Summary
이 백서는 Cryo-EM 실험을 위한 플런지 동결 전에 70°C의 높은 온도에서 샘플 그리드를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
초저온 전자 현미경(Cryo-EM) 실험을 위한 샘플 그리드는 일반적으로 생물학적 시료 보관에 최적의 온도(대부분 4°C, 때로는 실온)에서 준비됩니다. 최근에 우리는 저온에서 해결된 단백질 구조가 특히 고온성 고세균의 단백질에 대해 기능적으로 관련이 없을 수 있음을 발견했습니다. Cryo-EM 분석을 위해 더 높은 온도(최대 70°C)에서 단백질 샘플을 준비하는 절차가 개발되었습니다. 우리는 더 높은 온도에서 준비된 샘플의 구조가 기능적으로 관련이 있고 온도에 의존한다는 것을 보여주었습니다. 여기에서는 55°C를 예로 들어 고온에서 샘플 그리드를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 실험은 추가 원심분리 튜브를 사용하여 변형된 유리화 장치를 사용하여 샘플을 55°C에서 배양했습니다. 세부 절차는 증기 응축을 최소화하고 그리드에 얇은 얼음 층을 얻기 위해 미세 조정되었습니다. 성공한 실험과 실패한 실험의 예가 제공됩니다.
Introduction
단백질 복합체의 구조를 해결하기 위한 Cryo-EM 기술은 특히 고해상도 구조 1,2를 얻는 방향으로 지속적으로 개선되었습니다. 한편, 유리화 공정3 이전에 pH 또는 리간드와 같은 샘플 조건을 변경하여 적용 범위가 확장되었으며, 여기에는 샘플 그리드 준비 후 플런지 동결 4,5가 포함됩니다. 또 다른 중요한 조건은 온도입니다. X선 결정학과 같은 Cryo-EM 실험은 저온에서 수행되지만 Cryo-EM으로 해결된 구조는 유리화 전 용액 상태의 구조를 반영합니다. 최근까지 대부분의 단일 입자 분석(SPA) Cryo-EM 연구는유리화6 전에 얼음 위(즉, 4°C)에 보관된 샘플을 사용하지만 많은 연구에서 약실온 7,8,9,10 또는 최고 42°C에서 샘플을 사용합니다11. 최근 보고서에서 우리는 4 ° C에서 70 ° C까지의 6 가지 온도에서 고온 성 고세균 설포로부스 솔 파타 리쿠스 (Sso)의 효소 케톨산 환원 이소머 라제 (KARI)에 대한 온도 의존적 연구를 수행했습니다12. 당사의 연구에 따르면 기능적으로 관련된 온도에서 샘플 그리드를 준비하는 것이 중요하며 Cryo-EM은 여러 온도에서 동일한 단백질 복합체의 구조를 해석하는 데 실질적으로 실현 가능한 유일한 구조적 방법입니다.
고온에서 유리화의 주요 어려움은 증기 응축을 최소화하고 얇은 얼음을 얻는 것입니다. 여기에서는 Sso-KARI 12에 대한 이전 연구에서 고온에서 샘플 그리드를 준비하는 데 사용된 자세한 프로토콜을 보고합니다. 독자 또는 관찰자가 Cryo-EM 실험을 위한 전체 샘플 준비 및 데이터 처리 절차에 이미 경험이 있다고 가정하고 고온과 관련된 측면을 강조합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 이 프로토콜은 수정된 상업용 유리화 장치를 사용하여 특정 온도, 특히 37°C 이상의 온도에서 초저온 전자 현미경(cryo-EM) 샘플을 준비하는 것을 목표로 합니다. 전체 실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다. 프로토콜은 55°C를 예로 사용합니다. 다른 온도에서의 특정 조건은 참고자료12의 보충 표 2를 참조하십시오.
1. 유리화 장치의 제조
- 닫힌 끝의 1mL 원심분리 튜브에 50cm 구멍을 뚫습니다.
- 그림 2와 같이 초음파 물 배출구의 유리화 장치 챔버에 튜브를 놓습니다.
알림: 목적은 전체 챔버에 도달하기 전에 튜브를 통해 열교환기로 수증기를 유도하여 수분 응결을 최소화하는 것입니다. - 유리화 장치 온도를 지정된 온도(예: 그림 3과 같이 55°C)로 설정하고 유리화 장치 챔버가 55°C 및 100% 상대 습도에 도달하도록 합니다. 실험을 시작하기 전에 조건을 안정화하기 위해 적어도 30 분 동안 그대로 두십시오.
2. 샘플 및 도구 예열
- 수조를 핫플레이트에 놓고 핫플레이트를 원하는 온도(여기서는 55°C)로 설정합니다. 온도계로 물이 55 ° C에 도달하는지 확인하십시오.
- 샘플을 수조에서 배양하고 블로팅 실험 전에 핫플레이트 가장자리의 피펫 팁을 2분 이상 예열합니다.
알림: 유리화 장치 챔버의 최고 온도 설정은 60°C입니다. cyro-EM 실험을 위한 더 높은 온도 그리드(예를 들어, 70°C)를 준비하기 위해, 샘플을 80°C의 수조에서 인큐베이션하고, 샘플 온도와 유리화 장치 온도 사이의 평균은 그리드 상의 샘플의 실제 온도(이 경우 70°C)로 추정된다. 이 추정치에 대한 자세한 내용과 제한 사항은 토론 섹션을 참조하십시오.
3. 블로팅 실험 준비
- 글로우 방전 구멍이 많은 탄소 지지 그리드를 25mA에서 30초 동안 방전하거나 사용된 장치에 따라 값의 대안입니다.
- 유리화 장치에서 그리드와 함께 핀셋을 2분 이상 배양합니다.
- 표준 절차에 따라 에탄 용기를 에탄으로 채 웁니다. 에탄이 넘치지 않도록하십시오.
알림: 이 단계는 약 10분이 소요되며 동결을 방지하기 위해 블로팅 실험을 즉시 수행해야 합니다. - 유리화 여과지를 블로팅 실험 5분 전에 유리화 장치 챔버에 넣습니다.
알림: 여과지를 챔버에 너무 빨리 놓으면 너무 젖을 수 있습니다.
4. 블로팅 실험
노트: 그리드를 잡을 때 그리드가 안정적이고 핀셋과의 접촉 면적이 최소화되어 있는지 확인하십시오(그림 4). 이것은 에탄의 최상의 냉각 효율을 유지하고 비 유리질 얼음을 피하기 위해 수행됩니다.
- 피펫 팁을 사용하여 7-9 μL의 샘플을 그리드에 적용합니다. 그런 다음 1-2 초 동안 기다렸다가 1-1.5 초 동안 얼룩을 지우고 샘플을 액체 에탄에 빠르게 떨어 뜨립니다.
- 액체 에탄에서 액체 질소에 저장되는 냉동 상자로 그리드를 옮깁니다.
알림: 핀셋이 여전히 뜨겁기 때문에 이 단계는 매우 조심스럽게 수행해야 하므로 현재 전체 냉각 탱크에 증기가 가득 차 있습니다.
5. 그리드에 대한 품질 검사
- 그리드를 클립하여 Cryo-EM 기기에 업로드합니다.
- Cryo-EM 기기의 디스플레이 화면과 소프트웨어의 저용량 기능을 사용하여 그리드의 얼음 상태와 그리드의 샘플 분포를 스크리닝합니다.
알림: 종종 그리드가 매우 건조하거나 얼음 층이 너무 두껍습니다. 고온에서 제조된 그리드의 성공률은 실온 또는 4°C에서의 성공률보다 실질적으로 낮다. 양호한 그리드와 만족스럽지 않은 그리드의 대표적인 결과는 다음 섹션에 나와 있습니다. - 결과 그리드의 품질이 좋지 않으면 다양한 조건 (예 : 대기 시간, 블로 팅 시간 등)으로 그리드 준비 과정을 반복하십시오. 결과 그리드의 품질이 좋으면 동일한 단계를 반복하여 다른 온도에서 그리드를 만듭니다.
6. 데이터 수집
- 양질의 그리드를 고분해능 Cryo-EM 기기로 전송합니다.
- 확립된 절차에 따라 데이터 수집 및 데이터 분석을 수행합니다.
참고 : 이전 간행물에서 볼 수 있듯이 구조의 해상도는 고온12의 영향을받지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
저배율 개요는 그림 5A, B에 나와 있습니다. 패널 A는 성공적인 그리드의 예입니다. 왼쪽 위 (두꺼운)에서 오른쪽 아래 (더 얇거나 비어 있음)까지 얼음 그라데이션이 있습니다. 이러한 그리드는 청색 및 녹색 박스와 같은 데이터 수집에 적합한 중간 영역에서 적절한 두께의 얼음층을 쉽게 찾을 수 있게 한다. 그리드 B가 너무 건조합니다. 그리드의 사각형은 밝은 대비를 가지며, 이는 얼음 층이 너무 얇거나 얼음 층이 전혀 없음을 의미합니다. 빨간색 화살표로 표시된 두 개의 사각형만 데이터 수집에 적합합니다.
또한 다양한 그리드의 저선량 이미지의 예가 그림 5C, D에 나와 있습니다. 패널 C의 이미지는 대부분의 얼음이 결정 형태이며 데이터 수집에 적합하지 않음을 보여줍니다. 한편, 패널 D의 이미지는 얼음층이 대부분 데이터 수집에 적합한 비정질 상태임을 보여준다.
이것은 고온에서의 그리드 준비에 초점을 맞춘 짧은 논문입니다. 표에는 데이터 수집을 위한 샘플만 포함됩니다. 좋은 그리드는 확실한 기회는 아니지만 고해상도 구조를 풀기 위한 좋은 데이터를 생성할 수 있는 좋은 기회가 있습니다. 본 논문에 기술된 예들에 대한 실제 Cryo-EM 데이터 및 최종 구조는 이미 공개된 논문12에 기술되어 있다. 요컨대, 우리는 데이터 수집에 충분한 그리드를 얻었고, 각각 6 개의 다른 온도에서 두 개의 Sso-KARI 복합체의 구조를 풀었으며, 각 복합체에 대해 서로 다른 온도의 구조와 동일한 온도에서 두 복합체 사이의 구조를 비교했습니다. 결과는 각 복합체의 구조가 온도 의존적이며 온도 의존적 변화가 두 복합체 간에 다르다는 것을 나타냅니다. 중요한 것은 연속적인 구조 변화가 연속적인 온도 변화와 잘 연관되어 있다는 것이며, 이는 온도 의존적 샘플 그리드 준비의 성공을 강력하게 나타냅니다.
그림 1: 고온 Cryo-EM 시료 전처리를 위한 전체 실험 설정. 표시된 항목에는 유리화 장치, 인큐베이터, 타이머, 피펫 팁 배치, 냉각 탱크 및 핀셋이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유리화 장치 챔버의 수정. 50mL 튜브는 빨간색 화살표12로 표시된 초음파 스프레이 배출구에 설치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 실험 중 유리화 장치의 외관. 화면은 55 ° C에서의 온도와 100 %의 습도를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 핀셋을 사용하여 그리드 잡기 핀셋은 가능한 한 적은 접촉으로 그리드를 잡는 것이 좋지만 작동 과정에서 그리드를 안정적으로 잡을 수 있어야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대표적인 결과: Cryo-EM을 통한 그리드 검사. (A,B)는 그리드의 전체 상태를 표시합니다. (C, D)는 상이한 그리드로부터의 저선량 이미지의 예를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
프로토콜의 1단계에서 원심분리기 튜브가 잘 설치되었고 실험이 진행 중일 때 떨어지지 않는지 확인하십시오. 챔버에 많은 수의 물방울이 축적되어 여과지의 흡착 용량을 변경할 수 있기 때문에 유리화 장치 챔버가 평형 온도에 도달 한 후 실험의 전체 시간이 30 분을 초과하지 않는 것이 좋습니다. 작동 시간이 30분을 초과하면 작업자는 여과지를 교체하고 캐빈이 온도와 습도의 균형을 다시 맞출 때까지 기다려야 합니다. 프로토콜의 8단계에서 제안된 샘플 부피 7-9μL는 평소보다 크며, 그렇지 않으면 샘플이 고온에서 빠르게 증발하여 그리드에 빈 사각형이 생기기 때문입니다. 반면에 적용된 샘플은 9μL를 초과하지 않는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 블로팅하기 전에 핀셋을 움직이는 과정에서 샘플이 떨어질 가능성이 매우 높습니다. 전반적으로이 기술의 성공 열쇠는 그리드를 안정적이고 빠르게 파악하고 각 시간 제한 작업을 정확하고 안정적으로 실행하는 것입니다. 또한 각 실험 라운드는 하나의 특정 고온만 처리하는 것이 좋습니다. 다른 온도에서 실험을 수행하기 전에 모든 시스템을 완전히 복구하고 재설정해야합니다.
챔버의 고온 및 습도로 인해 창은 종종 안개로 덮여 실험을 시작하는 데 어려움을 겪습니다. 창문을 비우기 위해 약간의 비누 거품을 사용하는 것이 좋습니다. 그리드가 좋지 않은 경우 위에서 설명한 단계를 정확하게 따르지 않거나 단계가 너무 오래 걸리기 때문일 수 있습니다. 정확하고 신속하게 샘플 그리드 준비를 반복하십시오. 반복 후에도 그리드가 여전히 좋지 않으면 조건을 조정하십시오. 이 실험에서 관찰 된 더 빈번한 문제는 고온에서 그리드에 얼음이 없다는 것입니다. 그렇다면 블로팅 시간을 더 줄이십시오. 반면에 얼음이 너무 두꺼우면 블로팅 시간을 늘리십시오.
고온 Cryo-EM의 한계는 유리화 장치의 최대 가열 온도가 60°C라는 것입니다. 더 높은 온도에 도달하기 위해, 샘플을 60°C 이상(예를 들어, 80°C) 이상으로 가열하고, 샘플 온도와 유리화 온도 사이의 평균은 그리드 상의 샘플의 실제 온도(이 경우 70°C)로 추정하였다. 이 추정치를 기반으로 약간의 부정확성이있을 수 있습니다. 가능한 미래 솔루션은 급락 동결 직전에 그리드 온도를 정확하게 측정하기 위해 열전대를 구축하는 것입니다. 또 다른 잠재적 한계는 고온에서 단백질의 안정성이다. 계획된 Cryo-EM 실험을 위한 온도에서 단백질이 안정적인지 확인하기 위해 원형 이색성을 사용하는 별도의 실험을 수행해야 합니다.
또 다른 한계는 단지 두 가지 유형의 상업적으로 이용가능한 유리화 장치가 상기 언급된 바와 같이 37°C 이상 및 최대 60°C까지 가열될 수 있다는 것이다(예를 들어, 써모 피셔 비트로봇 및 라이카 EM-GP). 다른 공급 업체의 유리화 장치는 실온으로 제한되거나 4 ° C에서 37 ° C 사이에서만 조정 가능합니다. 그러나 연구 그룹은 향후 온도 범위가 확장 된 자체 플 런지 장치를 구축 할 수 있습니다.
우리의 프로토콜은 실온보다 높은 온도에서 그리드를 준비하기 위해 기존 프로토콜 4,5,6에서 수정되었습니다. 여기에 설명된 수정 사항을 적용하지 않으면 Cryo-EM 이미지 수집에 적합한 우수한 고온 샘플 그리드를 만드는 데 성공할 가능성이 매우 낮습니다.
2019년 두 논문은 단백질 구조가 TRP 채널 TRPV311 의 경우 4°C에서 42°C, Sso-KARI 12의 경우 4°C에서 70°C 범위에서 단백질 기능의 온도 의존성과 관련하여 온도 의존적임을 입증했습니다. 이러한 보고서는 기능적으로 관련된 온도(일반적으로 37°C)에서 향후 더 많은 연구가 수행될 것이라는 점에서 Cryo-EM 연구의 변화를 촉진할 가능성이 높습니다. 이 온도에서 정제된 단백질의 안정성이 문제가 될 수 있습니다. 그러나 프로토콜에 따라 이 온도에서 단 2분 동안 단백질 샘플을 배양해야 합니다. 대안적으로, 생리학적 조건은 단층 촬영 및 서브-토모 평균화를 사용하여 세포 내의 단백질을 이미징함으로써 달성될 수 있다. 또한 Cryo-EM은 40°C에서 80°C 범위의 고온에서 단백질 풀림의 메커니즘과 중간체를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 연구는 모두 여기에 설명된 프로토콜의 이점을 얻을 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 유용한 조언을 해준 Thermo Fisher Scientific의 Hervé Remigy 박사에게 감사드립니다. Cryo-EM 실험은 Academia Sinica Cryo-EM Facility(ASCEM)에서 수행되었습니다. ASCEM은 Academia Sinica(Grant No. AS-CFII-108-110) 및 대만 단백질 프로젝트 (보조금 번호. AS-KPQ-109-TPP2). 저자는 또한 샘플 준비에 도움을 준 Ms. Hui-Ju Huang에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
