Manuel blot-og-plunge frysning af biologiske prøver til enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi

Den manuelle kastemetode, der er beskrevet her, er en omkostningseffektiv og pålidelig metode til fremstilling af prøver til transmissionselektronmikroskopi. I denne video vil vi demonstrere, hvordan du opsætter det manuelle stempel, forbereder cryogen og udfører manuel blotting og kaste af EM-gitre. Forbered det manuelle kastemiljø.

Denne procedure skal udføres i et koldt rum, der opretholdes ved 40 grader Celsius med fugtighed på mere end 95%Vi anbefaler at bruge de materialer, der vises her og som beskrevet i onlineprotokollen til manuel blotting og kaste. Forbered cryogen Dewar og Manuel Stemplet. For at samle cryogen Dewar skal du først installere platformbasen i bunden af den blå styrofoam Dewar, hvilket sikrer, at den er flad og jævn.

Placer derefter ethanbeholderholderen oven på perronbasen, og sæt messingethanbeholderen. Endelig placere spinning gitter opbevaring platform. Find derefter den kastede Dewar til bunden af det manuelle stempel.

Centrer ethanbeholderen under den faldende arm og fastgør den kastende Dewar til basen. For at indstille den manuelle kastehøjde skal du først fastgøre nyt tape til bunden af den faldende arm. Derefter fastgøres et par fastspændings pincet ved sikkert at vikle båndet rundt om den faldende arm og pincetbasen.

Sørg for, at pincet er fast fastgjort ved at trykke på dem let. Hold den faldende arm og sænk langsomt pincet ind i messing ethanbeholderen ved at trykke fodpedalen. Juster placeringen af den kastede Dewar, så pincet lokalisere til midten af messing ethan fartøj.

Pincetens spidser må ikke komme i kontakt med størrelsen eller bunden af messingethanbeholderen for at undgå skader på pincet og manuelt stempel. Når positionen er indstillet, skal du nulstille den manuelle kastearm. Gør Cryogen klar.

Cryogen-forberedelse skal udføres i et godt ventileret rum, og der skal til enhver tid bæres ordentlige personlige værnemidler. Til at begynde med, dårlig flydende nitrogen direkte ind i den kasteDe Dewar, stopper, når det flydende nitrogen niveau når toppen af messing ethan fartøj. Systemet skal være koldt nok til at fortsætte, efter at det flydende nitrogen holder op med at boble voldsomt.

Det tager cirka fem minutter. Ethan kommer som en komprimeret gas og skal kondenseres. For at indstille gasstrømmen til optimal ethankondensering skal spidsen af ethangasledningen indsættes i et 250 mil bægervand og observere boblen.

Gasstrømmen skal producere en lind strøm af bobler, der ikke voldsomt forstyrrer vandets overflade. For at begynde at kondensere ethan skal du placere spidsen af ethangasledningen i bunden af messingethanbeholderen. Rør langsomt metalspidsen og begynd at flydende ethanen.

Så snart ethanen begynder at køle af, vil den lave en hørbar lyd. Fyld messing ethanbeholderen til tre fjerdedele fulde af flydende ethan. Top off den kasteDejerne med flydende nitrogen, så den rører messingethanbeholderen, men ikke spilder ind i den.

Tilsætning af flydende nitrogen er nødvendig for ensartet ethanfrysning. Placer skumlåget på den blå kaste Dewar, og lad ethanen til fuldt størkne. Genstart ethangasstrømmen, og placer forsigtigt spidsen af gasledningen i den faste ethan.

Det er vigtigt at placere spidsen lodret ind i beholderen og dispensere ethan i bunden. Rør langsomt metalspidsen for at smelte ethanen og bringe niveauet af flydende ethan op til toppen af beholderen. Luk låget i ca. et minut og lad ethanen størkne rundt om messingbeholderens kanter, indtil to til tre millimeter fast ethan er synlige.

Ethanen er nu ved en temperatur, der er ideel til frysning af biologiske prøver. Fastgør den kastende Dewar forsigtigt til bunden af det manuelle stempel. Fastgør et par fastspænding pincet ved sikkert indpakning båndet omkring kaste arm og pincet base.

Hold den faldende arm og sænk langsomt pincet ind i den flydende ethan ved at trykke fodpedalen. Juster placeringen af den kastede Dewar, så pincet lokaliserer til midten af den flydende ethan, så du undgår kontakt med den faste ethanring. Forbered kastematerialer og tilbehør.

Forbered blotting papir ved at skære hver cirkulære filter papir i ca en centimeter brede strimler. Undgå at røre midten af blotting papir og kassere de mindre ende stykker. Det er vigtigt at sikre, at blotting papirstrimlerne er tørre, rene og fri for forurenende stoffer.

Før du kaster, placere gitter kasser i kaste Dewar i de rette slots. Sørg for, at gitteret dækker vores frie til at rotere. Forbered CryoEM-prøver ved frysning af dyk.

På grund af mangfoldigheden af gitter- og gitterpræparater skal du følge anbefalede protokoller for at gøre gitrene hydrofile. For at håndtere gitrene korrekt skal du bruge rene, tørre fastspændings pincet til at afhente de hydrofile gitre ved den ydre ring. Skub plastikklemmen for at fastgøre gitteret, og tryk forsigtigt på pincet for at sikre, at gitteret er korrekt fastspændt.

Påfør tre mikroliter af prøve på forsiden af gitteret, der holdes i spændet pincet. Fastgør pincet fast på den manuelle kastearm ved at vikle båndet rundt om pincetbasen. Prøven er nu klar til at blive renset og kastet frosset.

Hold hver ende af en ren strimmel blotting papir mellem dine pegefingre og tommelfingre. Hvil hænderne på kanten af den kastede Dewar for at etablere en stabil position. Blottingpapiret skal være ca. en centimeter fra gitterets overflade.

Bøj blottingpapiret, indtil midten kontakter gitteret. Det er vigtigt, at blottingpapiret er parallelt med gitteroverfladen for at give mulighed for jævn kontakt og for at forhindre gitterskader. Når den mobile væskefront holder op med at sprede sig, skal du begynde at tælle.

Blot nettet i fem sekunder. Knips fingrene fra hinanden, spænd blottingpapiret og fjern det hurtigt fra gitterets overflade. Tryk samtidig på fodpedalen for at slippe den manuelle kastearm og kaster pincet, der holder gitteret ind i den flydende ethan.

Hold det friskfrosne gitter i den flydende ethan, tag forsigtigt pincet fra den manuelle kastearm. Forsigtigt un-klemme pin pincet så gitteret er aftageligt. Flyt gitteret ind i det flydende nitrogenbeholder under messingethanbeholderen med en hurtig bevægelse fra ethanen til det flydende nitrogen.

Placer gitteret i gitterboksen. repræsentative resultater. Fra denne video, bør forskerne være i stand til at forberede CryoEM gitre, som denne, med mange kvadrater, der indeholder tynde film af glasagtig is til høj opløsning billeddannelse.

Prøvekoncentrationen og blottingtiden kan justeres for at optimere partikeltætheden. Her vil vi demonstrere den fulde arbejdsgang for frysning af CryoEM-prøver ved hjælp af blot- og plunge-metoden. Brug en ren fastspænding pincet til at afhente et nyt gitter og sikre nettet på plads.

Påfør tre mikroliter af prøven på den hydrofile side af nettet og fastgør pincet på den manuelle kastearm ved at vikle båndet rundt om pincethåndtaget. Placer blottingpapiret parallelt med gitteroverfladen, og bøj forsigtigt blottingpapiret mod gitteret for at starte blotting. Efter den ønskede tid, flytte blotting papir i en snapping bevægelse væk fra gitteret overfladen, mens deprimerende fodpedalen til at frigive den faldende arm, kaster gitteret ind i den flydende ethan.

Slap forsigtigt af båndet fra omkring pincet og den manuelle kastearm. Med en hurtig bevægelse overføres gitteret hurtigt fra ethanbeholderen til det flydende nitrogenbeholder. Placer gitteret i gitterets opbevaringsboks, og pak pincet ind i en Kim Wipe til tør;gentag.