Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Studier av Chaperone-Cochaperone interaksjoner ved hjelp av homogen perlebasert analyse

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62762
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1
1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

Summary

Denne protokollen presenterer en teknikk for å undersøke proteinproteininteraksjoner ved hjelp av glutathione-tilknyttede donorperler med GST-smeltet TPR-motiv co-chaperones og akseptorperler kombinert med et Hsp90-avledet peptid. Vi har brukt denne teknikken til å screene små molekyler for å forstyrre Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaksjoner og identifisert potente og selektive Hsp90-FKBP51 interaksjonshemmere.

Abstract

Målretting av varmesjokkproteinet 90 (Hsp90)-cochaperone interaksjoner gir mulighet til å spesifikt regulere Hsp90-avhengige intracellulære prosesser. Den konserverte MEEVD pentapeptide på C-terminus av Hsp90 er ansvarlig for samspillet med tetratricopeptide repeat (TPR) motiv av co-chaperones. FK506-bindende protein (FKBP) 51 og FKBP52 er to lignende TPR-motiv co-chaperones involvert i steroidhormonavhengige sykdommer med forskjellige funksjoner. Derfor gir identifisering av molekyler som spesifikt blokkerer interaksjoner mellom Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52 et lovende terapeutisk potensial for flere menneskelige sykdommer. Her beskriver vi protokollen for en forsterket luminescerende nærhet homogen analyse for å sondere interaksjoner mellom Hsp90 og partnerkollegaene FKBP51 og FKBP52. For det første har vi renset TPR-motivholdige proteiner FKBP51 og FKBP52 i glutathione S-transferase (GST)-merket form. Ved hjelp av glutathione-tilknyttede donorperler med GST-smeltet TPR-motivproteiner og akseptorperler kombinert med et 10-mer C-terminal peptid av Hsp90, har vi undersøkt proteinproteininteraksjoner i et homogent miljø. Vi har brukt denne analysen til å screene små molekyler for å forstyrre Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaksjoner og identifisert potente og selektive Hsp90-FKBP51 interaksjonshemmere.

Introduction

Molekylære anstander bidrar til protein homeostase, inkludert proteinfolding, transport og nedbrytning. De regulerer flere cellulære prosesser og er knyttet til mange sykdommer som kreft og nevrodegenerative sykdommer1. Varmesjokkprotein 90 (Hsp90) er en av de viktigste anstandene hvis funksjon er avhengig av konformasjonsendringer drevet av ATP hydrolyse og binding med klientproteiner mediert av sine medprester2. Til tross for et åpenbart potensial for Hsp90 som terapeutisk mål, representerer finjustering av funksjonen en stor utfordring. Det er flere Hsp90-hemmere rettet mot N-terminal ATP-bindingsregionen, som har blitt evaluert i kliniske studier, men ingen av dem er godkjent for markedsføring3. På grunn av mangelen på en veldefinert ligandbindingslomme4, har målretting av C-terminalområdet Hsp90 hatt begrenset suksess4. Nylig har forstyrrelse av Hsp90-cochaperone interaksjoner av små molekyler blitt undersøkt som en alternativ strategi5. Målretting av Hsp90-cochaperone interaksjoner ville ikke fremkalle generell celle stress respons og gir mulighet til å spesifikt regulere ulike intracellulære prosesser. Den konserverte MEEVD pentapeptide på C-terminus av Hsp90 er ansvarlig for samspillet med tetratricopeptide repeat (TPR) motiv av co-chaperones6. Av de 736 TPR-motivholdige proteinene som er kommentert i den menneskelige proteindatabasen, samhandler ~ 20 forskjellige proteiner med Hsp90 via dettepeptidet 7. Molekyler som konkurrerer om MEEVD peptidbinding vil forstyrre interaksjonene mellom Hsp90 og medprester som inneholder et TPR-domene. Peptidbindingsstedet har lignende tertiær struktur, men den generelle homologien mellom forskjellige TPR-motivdomener er relativt lav7, noe som gir en mulighet til å identifisere molekyler som er spesielt i stand til å blokkere interaksjoner mellom Hsp90 og spesielle TPR-motiv co-chaperones. Blant disse TPR-motiv co-chaperones, FK506-bindende protein (FKBP) 51 og FKBP52 er regulatorer av steroid hormon reseptor (SHR) signalering og involvert i flere steroidhormonavhengige sykdommer inkludert kreft, stress-relaterte sykdommer, metabolske sykdommer, og Alzheimers sykdom8. Selv om FKBP51 og FKBP52 deler > 80% sekvenslikhet, varierer deres funksjoner: FKBP52 er en positiv regulator for SHR-aktivitet, mens FKBP51 er en negativ regulator i de fleste tilfeller8. Derfor gir identifisering av molekyler, spesielt blokkering av interaksjoner mellom Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52, et lovende terapeutisk potensial for relaterte sykdommer.

Enmplified Luminescent Proximity Homogen Assay (AlphaScreen) ble først utviklet i 1994 av Ullman EF et al.9. Nå er det mye brukt til å oppdage forskjellige typer biologiske interaksjoner, for eksempel peptid10, protein11, DNA12, RNA13og sukker14. I denne teknikken er det to typer perler (diameter 200 nm), den ene er donorperlen og den andre er akseptorperlen. Biomolekylene er immobilisert på disse perlene; deres biologiske interaksjoner bringer donor- og akseptorperler i nærheten. Ved 680 nm lyser en fotosensibilisator i donorperlen og konverterer oksygen til singlet oksygen. Fordi singlet oksygen har kort levetid, kan det bare diffusere opptil 200 nm. Hvis akseptorperlen er i nærheten, reagerer dets tioksenderivat med singlet oksygengenererende chemiluminescens ved 370 nm. Denne energien aktiverer videre fluoroforer i samme akseptorperle for å avgi lys ved 520-620 nm15. Hvis de biologiske interaksjonene blir forstyrret, kan ikke akseptorperlen og donorperlen nå nærhet, noe som resulterer i singlet oksygenforfall og lavt produsert signal.

Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av denne teknikken for screening av små molekyler som hemmer interaksjoner mellom Hsp90 og TPR co-chaperones, spesielt FKBP51 og FKBP52. De 10 aminosyre lange peptidene som tilsvarer Hsp90 ekstrem C-terminus er festet til akseptorperler. Renset GST-merket TPR co-chaperones samhandler med glutathione-tilknyttede donorperler. Når samspillet mellom Hsp90-avledede peptider og TPR-motiv co-chaperones bringer perlene sammen, produseres et forsterket signal (Figur 1A). Hvis de screenede små molekylene kan hemme interaksjonene mellom Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones, vil dette forsterkede signalet bli redusert (Figur 1B). Deres IC50 kan beregnes ved kvantitativ måling. Denne protokollen kan utvides til enhver anstand - TPR-motiv co-chaperone interaksjoner av interesse og er av stor betydning i utviklingen av nye molekyler, spesielt blokkerer samspillet mellom Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52.

Figure 1
Figur 1: Det grunnleggende prinsippet i denne analysen. (A) Renset GST-FKBP51 samhandler med glutathione-tilknyttede donorperler. De 10 aminosyre lange peptidene som tilsvarer den ekstreme C-terminus av Hsp90 er festet til akseptorperler. Samspillet mellom Hsp90-avledede peptider og TPR-domenet til FKBP51 bringer donor- og akseptorperlene i nærheten. Ved 680 nm lyser en fotosensibilisator i donorperlen og konverterer oksygen til singlet oksygen. Tioksenderivatet på akseptorperlen reagerer med singlet oksygen og genererer chemiluminescens ved 370 nm. Denne energien aktiverer videre fluoroforer i samme akseptorperle for å avgi lys ved 520-620 nm. (B) Når små molekyler hemmer interaksjonene mellom Hsp90 og FKBP51, kan donor- og akseptorperler ikke nå nærhet. Deretter forfaller singlet oksygen med kort levetid, og det produseres ikke noe påviselig signal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: En oversikt over denne protokollen vises i figur 2.

1. Uttrykk og rensing av GST-FKBP51 og GST-FKBP52 (Figur 2A)

  1. Plasmider
    MERK: Få cDNA-kloner for humant FKBP51 (klone-ID: 5723416) og for humant FKBP52 (klone-ID: 7474554) fra IMAGE-konsortiet.
    1. Forsterk det menneskelige FKBP51 DNA av PCR med primere (fremover; 5'GGATCCATGACTGATGAAGGT-3', omvendt; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') som inneholder BamHI og XhoI overheng og klone inn pGEX6-1 vektor på BamHI / XhoI restriksjonssteder.
    2. Forsterke det menneskelige FKBP52 DNA av PCR med primere (fremover; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', omvendt; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') som inneholder EcoRI og XhoI overheng og klone inn pGEX6-2 vektor på EcoRI / XhoI restriksjonssteder.
      MERK: PCR-reaksjonsoppsett og -betingelser vises i tabell 1 og tabell 2.
    3. Kontroller den innsatte sekvensen og transformer plasmidene til kjemisk kompetent E. coli i henhold til produksjonsprotokollen.
  2. Proteinuttrykk og rensing
    1. Tilsett 25 g Luria buljongbase (LB) i 1 L destillert vann for å lage LB-løsningen. Autoklaver den ved 121 °C i 15 minutter. Etter avkjøling tilsett 50 μg/ml ampicillin.
    2. Ta en koloni av bakterier som uttrykker GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 og bland med 500 μL LB-løsning i et 1,5 ml rør. Virvel.
    3. Tilsett blandingen av "1.2.2" i 1 L LB-løsning i Erlenmeyer-kolben dekket med en aluminiumsfolie. Inkuber Erlenmeyer-kolben i shakeren over natten ved 37 °C.
    4. Induser proteinuttrykk ved å legge til 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) til Erlenmeyer-kolben og fortsett inkubasjonen i ytterligere 2 timer.
    5. For å få cellepellets, sentrifuge på 5000 x g i 15 min. Fjern supernatanten.
      MERK: Cellepellets kan oppbevares ved -20 °C.
    6. Resuspend cellepellets i 40 ml PBS og soniker 3 x 20 s på is. Tilsett 1 mM PMSF, 1 mM EDTA og proteasehemmercocktail (1 tablett) for å forhindre proteolyse.
    7. Sentrifuger suspensjonen i 30 min 50 000 x g for å fjerne celleavfall og påfør supernatanten på 5 ml GST-fellekolonne.
    8. Etter å ha vasket kolonnen med 30 ml PBS, elute GST-FKBP51 og GST-FKBP52 med 5 ml 10 mM glutathione i PBS.
    9. Konsentrer proteiner på 15 ml 10.000 MWCO sentrifugeringsenhet. For å fjerne fri glutathione, pass konsentrater gjennom PD-10 kolonne likevektet med 0,5x PBS og igjen konsentrere seg om filteret sentrifuge enheten.
    10. Samle proteinholdige fraksjoner. Kontroller proteinene i SDS-PAGE og juster proteinkonsentrasjonene til 1 mg/ml.
      MERK: Typisk proteinutbytte er 2-5 mg/l kultur. Proteinet kan lagres ved -20 °C.

2. Kobling av Hsp90 C-terminalpeptid til akseptorperlene (Figur 2B)

  1. Hsp90 peptidpreparat
    1. Syntetiser ti aminosyrepeptid NH2-EDASRMEEVD-COOH tilsvarende aminosyrer 714-724 av human Hsp90 beta isoform (UniProt ID: P08238) ved en peptidsyntesetjeneste.
    2. Fortynn Hsp90-peptidet i PBS til 1 mg/ml konsentrasjon.
  2. Tilberedning av akseptorperler
    1. Fortynn de ukonjugede akseptorperlene i PBS til 1 mg/ml konsentrasjon og overfør til et 1,5 ml rør.
    2. Utfør vasking ved sentrifugering ved 16.000 x g i 15 min. Fjern forsiktig supernatanten.
  3. Bøyning
    1. Angi forholdet mellom perler og peptid som 10:1. I 1,5 ml rør som inneholder 1 mg akseptorperlepellet (fremstilt som beskrevet ovenfor), tilsett 1 ml PBS (pH 7,4), 0,1 mg fortynnet peptid, 1,25 μL Tween-20, 10 μL av en 400 mM oppløsning av natriumcyoborohydrid (NaBH3)i CNBH-
      FORSIKTIG: NaBH3CN er giftig; bruk en avtrekkshette og hansker. NaBH3CN-oppløsning bør tilberedes på nytt.
    2. Inkuber i 24 timer ved 37 °C med ende-over-ende-agitasjon (10-20 o/min) på en roterende shaker.
  4. Reaksjon slukking og perler vasking
    1. Tilsett 20 μL 1 M Tris-HCl (pH 8.0)-løsning på reaksjonen på blokker utilgjengelige steder. Inkuber i 1 time ved 37 °C.
    2. Sentrifuge ved 16 000 x g (eller maksimal hastighet) i 15 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og resuspend perlepellet i 1 ml Tris-HCl-oppløsning (100 mM, pH 8.0).
    3. Gjenta vasketrinnet tre ganger.
    4. Etter den siste sentrifugeringen, resuspend perlene ved 1 mg / ml i lagringsbuffer (1 ml 0,5 × PBS med 0,01% natriumazid som konserveringsmiddel). Oppbevar den konjugede akseptorperleløsningen ved 4 °C lysbeskyttet.
      FORSIKTIG: Natriumazid er giftig; bruk en avtrekkshette og hansker.

3. Analysen som undersøker samspillet mellom GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 og Hsp90 C-terminal peptid, og hemming med små molekylære masseforbindelser (Figur 2C)

  1. GST-taggede proteiner som samhandler med glutathione donorperler
    1. Sett opp reaksjonene i 384-brønnsplater.
    2. Forbered oppløsningen som inneholder 10 μg/ml glutathione donorperler i 0,5x PBS, pH 7,4.
      MERK: Etter langvarig lagring legger perlene seg ned og må virveliseres.
    3. Tilsett GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 i en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml.
    4. Inkuber i mørket ved 25 °C i 10 minutter.
      MERK: På dette trinnet vil GST-taggede proteiner samhandle med glutathione festet til perlene. For hver brønn vil 22,5 μL av denne blandingen bli brukt. Konsentrasjonen av bindende partnere må bestemmes empirisk. Titrate GST-FKBP51 og GST-FKBP52 og velg konsentrasjonen som gir det beste signalet.
  2. Sammensatt tillegg
    1. Lag serielle fortynninger av testforbindelser i DMSO.
      MERK: Konsentrasjonene som brukes er vanligvis 10, 30, 100, 300, 1000 og 3000 μM.
    2. Tilsett 0,25 μL DMSO (negativ kontroll) eller Hsp90 C-terminalpeptid (positiv kontroll, 30 μM) eller forbindelser i DMSO til hjørnet av hver brønn på platen. Bruk triplikater for hver sammensatt konsentrasjon.
    3. Tilsett 22,5 μL av løsningen som inneholder glutathione donorperler med GST-merkede proteiner til hver brønn.
    4. Rist platen forsiktig med hånden, men grundig. Inkuber i mørket ved 25 °C i 15 minutter.
      MERK: I løpet av denne tiden vil forbindelser samhandle med TPR-domenet på Hsp90 C-terminal peptidbindingsstedet.
  3. Tilsetning til akseptorperler
    1. Fortynn akseptorperlene med tilkoblet Hsp90 C-terminalpeptid til 100 μg/ml i 0,5x PBS.
    2. Tilsett 2,25 μL fortynnede akseptorperler til hver brønn.
    3. Bland forsiktig, men grundig. Inkuber i mørket ved 25 °C i 15 minutter.
      MERK: På dette trinnet bringes donor- og akseptorperler i nærheten av protein-peptidinteraksjonene. Det endelige volumet av reaksjonsblandingen er 25 μL. Derfor varierer de endelige konsentrasjonene av forbindelser fra 0,1 til 30 μM.
  4. Lesing av plater
    MERK: Les platen med en plateleser satt i relevant modus.
    1. Slå på instrumentet og åpne programvaren
    2. Velg den aktuelle protokollen.
    3. Klikk på Rediger platekart og velg brønnen som brukes i platen for måling.
    4. Klikk Neste for å fortsette og kjøre den valgte protokollen.
    5. Etter målingen klikker du Vis resultater for å vise resultater.
    6. Eksporter dataene.

4. Dataanalyse

  1. Z'-faktor og signal-til-bakgrunn-forhold (S/B)
    1. Beregn Z'-faktoren og S/B-forholdet for analysen ved hjelp av følgende ligning:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
      S/ B = μneg /μpos
      der σ og μ representerer standardavvikene og midlene til de positive (Hsp90 C-terminalpeptid, 30 μM) og negative (DMSO) kontrollene. En Z'-faktor > 0,5 vil sikre at analysen er robust nok til screening. For å overvåke analysefølsomheten er S/B-forholdet også beregnet.
  2. Doseresponskurve og IC 50
    MERK: Bruk ikke-lineær regresjonsanalyse for å passe til dataene til Hsp90-cochaperones PPI-hemmere av programvare.
    1. Opprett en XY-datatabell i dialogboksen Velkommen , og velg X-tall, og Y Angi 3 (hvis triplikater) replikerer verdier i sidestilte kolonner.
    2. Normaliser signaldataene for prøver til den negative kontrollgruppen. Importer konsentrasjonsverdier til X-kolonnen og signalverdiene til Y-kolonnen.
    3. Klikk Analyser, og velg Transformer konsentrasjon (X) under Transformer | Normaliser. Velg Transformer til Logaritmer.
      MERK: Dette vil forvandle konsentrasjonen til en loggskala. Hvis startkonsentrasjonen er null, setter du den til et svært lite tall som faktisk er null (f.eks. 0,1 nM) for ikke å miste disse verdiene siden logaritmen på null ikke er definert.
    4. Klikk Analyser , og velg Ikke-lineær regresjon (kurvetilpasning) under XY-analyser, åpne Dose-Response-Inhibition og velg Log(inhibitor) vs. response -- Variabel helling.
    5. Klikk OK for å vise resultatene (som inneholder KI50-verdien) og grafer.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk for denne protokollen. (A) Uttrykk og rensing av GST-FKBP51 og GST-FKBP52. (B) Kobling av Hsp90 C-terminal peptid til akseptorperlene. (C) Analysen som undersøker samspillet mellom GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 og Hsp90 C-terminalpeptid. Hemming med små molekylære masseforbindelser. Opprettet med BioRender.com Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vår analyse er Z'faktor og S/B-forholdet henholdsvis 0,82 og 13,35 (figur 3A), noe som viser at analysen vår er robust og pålitelig for screening med høy gjennomstrømning. Vi brukte den deretter til å screene små molekylære masseforbindelser. Figur 3B presenterer doseavhengig hemming av chaperone-cochaperone interaksjoner med et valgt lite molekyl (D10). Doseresponskurvene for D10 genereres ved ikke-lineær regresjonsanalyse, basert på hvilke verdiene til IC50 beregnes. D10 viser doseavhengig hemming både på Hsp90 - GST-FKBP51 og Hsp90 - GST-FKBP52 PPIer. Men verdiene til IC50 er forskjellige: dens IC50 for Hsp90 - GST-FKBP51 interaksjoner er 65 nM, mens for Hsp90 - GST-FKBP52 interaksjoner, ble fullstendig hemming ikke oppnådd med den høyeste sammensatte konsentrasjonen (100 μM), er IC50 anslått å være > 30 μM. Disse resultatene gir bevis på at selektiv hemming av Hsp90-HKBP51 eller Hsp90-FKBP52 PPIer med små molekyler kan oppnås (TPR-domener av FKBP51 og FKBP52 har 60% sekvensidentitet og > 80% sekvenslikhet), og denne analysen kan brukes til denne screeningen.

Figure 3
Figur 3: Analyse og resultater. (A) Z' faktor og signal-til-bakgrunn (S/B)-forhold for denne analysen. Data representerer signaler om (○) positiv kontroll (Hsp90 C-terminal peptid, 30 μM) og (●) negativ kontroll (DMSO) fra 48 brønner. En Z-verdi på 0,82 og et S/B-forhold på 13,35 ble beregnet fra disse to datapopulasjonene. (B) Hemming av valgt forbindelse (D10) på interaksjoner med Hsp90 med FKBP51 (●) eller FKBP52 (○) i denne analysen. D10 hemmer Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 doseavhengig. Dens IC50 er 65 nM for Hsp90-FKBP51 interaksjon, men over 30 μM for Hsp90-FKBP52 interaksjon. Data normaliseres til kontrollgruppen og uttrykkes som midler ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Reaksjonskomponent Volum (μL)
PCR-buffer (5 x konsentrat) 4
Fremoverprimer 1
Omvendt primer 1
Plasmid 0.5
dNTP-blanding (10 mM hver) 0.5
Phusion DNA polymerase 0.5
Vann (DNA-klasse) 12.5
Total 20

Tabell 1: PCR-reaksjon satt opp for human FKBP51 og FKBP52 DNA-forsterkning.

Stadium Temperatur (°C) Tid Sykluser
Innledende denaturering 94 3 min 1
Denaturering 94 30 sek 35
Annealing 56 30 sek
Forlengelse 72 1 min
Endelig utvidelse 72 5 min 1
Merk: Lokktemperaturen er 105 °C.

Tabell 2: Termocylerforhold for human FKBP51 og FKBP52 DNA-forsterkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av analysen for screening av små molekyler som hemmer interaksjoner mellom Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones, spesielt FKBP51 og FKBP52. Den høye Z-poengsummen (>0,8) demonstrerer robustheten og påliteligheten for et format med høy gjennomstrømning. Resultatene kan oppnås innen en time, og små mengder perler, protein og forbindelser er nødvendig. Videre kan denne protokollen enkelt utvides til enhver Hsp90 / Hsp70 - TPR-motiv co-chaperone interaksjoner av interesse. Flere TPR-motiv co-chaperones av Hsp90 har vært involvert i ulike menneskelige lidelser som spenner fra Alzheimers sykdom til autoimmune sykdommer, kreft, etc. Protokollen beskrevet her gir en in vitro robust og billig analyse for høy gjennomstrømning screening av små molekyler hemmende chaperone-cochaperone interaksjoner av høy medisinsk betydning.

I tillegg må legemidler rettet mot TPR-domener og hemmende interaksjon med Hsp90 vurderes ikke bare for deres affinitet mot målet, men også for deres selektivitet mot andre TPR-motivproteiner. Det menneskelige genomet koder > 20 TPR-motivproteiner som er i stand til å samhandle med Hsp90 C-terminalpeptidet. Denne analysen ved hjelp av glutathione perler og GST-taggede proteiner gjør det mulig å vurdere legemiddeleffekten på flere bindende TPR-partnere. Vårt laboratorium har et bibliotek med 20 humane TPR-proteiner i sin GST-taggede form og kan oppnå affinitets- og selektivitetsprofiler for hvert lite molekyl som testes.

Det har tidligere vist seg at PPI mellom Hsp90 og TPR co-chaperones er mediert av C-terminal peptid av Hsp90; sletting av Hsp90 C-terminus fullstendig avskaffer bindingen av TPR-motiv co-chaperones6. Vi har funnet ut at forbindelser som er effektive i vår analyse der Hsp90 C-terminalpeptid ble brukt, også var i stand til å hemme samspillet mellom Hsp90 i full lengde med GST-FKBP51/52 i en pull-down analyse ved hjelp av glutathione sepharoseperler (data ikke vist). Noen av de valgte forbindelsene viser også bindingsaffiniteten med FKBP51 ved overflateplasmonresonansteknologi, og deres spesifikke bindingssteder bestemt av co-krystallisering er for tiden under etterforskning.

Et kritisk skritt i vår protokoll er rekkefølgen på tillegget; vi danner først et kompleks mellom et lite molekyl og dets TPR-mål. Hvis komplekser mellom FKBP51 og Hsp90 C-terminal peptid allerede er dannet, kreves det lengre inkubasjonstider og høyere konsentrasjoner av legemiddelforbindelser for å bryte PPIene. Dette skyldes for det meste den steriske hindringen av perle som begrenser tilgangen til molekyler til interaksjonsstedet.

Det er mulig å kovalent parre TPR-proteiner og Hsp90 C-terminalpeptider til henholdsvis donor- og akseptorperler, og direkte sondere PPIer. Det anbefales imidlertid ikke å kovalent feste begge bindende partnere til perlene på grunn av redusert bevegelse av molekyler i løsning som påvirker kinetikken til interaksjonene. Dette øker også risikoen for sterisk hindring på grunn av perlestørrelsen. Derfor velger vi akseptorperler kombinert med Hsp90 C-terminal peptid og glutathione donorperler som samhandler med GST-merkede proteiner i vår analyse, hvor flere TPR-partnere kan vurderes.

I denne analysen er det sannsynlig at noen identifiserte forbindelser kan være falske positive på grunn av deres interferens med analyseteknologien, for eksempel slukkende singlet oksygen, slukkelys og spredningslys. Falske positive resultater kan også induseres ved å forstyrre bindingen av GST-taggen med glutathione donorperler. Disse falske positive resultatene kan unngås ved screening av molekyler både på Hsp90-FKBP51 og Hsp90-FKBP52 PPIer for å identifisere selektive hemmere. Andre metoder som oppdager PPIer bør også brukes for å verifisere de valgte inhibitorene.

Begrensningen i analysen vår er at den ikke kan brukes til å oppdage samspillet mellom Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones i rå biologiske prøver, for eksempel cellelysater. Etter screening av høy gjennomstrømning må hemningene av utvalgte forbindelser på Hsp90 - TPR-motiv co-chaperones PPI i biologiske prøver verifiseres ved andre metoder, for eksempel co-immunoprecipitation og nærhet ligation assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere rapporterer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av tilskudd fra Det svenske forskningsrådet (2018-02843), Brain Foundation (Fo 2019-0140), Foundation for Geriatric Diseases ved Karolinska Institutet, Gunvor og Josef Anérs Foundation, Magnus Bergvalls Foundation, Gun og Bertil Stohnes Foundation, Tore Nilssons Foundation for medisinsk forskning, Margaretha af Ugglas foundation og Foundation for Old Servants.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plates Perkin Elmer 6008350 Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit Millipore UFC901008 Concentrate protein
Ampicillin Sigma A0166 Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010 Heidolph Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51 Source BioScience clone id: 5723416 pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52 Source BioScience clone id: 7474554 pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli Invitrogen C602003 One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software GraphPad Prism 9.0.0 Analysis data and make figures
Data analysis software Excel Analysis data
DMSO Supelco 1.02952.1000 Dilute compounds
DPBS Gibco 14190-144 Prepare solution
EDTA Calbiochem 344504 Prevent proteolysis during sonication
Glutathione Sigma G-4251 Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads Perkin Elmer 6765300 Donor bead
GST-trap column Cytiva (GE Healthcare) 17528201 Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside Thermo Fisher Scientific R0392 Induce protein expression
LB Broth (Miller) Sigma L3522 Microbial growth medium
PCR instrument BIO-RAD S1000 Thermal Cycler Amplification/PCR
PD-10 column Cytiva (GE Healthcare) 17085101 Solution exchange
pGEX-6P-1 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954648 Plasmid
pGEX-6P-2 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954650 Plasmid
Plate reader Perkin Elmer EnSpire 2300 Multilabel Reader Read alpha plate
Plate reader software Perkin Elmer EnSpire Manager Plate reader software
Plate reader software protocol Perkin Elmer Alpha 384-well Low volume Use this protocol to read plate
PMSF Sigma P7626 Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail Sigma S8830 Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide Sigma S2002 As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma 156159 Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform Peptide 2.0 inc Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator LABINCO Make end-over-end agitation
Tris-HCl Sigma 10708976001 Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20 Sigma P1379 Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP Beckman Coulter Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor Microson Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads Perkin Elmer 6762003 Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Invitrogen EI0002 SDS-PAGE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
  3. Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
  4. Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
  5. Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
  6. Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
  7. Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
  8. Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
  9. Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
  10. Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
  11. Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
  12. Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
  13. Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
  14. Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
  15. Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021).
  16. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Tags

Biokjemi Utgave 173 AlphaScreen proteinproteininteraksjoner molekylær anstand Hsp90 FKBP51 FKBP52 TPR-proteiner sammensatt screening
Studier av Chaperone-Cochaperone interaksjoner ved hjelp av homogen perlebasert analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R.,… More

Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R., Winblad, B., Pavlov, P. F. Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. Exp. (173), e62762, doi:10.3791/62762 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter