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Biochemistry

समरूप मनका-आधारित परख का उपयोग करके चैपरोन-कोचेपरोन इंटरैक्शन का अध्ययन

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62762
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1
1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

Summary

यह प्रोटोकॉल जीएसटी-फ्यूज्ड टीपीआर-आकृति सह-चैपरनेस और स्वीकारकर्ता मोतियों के साथ ग्लूटाथिएक-लिंक्ड डोनर मोतियों का उपयोग करके प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है जो Hsp90-व्युत्पन्न पेप्टाइड के साथ मिलकर होता है। हमने इस तकनीक का उपयोग Hsp90-FKBP51 या Hsp90-FKBP52 इंटरैक्शन को बाधित करने के लिए छोटे अणुओं को स्क्रीन करने के लिए किया है और शक्तिशाली और चयनात्मक Hsp90-FKBP51 इंटरैक्शन अवरोधकों की पहचान की है।

Abstract

हीट शॉक प्रोटीन 90 (एचएसपी90) को लक्षित करना- कोचेपेरोन इंटरैक्शन विशेष रूप से एचएसपी 90-निर्भर इंट्रासेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने की संभावना प्रदान करता है। Hsp90 के सी-टर्मिनस में संरक्षित MEEVD पेंटेपिड सह-चैपरोन्स के टेट्राट्राट्राट्रिकोपेप्टाइड रिपीट (टीपीआर) आकृति के साथ बातचीत के लिए जिम्मेदार है। FK506-बाध्यकारी प्रोटीन (FKBP) 51 और FKBP52 दो समान टीपीआर-आकृति सह-विभिन्न कार्यों के साथ स्टेरॉयड हार्मोन पर निर्भर रोगों में शामिल chaperones हैं। इसलिए, विशेष रूप से Hsp90 और FKBP51 या FKBP52 के बीच बातचीत को अवरुद्ध अणुओं की पहचान कई मानव रोगों के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय क्षमता प्रदान करता है । यहां, हम Hsp90 और उसके साथी सह-chaperones FKBP51 और FKBP52 के बीच बातचीत की जांच करने के लिए एक प्रवर्धित ल्यूमिनेसेंट निकटता समरूप परख के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, हमने ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेज (जीएसटी) टैग किए गए फॉर्म में टीपीआर आकृति युक्त प्रोटीन FKBP51 और FKBP52 को शुद्ध किया है। जीएसटी-फ्यूज्ड टीपीआर-मोटिफ प्रोटीन और स्वीकारकर्ता मोतियों के साथ ग्लूटाथिएक से जुड़े दाता मोतियों का उपयोग करते हुए एचएसपी90 के 10-मेर सी-टर्मिनल पेप्टाइड के साथ मिलकर, हमने एक सजातीय वातावरण में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच की है। हमने इस परख का उपयोग Hsp90-FKBP51 या Hsp90-FKBP52 बातचीत को बाधित करने के लिए छोटे अणुओं को स्क्रीन करने के लिए किया है और शक्तिशाली और चयनात्मक Hsp90-FKBP51 बातचीत अवरोधकों की पहचान की है ।

Introduction

आणविक चैपरेन प्रोटीन फोल्डिंग, परिवहन और गिरावट सहित प्रोटीन होरोस्टेसिस में योगदान देते हैं। वे कई सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं और कैंसर और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे कई रोगों से जुड़े होते हैं1. हीट शॉक प्रोटीन 90 (एचएसपी 90) सबसे महत्वपूर्ण चैपरोन्स में से एक है जिसका कार्य एटीपी हाइड्रोलिसिस द्वारा संचालित अनुरूप परिवर्तनों पर निर्भर है और इसके सह-चैपरोन्स2द्वारा मध्यस्थता किए गए ग्राहक प्रोटीन के साथ बाध्यकारी है। चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में Hsp90 की एक स्पष्ट क्षमता के बावजूद, ठीक ट्यूनिंग अपने कार्य एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । एन-टर्मिनल एटीपी बाध्यकारी क्षेत्र को लक्षित करने वाले कई Hsp90 अवरोधक हैं, जिनका नैदानिक परीक्षणों में मूल्यांकन किया गया है, लेकिन उनमें से किसी को भी विपणन3के लिए अनुमोदित नहीं किया गया है। एक सुपरिभाषित लिगांड-बाइंडिंग पॉकेट4की कमी के कारण, एचएसपी90 के सी-टर्मिनल क्षेत्र को लक्षित करने में सीमित सफलता मिली है4। हाल ही में, छोटे अणुओं द्वारा Hsp90-cochaperone बातचीत के व्यवधान की जांच एक वैकल्पिक रणनीति5के रूप में की गई है । Hsp90-cochaperone बातचीत को लक्षित करने से सामान्य सेल तनाव प्रतिक्रिया प्राप्त नहीं होगी और विभिन्न इंट्रासेलुलर प्रक्रियाओं को विशेष रूप से विनियमित करने की संभावना प्रदान की जाती है। Hsp90 के सी-टर्मिनस में संरक्षित एमईवीडी पेंटेपिड सह-चैपरोन्स6के टेट्राट्राइकोपेप्टाइड रिपीट (टीपीआर) आकृति के साथ बातचीत के लिए जिम्मेदार है। मानव प्रोटीन डेटाबेस में एनोटेटेड 736 टीपीआर आकृति युक्त प्रोटीन में से, ~ 20 विभिन्न प्रोटीन इस पेप्टाइड 7 के माध्यम सेएचएसपी90के साथ बातचीत करते हैं। MEEVD पेप्टाइड-बाइंडिंग के लिए प्रतिस्पर्धा करने वाले अणु एचएसपी 90 और टीपीआर डोमेन वाले सह-चैपरनेस के बीच बातचीत को बाधित करेंगे। पेप्टाइड बाध्यकारी साइट में समान तृतीयक संरचना है लेकिन विभिन्न टीपीआर आकृति डोमेन के बीच समग्र होमोलॉजी अपेक्षाकृत कमहै,जो विशेष रूप से एचएसपी 90 और विशेष टीपीआर-मोटिफ सह-चैपरनेस के बीच बातचीत को अवरुद्ध करने में सक्षम अणुओं की पहचान करने का अवसर प्रदान करता है। इन टीपीआर-आकृति सह-चैपरोन्स, FK506-बाध्यकारी प्रोटीन (FKBP) ५१ और FKBP52 स्टेरॉयड हार्मोन रिसेप्टर (SHR) संकेत के नियामकों और कैंसर, तनाव से संबंधित रोगों, चयापचय रोगों, और अल्जाइमर रोग8सहित कई स्टेरॉयड हार्मोन पर निर्भर रोगों में शामिल हैं । हालांकि FKBP51 और FKBP52 शेयर ८०% अनुक्रम समानता >, उनके कार्यों में अंतर: FKBP52 SHR गतिविधि का एक सकारात्मक नियामक है, जबकि FKBP51 ज्यादातर मामलों में एक नकारात्मक नियामक है8। इसलिए, अणुओं की पहचान करना, विशेष रूप से Hsp90 और FKBP51 या FKBP52 के बीच बातचीत को अवरुद्ध करना, संबंधित बीमारियों के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय क्षमता प्रदान करता है।

एकmplified Luminescent पीroximity एचomogenous एकssay (अल्फास्क्रीन) पहली बार १९९४ में Ullman EF एट अल9द्वारा विकसित किया गया था । अब इसका व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार के जैविक संपर्कों का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है, जैसे पेप्टाइड10,प्रोटीन11,डीएनए12,आरएनए13और चीनी14। इस तकनीक में दो तरह के मोतियों (व्यास 200 एनएम) हैं, एक है डोनर मनका और दूसरा है स्वीकार्य मनका। जैव अणुओं को इन मोतियों पर स्थिर किया जाता है; उनकी जैविक बातचीत दाता और स्वीकारकर्ता मोती निकटता में लाती है। 680 एनएम पर, दाता मनका में एक फोटोसेंसिटाइजर रोशन और एकल ऑक्सीजन के लिए ऑक्सीजन परिवर्तित करता है। क्योंकि सिंगलेट ऑक्सीजन का एक छोटा जीवनकाल होता है, इसलिए यह केवल 200 एनएम तक ही फैल सकता है। यदि स्वीकार्य मनका निकटता में है, तो इसका थिऑक्सीन डेरिवेटिव 370 एनएम पर सिंगलेट ऑक्सीजन उत्पन्न करने वाले रसायन के साथ प्रतिक्रिया करता है। यह ऊर्जा 520-620 एनएम15पर प्रकाश उत्सर्जित करने के लिए एक ही स्वीकार्य मनका में फ्लोरोफोरस को और सक्रिय करती है। यदि जैविक बातचीत बाधित होती है, तो स्वीकार्य मनका और दाता मनका निकटता तक नहीं पहुंच सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एकल ऑक्सीजन क्षय और कम उत्पादित संकेत होते हैं।

यहां हम एचएसपी 90 और टीपीआर सह-चैपरनेस, विशेष रूप से एफकेबीपी51 और एफकेबीपी52 के बीच बातचीत को बाधित करने वाले छोटे अणुओं को स्क्रीनिंग के लिए इस तकनीक का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। Hsp90 चरम सी-टर्मिनस के अनुरूप 10 अमीनो एसिड लांग पेप्टाइड्स स्वीकारकर्ता मोतियों से जुड़े होते हैं। शुद्ध जीएसटी-टैग टीपीआर सह-चैपरोन ग्लूटाथिएक से जुड़े दाता मोतियों के साथ बातचीत करते हैं। जब Hsp90-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स और टीपीआर-आकृति सह-चैपरेन्स के बीच बातचीत मोतियों को एक साथ लाती है, तो एक प्रवर्धित संकेत(चित्रा 1 ए)का उत्पादन किया जाता है। यदि जांच किए गए छोटे अणु Hsp90 और टीपीआर-आकृति सह-चैपरनेस के बीच बातचीत को रोक सकते हैं, तो इस प्रवर्धित संकेत(चित्रा 1 बी)को कम कर दिया जाएगा। उनके आईसी50 की गणना मात्रात्मक माप द्वारा की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल को किसी भी चैपरोन - टीपीआर-मोटिफ सह-चैपरवन इंटरैक्शन ऑफ इंटरेस्ट तक बढ़ाया जा सकता है और उपन्यास अणुओं के विकास में बहुत महत्व रखता है, विशेष रूप से एचएसपी 90 और एफकेबीपी51 या एफकेबीपी52 के बीच बातचीत को अवरुद्ध करता है।

Figure 1
चित्र 1:इस परख का मूल सिद्धांत। (एक)शुद्ध जीएसटी-FKBP51 ग्लूटाथिएक से जुड़े दाता मोतियों के साथ बातचीत करता है । Hsp90 के चरम सी-टर्मिनस के अनुरूप 10 अमीनो एसिड लांग पेप्टाइड्स स्वीकारकर्ता मोतियों से जुड़े होते हैं। FKBP51 के Hsp90-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स और टीपीआर डोमेन के बीच बातचीत दाता और स्वीकारकर्ता मोती निकटता में लाता है । 680 एनएम पर, दाता मनका में एक फोटोसेंसिटाइजर रोशन और एकल ऑक्सीजन के लिए ऑक्सीजन परिवर्तित करता है। स्वीकारकर्ता मनका पर थिऑक्सीन व्युत्पन्न एकल ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया करता है और 370 एनएम पर रसायनिनेसेंस उत्पन्न करता है। यह ऊर्जा 520-620 एनएम पर प्रकाश उत्सर्जित करने के लिए एक ही स्वीकार्य मनका में फ्लोरोफोरस को सक्रिय करती है। (ख)जब छोटे अणु एचएसपी90 और एफकेबीपी51 के बीच बातचीत को रोकते हैं, तो दाता और स्वीकार्य मोती निकटता तक नहीं पहुंच सकते हैं । फिर छोटे जीवनकाल क्षय के साथ सिंगलेट ऑक्सीजन, और कोई पता लगाने योग्य संकेत का उत्पादन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 2में दिखाया गया है ।

1. जीएसटी-FKBP51 और GST-FKBP52(चित्रा 2A) कीअभिव्यक्ति और शुद्धि

  1. प्लाज्मिड्स
    नोट: छवि कंसोर्टियम से मानव FKBP51 (क्लोन आईडी: 5723416) और मानव FKBP52 (क्लोन आईडी: 7474554) के लिए सीडीएनए क्लोन प्राप्त करें ।
    1. प्राइमर्स के साथ पीसीआर द्वारा मानव FKBP51 डीएनए बढ़ाना (आगे; 5'GGATCCATGACTGATGAGAGT-3', रिवर्स; 5'-CTCGACTATGTCTCTCTCTCTCCCAC-3') बामही और XhoI overhangs और bamhi/XhoI साइटों पर pGEX6-1 वेक्टर में क्लोन युक्त ।
    2. प्राइमर के साथ पीसीआर द्वारा मानव FKBP52 डीएनए बढ़ाना (आगे; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGATGATG-3', रिवर्स; 5'-CTCGAGCTATGCTCTCTCTCTCCCAC-3') जिसमें इकोरी और XhoI ओवरहांग्स और क्लोन होते हैं और पीसीईएक्स6-2 वेक्टर इको में क्लोन होते हैं।
      नोट: पीसीआर रिएक्शन सेट अप और शर्तों को तालिका 1 और तालिका 2में दिखाया गया है ।
    3. डाले गए अनुक्रम को सत्यापित करें और निर्माण प्रोटोकॉल के अनुसार प्लाज्मिड को रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई में बदल दें।
  2. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि
    1. पौंड समाधान बनाने के लिए 1 एल आसुत पानी में लुरिया शोरबा (एलबी) बेस के 25 ग्राम जोड़ें। ऑटोक्लेव इसे 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर। ठंडा होने के बाद इसमें 50 माइक्रोग्राम/एमएल एम्पीसिलिन डालें।
    2. जीएसटी-FKBP51 या GST-FKBP52 व्यक्त बैक्टीरिया की एक कॉलोनी ले लो और एक 1.5 मिलीएल ट्यूब में एलबी समाधान के 500 μL के साथ मिश्रण। भंवर।
    3. एक एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर Erlenmeyer फ्लास्क में पौंड समाधान के 1 एल में "1.2.2" का मिश्रण जोड़ें। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर में एर्लेनमेयर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें।
    4. एर्लेनमेयर फ्लास्क में 1 एमएम आइसोप्रोपिल-β-डी-थिओगालक्टोसाइड (आईपीटीजी) जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें और आगे 2 घंटे के लिए इनक्यूबेशन जारी रखें।
    5. सेल छर्रों को प्राप्त करने के लिए, 15 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सुपरनिट निकालें।
      नोट: सेल छर्रों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    6. पीबीएस के 40 एमएल में सेल छर्रों को फिर से रीसुस्ट करें और बर्फ पर 3 x 20 एस को सोनिकेट करें। प्रोटेओलिसिस को रोकने के लिए 1 एमएम पीएमएसएफ, 1 एमएम ईडीए, और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (1 टैबलेट) जोड़ें।
    7. सेल मलबे को हटाने और 5 एमएल जीएसटी-ट्रैप कॉलम पर सुपरनैंट लागू करने के लिए 30 मिनट 50,000 x ग्राम के लिए निलंबन को अपसेंट्राइज करें।
    8. पीबीएस में 10 एमएल ग्लूटाथिएक के 5 एमएल के साथ 30 एमएल पीबीएस, एल्यूट जीएसटी-एफकेबीपी51 और जीएसटी-एफकेबीपी52 के साथ कॉलम धोने के बाद।
    9. 15 एमएल 10.000 MWCO सेंट्रलफ्यूजेशन यूनिट पर प्रोटीन को केंद्रित करें। मुफ्त ग्लूटाथिएक को हटाने के लिए, पास पीडी-10 कॉलम के माध्यम से ध्यान केंद्रित करता है जो 0.5x पीबीएस के साथ समतुल्य होता है और फिर से फिल्टर अपकेंद्रित्र डिवाइस पर ध्यान केंद्रित करता है।
    10. प्रोटीन युक्त अंश ों को एकत्र करें। एसडीएस-पेज में प्रोटीन को सत्यापित करें और प्रोटीन सांद्रता को 1 मिलीग्राम/एमएल में समायोजित करें ।
      नोट: ठेठ प्रोटीन उपज 2-5 मिलीग्राम/एल संस्कृति है । प्रोटीन को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

2. स्वीकारकर्ता मोतियों को Hsp90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड की युग्मन(चित्रा 2B)

  1. Hsp90 पेप्टाइड तैयारी
    1. संश्लेषण दस अमीनो एसिड पेप्टाइड एनएच 2-EDASRMEEVD-COOH एक पेप्टाइड संश्लेषण सेवा द्वारा मानव Hsp90 बीटा आइसोफॉर्म (UniProt आईडी: P08238) के अमीनो एसिड 714-724 के अनुरूप ।
    2. पीबीएस में एचएसपी90 पेप्टाइड को 1 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता से पतला करें ।
  2. स्वीकारकर्ता मोती की तैयारी
    1. पीबीएस में अविजित स्वीकारकर्ता मोतियों को 1 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता से पतला करें और 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 15 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा धोने का प्रदर्शन करें। सुपरनेट को सावधानी से दूर करें।
  3. संयोजित
    1. मोतियों और पेप्टाइड के बीच अनुपात को 10:1 के रूप में सेट करें। 1.5 मिली लीटर ट्यूब में 1 मिलीग्राम स्वीकार्य मनका गोली (ऊपर वर्णित के रूप में तैयार), पीबीएस के 1 एमएल (पीएच 7.4), 0.1 मिलीग्राम पतला पेप्टाइड जोड़ें, ट्वीन-20 का 1.25 माइक्रोन, पानी में सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड (एनएबीएच3सीएन) के 400 एमएम समाधान का 10 माइक्रोन।
      सावधानी: NaBH3CN विषाक्त है; एक धूम हुड और दस्ताने का उपयोग करें। NaBH 3CN समाधान हौसले से तैयार किया जाना चाहिए।
    2. रोटरी शेकर पर एंड-ओवर एंड आंदोलन (10-20 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  4. प्रतिक्रिया शमन और मोती धोने
    1. अप्रतिक्रिया साइटों को ब्लॉक करने की प्रतिक्रिया के लिए 1 एम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0) समाधान का 20 माइक्रोल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम (या अधिकतम गति) पर सेंट्रलाइज। सुपरनैंट निकालें और ट्रिस-एचसीएल समाधान (100 mm, पीएच 8.0) के 1 एमसीएल में मनका गोली को फिर से खर्च करें।
    3. धुलाई के कदम को तीन बार दोहराएं।
    4. अंतिम अपकेंद्रित्र के बाद, भंडारण बफर में 1 मिलीग्राम/एमएल (0.5 × पीबीएस के 1 एमएल को परिरक्षक के रूप में 0.01% सोडियम एजाइड के साथ) पर मोतियों को फिर से खर्च करें। 4 डिग्री सेल्सियस प्रकाश संरक्षित पर संयुग्मित स्वीकार्य मनका समाधान स्टोर करें।
      सावधानी: सोडियम अज़ाइड विषाक्त है; एक धूम हुड और दस्ताने का उपयोग करें।

3. जीएसटी-FKBP51 या जीएसटी-FKBP52 और Hsp90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड के बीच बातचीत की जांच कर रही परख, और छोटे आणविक द्रव्यमान यौगिकों(चित्रा 2 सी)के साथ अवरोध

  1. जीएसटी टैग प्रोटीन ग्लूटाथिएक दाता मोती के साथ बातचीत
    1. 384-अच्छी प्लेटों में प्रतिक्रियाओं को स्थापित करें।
    2. 0.5x PBS, पीएच 7.4 में ग्लूटाथिएक दाता मोती के 10 μg/mL युक्त समाधान तैयार करें।
      नोट: लंबे समय तक भंडारण के बाद, मोती बसने और भंवर की जरूरत है ।
    3. 10 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए जीएसटी-FKBP51 या GST-FKBP52 जोड़ें ।
    4. 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट।
      नोट: इस कदम पर, जीएसटी टैग प्रोटीन मोतियों से जुड़े ग्लूटाथिएक के साथ बातचीत करेंगे। प्रत्येक कुएं के लिए, इस मिश्रण का 22.5 माइक्रोन उपयोग किया जाएगा। बाध्यकारी भागीदारों की एकाग्रता अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए । टिट्रेट जीएसटी- FKBP51 और GST- FKBP52 और एकाग्रता का चयन करें जो सबसे अच्छा संकेत देता है।
  2. यौगिक योग
    1. डीएमएसओ में परीक्षण यौगिकों के धारावाहिक कमजोर करते हैं।
      नोट: उपयोग की जाने वाली सांद्रता आमतौर पर 10, 30, 100, 300, 1,000 और 3,000 माइक्रोन हैं।
    2. डीएमएसओ (नकारात्मक नियंत्रण) या एचएसपी 90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड (सकारात्मक नियंत्रण, 30 माइक्रोन) या डीएमएसओ में यौगिकों को प्लेट के प्रत्येक कुएं के कोने में 0.25 माइक्रोन जोड़ें। हर यौगिक एकाग्रता के लिए ट्रिपलीकेट का उपयोग करें।
    3. प्रत्येक कुएं में जीएसटी-टैग किए गए प्रोटीन के साथ ग्लूटाथिएक डोनर मोतियों वाले समाधान का 22.5 माइक्रोन जोड़ें।
    4. थाली को धीरे-धीरे हाथ से हिलाएं लेकिन अच्छी तरह से। 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट।
      नोट: इस समय के दौरान, यौगिक Hsp90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड बाध्यकारी साइट पर टीपीआर डोमेन के साथ बातचीत करेंगे।
  3. स्वीकारकर्ता मोती इसके अलावा
    1. 0.5x PBS में 100 μg/एमएल करने के लिए संलग्न Hsp90 सी टर्मिनल पेप्टाइड के साथ स्वीकार्य मोतियों को पतला करें।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से पतला स्वीकारकर्ता मोती के 2.25 μL जोड़ें।
    3. धीरे-धीरे लेकिन अच्छी तरह से मिलाएं। 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट।
      नोट: इस कदम पर, दाता और स्वीकारकर्ता मोती प्रोटीन-पेप्टाइड बातचीत द्वारा निकटता में लाया जाता है । प्रतिक्रिया मिश्रण की अंतिम मात्रा 25 माइक्रोन है। इसलिए, यौगिकों की अंतिम सांद्रता 0.1 से 30 माइक्रोन तक होती है।
  4. प्लेट रीडिंग
    नोट: प्रासंगिक मोड में सेट प्लेट रीडर का उपयोग करके प्लेट पढ़ें।
    1. उपकरण चालू करें और सॉफ्टवेयर खोलें
    2. संबंधित प्रोटोकॉल चुनें।
    3. एडिट प्लेट मैप पर क्लिक करें और माप के लिए प्लेट में उपयोग की जा रही अच्छी तरह का चयन करें।
    4. चयनित प्रोटोकॉल को जारी रखने और चलाने के लिए आगे क्लिक करें।
    5. माप के बाद, परिणाम देखने के लिए शो परिणाम पर क्लिक करें.
    6. डेटा निर्यात करें।

4. डेटा विश्लेषण

  1. जेड फैक्टर और सिग्नल-टू-बैकग्राउंड (एस/बी) अनुपात
    1. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कर परख के लिए जेड ' कारक और एस/बी अनुपात की गणना करें:
      Z'=1-(3σपीओएस+3σनेग)/│μपीओएस-μनेग│16
      S/B=μनेग/μपीओएस
      जहां, σ और μ क्रमशः सकारात्मक (एचएसपी 90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड, 30 माइक्रोएम) और नकारात्मक (डीएमएसओ) नियंत्रण के मानक विचलन और साधनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। 0.5 > एक जेड कारक यह सुनिश्चित करेगा कि परख स्क्रीनिंग के लिए काफी मजबूत है। परख संवेदनशीलता पर नजर रखने के लिए एस/बी अनुपात की गणना भी की गई है।
  2. खुराक-प्रतिक्रिया वक्र और आईसी 50
    नोट: सॉफ्टवेयर द्वारा Hsp90-cochaperones पीपीआई अवरोधकों के डेटा को फिट करने के लिए nonlinear प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करें ।
    1. वेलकम डायलॉग में एक्सवाई डेटा टेबल बनाएं और एक्स नंबर्सका चयन करें, और वाई एंटर 3 (यदि ट्रिपलिकेट) साथ-साथ कॉलम में मूल्यों को दोहरातेहैं।
    2. नमूनों के सिग्नल डेटा को नकारात्मक नियंत्रण समूह को सामान्य करें। एक्स कॉलम और वाई कॉलम के लिए संकेत मूल्यों के लिए एकाग्रता मूल्यों का आयात करें।
    3. क्लिक करें विश्लेषण करें और ट्रांसफॉर्म | के तहत ट्रांसफॉर्म एकाग्रता (X) चुनें सामान्य हो। लोगार्थ्म्स में ट्रांसफॉर्मचुनें ।
      नोट: यह एकाग्रता को लॉग पैमाने पर बदल देगा। यदि आपकी शुरुआती एकाग्रता शून्य है, तो इसे बहुत कम संख्या में सेट करें जो प्रभावी रूप से शून्य (उदाहरण के लिए, 0.1 एनएम) है क्योंकि शून्य के लोगरिथ्म को परिभाषित नहीं किया गया है।
    4. XY विश्लेषणोंके तहत Nonlinear प्रतिगमन (वक्र फिट) का विश्लेषण और चयन करें, खुराक-प्रतिक्रिया-अवरोधन खोलें और लॉग (अवरोधक) बनाम प्रतिक्रिया चुनें -- परिवर्तनीय ढलान।
    5. परिणाम (आईसी50 मूल्य युक्त) और रेखांकनदेखने के लिए ठीक क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2-इस प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध। } जीएसटी की अभिव्यक्ति और शुद्धि-FKBP51 और GST-FKBP52 । (ख)स्वीकारकर्ता मोतियों को एचएसपी90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड का युग्मन। (ग)जीएसटी-एफकेबीपी51 या जीएसटी-एफकेबीपी52 और एचएसएसपी90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड के बीच बातचीत की जांच कर रही परख । छोटे आणविक द्रव्यमान यौगिकों के साथ अवरोध। BioRender.com के साथ बनाया कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

हमारी परख में, जेड फैक्टर और एस/बी अनुपात क्रमशः ०.८२ और १३.३५ हैं, जोयहप्रदर्शित करते हैं कि हमारी परख उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए मजबूत और विश्वसनीय है । हम तो यह छोटे आणविक जन यौगिकों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया । चित्रा 3B एक चयनित छोटे अणु (D10) के साथ chaperone-cochaperone बातचीत की खुराक पर निर्भर अवरोध प्रस्तुत करता है । D10 के लिए खुराक-प्रतिक्रिया घटता nonlinear प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा उत्पन्न होते हैं, जिसके आधार पर आईसी50 के मूल्यों की गणना की जाती है। D10 Hsp90 पर खुराक-निर्भर अवरोध दिखाता है - जीएसटी-एफकेबीपी51 और एचएसपी90 - जीएसटी-एफकेबीपी52 पीपीआई। लेकिन आईसी50 के मूल्य अलग हैं: Hsp90 के लिए इसका आईसी50 - जीएसटी-एफकेबीपी51 इंटरैक्शन 65 एनएम है, जबकि, एचएसपी 90 के लिए - जीएसटी-एफकेबीपी52 इंटरैक्शन, उच्चतम यौगिक एकाग्रता (100 माइक्रोन एम) के साथ पूर्ण अवरोध प्राप्त नहीं किया गया था, इसके आईसी50 को 30 माइक्रोन एम > होने का अनुमान है। ये परिणाम इस बात का सबूत देते हैं कि एचएसपी 90-एचकेबीपी51 या एचएसपी 90-एफकेबीपी52 पीपीआई के छोटे अणुओं के साथ चयनात्मक अवरोध प्राप्त किया जा सकता है (FKBP51 और FKBP52 के टीपीआर डोमेन में 60% अनुक्रम पहचान और 80% अनुक्रम समानता > है), और इस परख को इस स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है।

Figure 3
चित्र 3:परख विश्लेषण और परिणाम। (A)Z' कारक और संकेत से पृष्ठभूमि (S/B) इस परख का अनुपात । डेटा 48 कुओं से (1) सकारात्मक नियंत्रण (एचएसपी 90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड, 30 माइक्रोएम) और (●) नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ) के संकेतों का प्रतिनिधित्व करता है। आंकड़ों की इन दो आबादी से 0.82 के जेड मूल्य और 1335 के एस/बी अनुपात की गणना की गई थी। (ख)इस परख में FKBP51 (●) या FKBP52 (1) के साथ Hsp90 की बातचीत पर चयनित यौगिक (D10) का अवरोध । D10 Hsp90-FKBP51 या Hsp90-FKBP52 खुराक-निर्भर रोकता है । इसका आईसी50 Hsp90-FKBP51 इंटरैक्शन के लिए 65 एनएम है लेकिन Hsp90-FKBP52 इंटरैक्शन के लिए 30 माइक्रोन से ऊपर है। डेटा को नियंत्रण समूह में सामान्यीकृत किया जाता है और एसईएम ± साधन के रूप में व्यक्त किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

रिएक्शन कंपोनेंट वॉल्यूम (माइक्रोन)
पीसीआर बफर (5 x ध्यान केंद्रित) 4
फॉरवर्ड प्राइमर 1
रिवर्स प्राइमर 1
प्लाज्मिड 0.5
डीएनटीपी मिश्रण (प्रत्येक 10 mM) 0.5
फुसियन डीएनए पॉलीमरेज 0.5
पानी (डीएनए ग्रेड) 12.5
कुल 20

तालिका 1: मानव FKBP51 और FKBP52 डीएनए प्रवर्धन के लिए स्थापित पीसीआर प्रतिक्रिया।

मंच तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय चक्र
प्रारंभिक विकृति 94 3 मिनट 1
डेनैचेशन 94 30 सेकंड 35
एनीलिंग 56 30 सेकंड
विस्तार 72 1 मिनट
अंतिम विस्तार 72 5 मिनट 1
नोट: ढक्कन का तापमान 105 डिग्री सेल्सियस है।

तालिका 2: मानव FKBP51 और FKBP52 डीएनए प्रवर्धन के लिए थर्मोसाइलर की स्थिति।

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Discussion

यहां हम एचएसपी 90 और टीपीआर-आकृति सह-चैपरनेस, विशेष रूप से FKBP51 और FKBP52 के बीच बातचीत को बाधित करने वाले छोटे अणुओं की स्क्रीनिंग के लिए परख का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसका उच्च जेड स्कोर (>0.8) एक उच्च थ्रूपुट प्रारूप के लिए मजबूती और विश्वसनीयता को दर्शाता है। परिणाम एक घंटे के भीतर प्राप्त किया जा सकता है, और मोती, प्रोटीन और यौगिकों की छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को आसानी से किसी भी Hsp90/Hsp70-TPR-आकृति सह-ब्याज की बातचीत के लिए बढ़ाया जा सकता है । एचएसपी90 के कई टीपीआर-मोटिफ सह-चैपरोन्स को अल्जाइमर रोग से लेकर ऑटोइम्यून रोगों, कैंसर आदि के विभिन्न मानव विकारों में फंसाया गया है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल उच्च चिकित्सा महत्व के चैपरोन-कोचपेरोन इंटरैक्शन को बाधित करने वाले छोटे अणुओं की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक इन विट्रो मजबूत और सस्ती परख प्रदान करता है।

इसके अलावा, टीपीआर डोमेन को लक्षित करने वाली दवाओं और Hsp90 के साथ बातचीत को बाधित करने के लिए न केवल लक्ष्य के प्रति उनकी आत्मीयता के लिए बल्कि अन्य टीपीआर-आकृति प्रोटीन के प्रति उनकी चयनशीलता के लिए भी मूल्यांकन किया जाना चाहिए । मानव जीनोम 20 टीपीआर आकृति प्रोटीन > को कूटता है जो Hsp90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड के साथ बातचीत करने में सक्षम है। ग्लूटाथिएक मोतियों और जीएसटी-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग करने वाला यह परख कई बाध्यकारी टीपीआर भागीदारों पर दवा प्रभाव के आकलन की अनुमति देता है। हमारी प्रयोगशाला में उनके जीएसटी-टैग किए गए रूप में 20 मानव टीपीआर प्रोटीन की एक लाइब्रेरी है और परीक्षण किए गए हर छोटे अणु के लिए आत्मीयता और चयनता प्रोफाइल प्राप्त कर सकती है।

यह पहले दिखाया गया है कि Hsp90 और TPR सह-chaperones के बीच पीपीआई Hsp90 के सी-टर्मिनल पेप्टाइड द्वारा मध्यस्थता की जाती है; Hsp90 सी-टर्मिनस का विलोपन टीपीआर-मोटिफ सह-चैपरनेस 6 के बंधन को पूरीतरहसे समाप्त करता है । हमने पाया है कि हमारे परख में कुशल यौगिकों जहां Hsp90 सी टर्मिनल पेप्टाइड का इस्तेमाल किया गया था भी एक पुल में जीएसटी के साथ पूर्ण लंबाई Hsp90 की बातचीत को बाधित करने में सक्षम थे-FKBP51/52 एक पुल नीचे परख में ग्लूटाथिएक सेफ्रोज मोती (डेटा नहीं दिखाया) का उपयोग कर । चयनित यौगिकों में से कुछ भी सतह प्लाज्मन अनुनाद प्रौद्योगिकी द्वारा FKBP51 के साथ बाध्यकारी लगाव दिखाते हैं, और उनके विशिष्ट बाध्यकारी सह क्रिस्टलीकरण द्वारा निर्धारित साइटों वर्तमान में जांच के अधीन हैं ।

हमारे प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम इसके अलावा का क्रम है; हम पहले एक छोटे से अणु और उसके टीपीआर लक्ष्य के बीच एक जटिल बनाते हैं। यदि FKBP51 और Hsp90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड के बीच परिसरों का गठन पहले ही किया जा चुका है, तो पीपीआई को तोड़ने के लिए अब इनक्यूबेशन गुना और उच्च दवा यौगिक सांद्रता की आवश्यकता होती है। यह ज्यादातर संपर्क की साइट के लिए अणुओं की मनका सीमित पहुंच की स्टेरिक बाधा के कारण है ।

क्रमशः दाता और स्वीकार्य मोतियों को टीपीआर प्रोटीन और एचएसपी 90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड्स को सहसंयोजक रूप से जोड़ा जाना संभव है, और सीधे पीपीआई की जांच करें। हालांकि, बातचीत के गतिज को प्रभावित करने वाले समाधान में अणुओं के कम आंदोलन के कारण मोतियों के लिए दोनों बाध्यकारी भागीदारों को सहसंयोजक रूप से संलग्न करने की सिफारिश नहीं की जाती है। इससे मनका का आकार बढ़ने के कारण स्टरिक बाधक का खतरा भी बढ़ जाता है। इसलिए, हम Hsp90 सी-टर्मिनल पेप्टाइड और ग्लूटाथिएक दाता मोतियों के साथ मिलकर स्वीकारकर्ता मोतियों का चयन करते हैं जो हमारी परख में जीएसटी-टैग किए गए प्रोटीन के साथ बातचीत कर रहे हैं, जहां कई टीपीआर भागीदारों का आकलन किया जा सकता है।

इस परख में, यह संभव है कि कुछ पहचाने गए यौगिक परख प्रौद्योगिकी के साथ उनके हस्तक्षेप के कारण झूठे-सकारात्मक हो सकते हैं, जैसे कि सिंगलेट ऑक्सीजन बुझाना, प्रकाश को बुझाना और प्रकाश बिखरने। ग्लूटाथिएक डोनर मोतियों के साथ जीएसटी टैग के बाइंडिंग को बाधित करके भी झूठे-सकारात्मक परिणाम प्रेरित किए जा सकते हैं। चुनिंदा अवरोधकों की पहचान करने के लिए Hsp90-FKBP51 और Hsp90-FKBP52 पीपीआई दोनों पर अणुओं की स्क्रीनिंग करते समय इन झूठे-सकारात्मक परिणामों से बचा जा सकता है। चयनित अवरोधकों को सत्यापित करने के लिए पीपीआई का पता लगाने के अन्य तरीकों को भी लागू किया जाना चाहिए।

हमारी परख की सीमा यह है कि इसका उपयोग कच्चे जैविक नमूनों जैसे सेल lysates में Hsp90 और TPR-आकृति सह-chaperones के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए नहीं किया जा सकता है । उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के बाद, जैविक नमूनों में Hsp90-TPR-आकृति सह-chaperones पीपीआई पर चयनित यौगिकों के संकोच को सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन और निकटता लिगेशन परख जैसे अन्य तरीकों से सत्यापित करने की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस अध्ययन स्वीडिश अनुसंधान परिषद (2018-02843), ब्रेन फाउंडेशन (Fo 2019-0140), कारोलिंस्का इंस्टीट्यूट, गनवर और जोसेफ एनर्स फाउंडेशन, मैग्नस बर्गवेल्स फाउंडेशन, गन और बर्टिल स्टोहन्स फाउंडेशन, चिकित्सा अनुसंधान के लिए फाड़ निल्सन फाउंडेशन, मार्गरेटा अफग्ग्लास फाउंडेशन और फाउंडेशन में बुढ़ापे की बीमारियों के लिए फाउंडेशन द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plates Perkin Elmer 6008350 Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit Millipore UFC901008 Concentrate protein
Ampicillin Sigma A0166 Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010 Heidolph Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51 Source BioScience clone id: 5723416 pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52 Source BioScience clone id: 7474554 pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli Invitrogen C602003 One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software GraphPad Prism 9.0.0 Analysis data and make figures
Data analysis software Excel Analysis data
DMSO Supelco 1.02952.1000 Dilute compounds
DPBS Gibco 14190-144 Prepare solution
EDTA Calbiochem 344504 Prevent proteolysis during sonication
Glutathione Sigma G-4251 Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads Perkin Elmer 6765300 Donor bead
GST-trap column Cytiva (GE Healthcare) 17528201 Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside Thermo Fisher Scientific R0392 Induce protein expression
LB Broth (Miller) Sigma L3522 Microbial growth medium
PCR instrument BIO-RAD S1000 Thermal Cycler Amplification/PCR
PD-10 column Cytiva (GE Healthcare) 17085101 Solution exchange
pGEX-6P-1 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954648 Plasmid
pGEX-6P-2 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954650 Plasmid
Plate reader Perkin Elmer EnSpire 2300 Multilabel Reader Read alpha plate
Plate reader software Perkin Elmer EnSpire Manager Plate reader software
Plate reader software protocol Perkin Elmer Alpha 384-well Low volume Use this protocol to read plate
PMSF Sigma P7626 Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail Sigma S8830 Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide Sigma S2002 As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma 156159 Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform Peptide 2.0 inc Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator LABINCO Make end-over-end agitation
Tris-HCl Sigma 10708976001 Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20 Sigma P1379 Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP Beckman Coulter Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor Microson Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads Perkin Elmer 6762003 Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Invitrogen EI0002 SDS-PAGE

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References

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Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R., Winblad, B., Pavlov, P. F. Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. Exp. (173), e62762, doi:10.3791/62762 (2021).

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