fotomultiplier ile donatıldığı, LSM 1'in ise gaasp dedektörü ve fotomultiplier kullandığı unutulmamalıdır, farklı spektral özelliklere ve hassasiyete sahip iki farklı dedektör türü. Buna göre, ayarlama iki özdeş dedektörle daha iyi çalışır.
Ölçümün kalibrasyonu
Kalibrasyon için α ve β ortanca değerleri uygulanmış, bilinen FRET verimliliğinin standardı olarak ECFP ve EYFP'nin füzyonu kullanılmıştır (E = 0,46). Rekombinant ve saflaştırılmış ECFP-EYFP kalibrasyonu 13,44 ξ değerine neden olurken, in vivo ölçümlerde 1,525 ± 1,844 ξ değeri ortaya çıktı. Ortanca 0.798 idi ve yüksek standart sapması ile birlikte aşırı aykırılıkları ortaya çıkardı. LSM 1 için değerler ξ = 1.978 ± 0.807 ξ = 1.883 ortancası ile. LSM 2 ve LSM 1 için, ξ hesaplanması için elde edilen veri kümeleri (Tablo 3), Öğrenci'nin t testi (p > 0.2) tarafından kanıtlandıkça istatistiksel olarak aynıydı.
FRET ölçümü
Kavram kanıtı olarak, FRET ölçümü donör-alıcı füzyonu ile tekrarlandı. Ölçülen FRET verimliliği saflaştırılmış protein için 0,47 ± 0,07, LSM 2 ile canlı hücrelerde ise 0,47 ± 0,06 olarak ölçüldü (Tablo 4). Canlı hücrelerdeki ölçümlerin ortancası E = 0.45 idi. LSM 1 için FRET verimliliği 0,46 ± 0,09 idi ve ortanca E = 0,45 idi (Tablo 4). Bu veriler, bilinen FRET verimliliğinin bir FRET yapısı ile etkili kalibrasyonu göstermektedir.
İfade düzeyinin ve donör-alıcı oranının etkileri
Analiz edilen veri kümesi için FRET verimlilikleri ifade düzeyinden etkilenmedi. Donör ve kabul edenin kaynaşması nedeniyle oran da sabitti. Önceki veri kümelerinin dahil edilmesi, bir durumda ifade düzeyine bağımlılık olduğunu ortaya çıkarmıştır (Şekil 5). Etiketli vacuolar ATPase (V-ATPase) alt biraları, VHA-A-ECFP ve VHA-a-EYFP arasındaki FRET verimliliği artan sinyal yoğunluğu ile azaldı. Buna karşılık VHA-E1-ECFP ve VHA-C-EYFP arasındaki etkileşim sinyal yoğunluğundan bağımsızdı. VHA-A ve VHA-a durumunda, VHA-A'nın üç kopyası giderek daha fazla VHA-A-ECFP ile değiştirilir, bu da kompleksteki tek VHA-a kopyasına kıyasla donör fazlalığı ile sonuçlanır. VHA-E1 üç kopya şeklinde bulunsa da, VHA-C'nin yüksek çözünürlüğü bu örnekte bu etkiyi ortadan kaldırabilir. Burada, FRET verimliliği nispeten düşüktür. Bu basit yaklaşım, ifade ve oran yapıtlarının testine izin verir.
Şekil 1: Siyan yayan donörler ile floresan protein FRET çiftlerine genel bakış. (A) Çiftlerin Förster yarıçapı ve donör ve alıcının parlaklığı iyi karakterize edilmiş FRET çiftleri için verilir. (B) Donör ve kabul eden ömürlerin karşılaştırılması. Gri yıldız işaretleri çok ırklı bir çürümeye işaret ediyor. Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; CFP = siyan floresan protein; GFP = yeşil floresan protein; YFP = sarı floresan protein; mX = monomerik X; EX = gelişmiş X; SX = super X. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lazer ayarı. Lazerlerin emisyonu kapakçığın yansımasıyla kaydedildi ve LSM'nin acousto optik ayarlanabilir filtresi tarafından modüle edildiği gibi göreceli lazer yoğunluğuna karşı çizildi. Argon-iyon lazerin 458 nm çizgisinin (A) ve 514 nm çizgisinin (B) emisyonu gösterilir. Kısaltmalar: LSM = lazer tarama mikroskobu; r.u. = göreli birimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Dedektör kazancı ve emisyon yoğunluğu. Ortaya çıkan emisyon yoğunlukları, dedektör 1 (A) ve dedektör 2 (B) için sırasıyla 300 ila 750 V ve 300 ila 750 V arasında değişen dedektör kazançları için yansıma modunda kaydedildi. Kısaltma = r.u. = göreli birimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Spektral kanama. Donör, FRET ve kabul eden kanallarda görüntüler elde edildi. (A) Saflaştırılmış floresan proteinlerle elde edilen görüntüler; ölçek çubukları = 100 μm; (B) floresan proteinleri ifade eden hücreler için karşılık gelen görüntüler; ölçek çubukları = 10 μm. (C) Elde edilen SBT değerlerinin grafikleri; SD ± verilir. Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; SBT = spektral kanama; ECFP = gelişmiş siyan floresan protein; EYFP = gelişmiş sarı floresan protein; LSM = lazer tarama mikroskobu; ASBT = kabul eden SBT; DSBT = donör SBT. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İfade düzeyinin ve/veya donör-kabul eden oranının etkileri. Donör, FRET ve alıcı kanallardaki emisyonların toplamı FRET verimliliğine karşı çizilmiştir. Bu, VHA-E1-ECFP ve VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP ve VHA-a-EYFP (B) ve ECFP-EYFP füzyonu (C) için yapılmıştır. Doğrusal regresyon gerçekleştirildi; denklem ve R2 verilir. Kısaltmalar: FRET = Förster rezonans enerji transferi; ECFP = gelişmiş siyan floresan protein; EYFP = gelişmiş sarı floresan protein; VHA = vacuolar ATPase alt birliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: ECFP ve EYFP'nin bağışçısı ve kabul edeninin kanaması. Floresan proteinlerin spektrumları FP veritabanından elde edildi14. (A) Hassaslaştırılmış emisyon deneyleri sırasında, donörün ve kabul edenin büyük kısımları sırasıyla PMT1 ve PMT2 adlı bireysel fotomultiplierler tarafından tespit edilir. ECFP emisyonu, 458 nm ile heyecanlandıktan sonra kabul dedektörü tarafından da algılanabilir. HESAPLANAN donör spektral kanama PMT2'ye, PMT1 tarafından tespit edilen emisyonun% 40,6'sıdır. (B) EYFP'nin emisyon spektrumu, EYFP'nin siyan donörlerinin çıkarılması için sıklıkla uygulanan 458 nm'de doğrudan heyecan gösterdiğini göstermektedir. Beklenen heyecan verimliliği 514 nm'deki heyecanlanmanın% 9.6'sıdır. Kısaltmalar: FP = floresan protein; ECFP = gelişmiş siyan floresan protein; EYFP = gelişmiş sarı floresan protein; PMT = fotomultiplier. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Lazer gücü ve sinyal yoğunluğu. 458 nm hattının sinyal yoğunlukları mavi, 514 nm çizgisinin sinyal yoğunlukları yeşil renkte verilmiştir. Deney için uygulanan yoğunluklar gri renkte vurgulanır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: SBT tayini için sinyal yoğunlukları. Kaydedilen maxima ve hesaplanan α ve β değerleri verilir. Kısaltmalar: SBT = spektral kanama; LSM = lazer tarama mikroskobu; FRET = Förster rezonans enerji transferi; ASBT = kabul eden SBT; DSBT = donör SBT. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: Kalibrasyon için sinyal yoğunlukları. Kaydedilen maxima ve hesaplanan ξ değerleri verilir. Düzeltilen değerler FRET sinyal yoğunluklarına karşılık gelir eksi SBT. Kısaltmalar: SBT = spektral kanama; LSM = lazer tarama mikroskobu; FRET = Förster rezonans enerji transferi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: FRET ölçümleri için sinyal yoğunlukları. Kaydedilen maxima ve E değerleri verilir. Düzeltilen değerler FRET sinyal yoğunluklarına karşılık gelir eksi SBT. Kalibre edilmiş E değerleri ξ kalibrasyon ile hesaplanmıştır. Kısaltmalar: SBT = spektral kanama; LSM = lazer tarama mikroskobu; FRET = Förster rezonans enerji transferi; cal. = kalibre edilmiş. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Donör söndürme ve duyarlı kabul eden emisyon, donör veya alıcı tabanlı FRET hesaplamasına izin veren doğrusal bir ilişki ile karakterize edilir. Karşılık gelen doğrusallık faktörlerine, karşılıklı değerler olan G faktörü (bağışçıdan alıcıya) veya xi (donöre kabul eden) denir4. Floresan proteinler arasındaki FRET'in floresan mikroskopi ile ölçülmesi, floresan proteinlerin geniş emilimi ve emisyon spektrumu nedeniyle genellikle DSBT ve ASBT için düzeltmeler gerektirir. Bununla birlikte, birçok düzeltme, protokol bölüm 7'deki denklemlerin paydasında bir faktör olan ölçülebilir bir ASBT'ye bağlıdır ve α = 0 tanımsız denklemlerle sonuçlanır5,6.
Bu tür etkileri önlemek için lazer yoğunluklarının ayarlanmasında tavsiye edilir. Bu, alıcı bazlı hesaplamaların kullanılmasını ve uygun olmayan donör-kabul eden oranlarının kolayca tespitini sağlar. Bu protokolde, bilinen FRET verimliliğinin tek bir referans yapısı ile basit kalibrasyon avantajına sahip olan Beemiller ve iş arkadaşları denklemi uygulanmıştır. Dedektörlerin ayarlanmasında, özellikle iki farklı dedektör türü uygulandığında kritik öneme sahiptir. İki özdeş fotomultiplier ve özdeş kazançla elde edilen önceki veriler, yıllar boyunca birden fazla deney için sabit bir β = 0,61 ile sonuçlandı7,8,9 ve dedektör ayarının tekrarlanabilirlik için avantajlı olduğunu göstermektedir. Dedektörler güvenilir bir ayarlamaya izin vermiyorsa, dedektör özelliklerinden sapmayı önlemek için kare kare modda tek bir dedektörle sıralı tarama bir seçenek olabilir.
Bitki hücrelerindeki ölçümler birçok pigment tarafından etkilenir, bu da heyecan verici ışık emilimi ve arka plan otofluoresansı ile sonuçlanır. Hücresel pigmentler esas olarak UV ila mavi aralıktaki ışık tarafından heyecanlanır4,10. Bu, hücrelerdeki ölçümler ile saflaştırılmış proteinlere sahip olanlar arasındaki tutarsızlığı açıklar. Asbt α ve DSBT β için beklenen değerler sırasıyla kabul eden emilim spektrumundan ve donör emisyon spektrumundan elde edilebildiğinden, saflaştırılmış proteinler bir ayarlama kanıtı olarak hizmet edebilir (Şekil 6). ASBT değerleri hücrelerde (α = 0.094) ve saflaştırılmış floroforlarla (α = 0.114) benzerdir ve 514 nm'deki düşük hücresel emilim nedeniyle beklenen 0.096 değerine yakındır. Saflaştırılmış proteinlerle β = 0.498 DSBT'si de beklenen 0.406 değerine yakındır. Spektral kanama daha da kuruluma bağlıdır; 445 veya 440 nm diyot lazerler EYFP'nin doğrudan heyecanını azaltır ve böylece ASBT'yi azaltır. AOBS'ler dikroik aynalardan daha küçük bir iletim boşluğu ile karakterizedir. Böylece EYFP'nin tespiti 500 ila 510 nm aralığında arttırılmış ve donör kanalına ilave ASBT ile sonuçlanabilir. Bununla birlikte, EYFP'nin spektral özellikleri, hem daha az etkili ekscitasyon hem de düşük emisyon yoğunluğu göz önüne alındığında, maksimum zirvenin% 1'inden daha az emisyona işaret ediyor. Filtre boşluğu dikroik aynalarla çok daha geniştir, bu da bu tür kabul eden çapraz konuşmaların ek bir şekilde bastırılmasına neden olandır.
Saflaştırılmış proteinlerden elde edilen değerlerin kullanılması hücredeki durumu yansıtmaz. Aynı durum kalibrasyon için de ξ faktörüne göre geçerlidir. Kalibrasyon faktörü her iki LSM için de benzer olmasına rağmen, rekombinant protein ile yapılan ölçümlerde çok daha yüksekti ve hücresel pigmentlerin etkisini ortaya çıkardı. Bu ölçümlerde arka plan gürültüsünün ihmal edilebilir ancak tespit edilebilir olduğu ve gözlenen yoğunlukları etkilemediği belirtilmelidir. Donör ömrünün ölçümlerinin aksine, duyarlı emisyon deneyleri donör-kabul oranına duyarlıdır, böylece fazla miktarda donör FRET verimliliğinin azalmasına neden olur.
Bununla birlikte, protein ifadesi mevcut deneylerde CaMV35S-promotörünün kontrolü altında olmuştur. Bu promotör, bitkilerdeki proteinlerin aşırı ekspresyonu için sıklıkla kullanılır ve fizyolojik olarak yüksek miktarda proteine neden olabilir13. Bu koşullar altında, etkileşim olasılığı artar ve daha yüksek protein konsantrasyonlarında yanlış-pozitif sonuçlar ortaya çıkabilir. Emisyon yoğunluklarının FRET verimliliğine karşı çizilmesi, daha sonra artan emisyon yoğunluğu ile artan bir FRET verimliliği ile sonuçlanır ve FRET verilerinin ifade düzeyine göre değerlendirilmesini sağlar.
Yüksek çözünürlüklü kolokalizasyon deneylerinin FRET ölçümlerinden ayrılması önerilir. Kolokalizasyon için her florofor için optimum ayarlar seçilirken, FRET kaydı için emisyon yoğunlukları ve iğne deliği çapı ile ince ayar optimum görüntü koşullarına müdahale edilir. Bununla birlikte, organellerin ayrılması ve hücre altı yapılara ilişkin bilgiler hala FRET ölçümlerinde ele haline eklenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların herhangi bir çıkar çatışmasını ifşa etmelerinden ve rakip finansal çıkarları olmadığından emin olmak için.
Acknowledgments
Deneyler, Bielefeld Üniversitesi Biyoloji Fakültesi Işık Mikroskopi Teknolojisi Platformu'nda (LiMiTec) gerçekleştirildi. Bu çalışma Bielefeld Üniversitesi tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
