Summary
本文提供了在冷冻电镜实验进行冷冻之前在高达 70 °C 的温度下制备样品网格的详细方案。
Abstract
用于冷冻电子显微镜（cryo-EM）实验的样品网格通常在最适合生物样品储存的温度下制备，主要是在4°C下，偶尔在室温下制备。最近，我们发现在低温下解决的蛋白质结构可能与功能无关，特别是对于嗜热古细菌的蛋白质。开发了一种在较高温度（高达70°C）下制备蛋白质样品以进行冷冻电镜分析的程序。我们发现，在较高温度下制备的样品的结构具有功能相关性且与温度相关。在这里，我们以55°C为例描述了在高温下制备样品网格的详细方案。该实验使用使用额外的离心管修饰的玻璃化装置，并将样品在55°C下孵育。 对详细程序进行了微调，以最大程度地减少蒸汽冷凝并在网格上获得一层薄薄的冰。提供了成功和不成功的实验示例。
Introduction
用于求解蛋白质复合物结构的冷冻电镜技术不断改进，特别是在获得高分辨率结构的方向上1，2.同时，在玻璃化过程3之前，通过改变样品条件（例如pH或配体）也扩大了其应用范围，该过程涉及制备样品网格，然后进行冷冻4，5。另一个重要条件是温度。尽管冷冻电镜实验（如X射线晶体学）是在低温下进行的，但冷冻电镜求解的结构反映了玻璃化前溶液状态下的结构。直到最近，大多数单颗粒分析 （SPA） 冷冻电镜研究使用在玻璃化之前保存在冰上的样品6，尽管许多研究使用室温约为 7，8，9，10 或高达 42 °C的样品 11。在最近的一份报告中，我们对嗜热古菌Sulfolobus solfataricus（Sso）的酮酸还原异构酶（KARI）在4°C至70°C的六种不同温度下进行了温度依赖性研究12。我们的研究表明，在功能相关的温度下制备样品网格非常重要，冷冻电镜是唯一在多个温度下求解相同蛋白质复合物结构的实际可行的结构方法。
高温玻璃化的主要难点是尽量减少蒸汽冷凝并实现薄冰。在这里，我们报告了我们之前对 Sso-KARI 12的研究中用于在高温下制备样品网格的详细方案。我们假设读者或观众已经对冷冻电镜实验的整体样品制备和数据处理程序有经验，并强调与高温相关的方面。
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Protocol
注意：本协议旨在使用改进的商业玻璃化设备在特定温度下（特别是高于37°C）制备冷冻电子显微镜（cryo-EM）样品。 整体实验设置如图 1所示。该方案以55°C为例。其他温度下的具体条件请参考参考文献12中的补充表2。
1.玻璃化装置的制备
- 在封闭端的 50 mL 离心管中打一个 1 cm 的孔。
- 将管子放入超声波出水口的玻璃化装置室中，如图 2所示。
注意： 目的是通过在到达整个腔室之前将水蒸气通过管子引导到热交换器来最大限度地减少水冷凝。 - 将玻璃化装置的温度设置为指定的温度（例如，55°C，如图 3所示），并允许玻璃化装置室达到55°C和100%相对湿度。在开始实验之前，让它静置至少半小时以稳定条件。
2. 预热样品和工具
- 将水浴放在加热板上，并将加热板设置为所需的温度（此处为55°C）。用温度计检查以确保水达到55°C。
- 在水浴中孵育样品，并在印迹实验之前将移液器尖端在加热板边缘预热2分钟或更长时间。
注意：玻璃化装置室的最高温度设置为60°C。 为了制备用于cyro-EM实验的更高温度的网格（例如，70°C），将样品在80°C的水浴中孵育，并且样品温度与玻璃化装置温度之间的平均值估计为网格上样品的实际温度（在这种情况下为70°C）。有关此估算的更多详细信息和限制，请参阅 “讨论 ”部分。
3. 印迹实验的准备
- 辉光以 25 mA 对多孔碳支撑网格放电 30 秒，或根据所用设备替代值。
- 将镊子与玻璃化装置中的网格孵育2分钟或更长时间。
- 按照标准程序在乙烷容器中填充乙烷。不要让乙烷溢出。
注意：此步骤大约需要10分钟，应立即进行印迹实验以避免冻结。 - 在印迹实验前不早于5分钟将玻璃化滤纸放入玻璃化装置室中。
注意：过早地将滤纸放入腔室会导致其变得太湿。
4. 印迹实验
注：握住网格时，请确保网格稳定，并且与镊子的接触面积最小（图4）。这样做是为了保持乙烷的最佳冷却效率并避免非玻璃体冰。
- 使用移液器吸头将 7-9 μL 样品涂覆到网格上。然后等待1-2秒，印迹1-1.5秒，并迅速将样品浸入液态乙烷中。
- 将网格从液态乙烷转移到储存在液氮中的冷冻盒中。
注意：此步骤必须非常小心地执行，因为镊子仍然很热，因此此时整个冷却罐都充满了蒸汽。
5. 电网质量检查
- 夹住网格并将其上传到冷冻电镜仪器。
- 使用冷冻电镜仪器的显示屏和软件的低剂量功能，在网格上筛选冰况和网格上样品的分布。
注意：通常，网格非常干燥，或者冰层太厚。在高温下制备的网格的成功率大大低于室温或4 °C。 下一节显示了良好网格和不满意网格的代表性结果。 - 如果所得网格的质量不好，请在各种条件（如等待时间、印迹时间等）下重复网格制备过程。如果生成的网格质量良好，请重复相同的步骤以在不同的温度下制作网格。
6. 数据收集
- 将高质量的网格转移到高分辨率冷冻电镜仪器上。
- 根据既定程序执行数据收集和数据分析。
注意：如我们之前的出版物所示，结构的分辨率不受高温12的影响。
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Representative Results
低放大倍率概览如图 5A，B所示。面板 A 是成功网格的一个示例。从左上角（较厚）到右下角（较薄或空）有一个冰梯度。这样的网格可以更容易地在适合数据收集的中间区域找到合适厚度的冰层，例如蓝色和绿色框。网格 B 太干。网格中的方块具有明亮的对比度，这意味着冰层太薄或根本没有冰层。只有红色箭头指示的两个方块适合数据收集。
此外，来自不同网格的低剂量图像的示例如图 5C，D所示。图C中的图像显示，大部分冰是结晶形式，不适合数据收集。另一方面，图D中的图像显示冰层大多处于无定形状态，适合数据收集。
请注意，这是一篇简短的论文，重点关注高温下的网格准备。网格仅包含用于数据收集的示例。一个好的网格有很好的机会，尽管不是确定的机会，为求解高分辨率结构生成良好的数据。本文中描述的示例的真实冷冻电镜数据和最终结构已在已发表的论文12中描述。简而言之，我们已经获得了足够好的网格来收集数据，分别在六个不同温度下求解了两个Sso-KARI配合物的结构，并比较了每个复合体不同温度的结构，以及相同温度下两个复合物之间的结构。结果表明，各配合物的结构均呈温度依赖性，且两种配合物之间的温度依赖性变化不同。重要的是，连续的结构变化与连续的温度变化密切相关，这有力地表明了温度依赖性样品网格制备的成功。
图 1：高温冷冻电镜样品制备的整体实验设置。 显示的项目包括玻璃化装置、培养箱、计时器、移液器吸头放置、冷却罐和镊子。 请点击此处查看此图的大图。
图2：玻璃化装置室的修改。 如红色箭头12所示，在超声波喷雾出口处安装50 mL管。 请点击此处查看此图的大图。
图3：实验过程中玻璃化装置的外观。 屏幕显示温度为55°C，湿度为100%。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：使用镊子抓取网格。 建议镊子以尽可能少的接触抓住网格，但在操作过程中必须能够稳定地固定网格。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：代表性结果：冷冻电镜网格检查。 （A，B） 显示网格的整体状态。（C，D）显示了来自不同网格的低剂量图像的示例。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在协议的步骤1中，确保离心管安装良好，并且在实验进行时不会掉落。由于腔室内积聚了大量的水滴，会改变滤纸的吸附能力，建议玻璃化装置腔达到平衡温度后，实验的总时间不应超过30分钟。如果操作时间超过30分钟，操作人员需要更换滤纸，等待机舱再次平衡温度和湿度。在协议的第8步，建议的7-9μL样品体积比平时大，因为否则，样品在高温下会迅速蒸发，导致网格上出现空方块。另一方面，强烈建议施用的样品不超过 9 μL。 否则，在印迹前移动镊子的过程中，样品很可能会滴落下来。总体而言，该技术成功的关键是稳定和快速地抓取网格以及正确和稳定地执行每个限时动作。此外，建议每轮实验只处理一个特定的高温。在另一个温度下进行实验之前，必须完全恢复并重置所有系统。
由于腔室温度高、湿度高，窗户经常被雾气覆盖，导致实验难以启动。建议使用少量肥皂泡来清除窗户。如果网格不好，可能的原因是没有精确遵循上述步骤和/或步骤花费的时间太长。尝试精确快速地重复样品网格的制备。如果重复后网格仍然不好，请尝试调整条件。在这个实验中观察到的更常见的问题是在高温下网格上没有冰。如果是这样，请尝试进一步减少印迹时间。另一方面，如果冰太厚，请尝试增加印迹时间。
高温冷冻电镜的局限性在于玻璃化装置上的最高加热温度为60°C。 为了达到更高的温度，将样品加热到60°C以上（例如，80°C），并且样品温度和玻璃化温度之间的平均值估计为网格上样品的实际温度（在这种情况下为70°C）。基于此估计可能会有一些不准确之处。未来可能的解决方案是建立一个热电偶，在冷冻之前准确测量电网温度。另一个潜在的限制是蛋白质在高温下的稳定性。应使用圆二色性进行单独的实验，以确保蛋白质在计划的冷冻电镜实验的温度下稳定。
另一个限制是，如上所述，只有两种类型的市售玻璃化设备可以加热到37°C以上和60°C（例如，Thermo Fischer Vitrobot和Leica EM-GP）。其他供应商的玻璃化装置要么仅限于室温，要么只能在 4 °C 和 37 °C 之间调节。 但是，研究小组将来有可能建造自己的具有扩展温度范围的插入设备。
我们的协议是从现有的协议4，5，6修改而来的，目的是在高于室温的温度下制备网格。如果不进行此处描述的修改，成功制作适合冷冻电镜图像采集的良好高温样品网格的机会非常小。
2019年的两篇论文表明，与蛋白质功能的温度依赖性相关，TRP通道TRPV311 在4°C至42°C范围内， Sso-KARI 12在4°C至70°C范围内。这些报告可能会鼓励冷冻电镜研究的改变，因为未来更多的研究将在功能相关的温度下进行，通常是在37°C。 纯化蛋白质在此温度下的稳定性可能是一个问题。但是，根据我们的方案，只需要在此温度下孵育蛋白质样品2分钟。或者，生理条件可以通过使用断层扫描和断层下平均对细胞中的蛋白质进行成像来实现。此外，冷冻电镜可用于研究蛋白质在高温下展开的机制和中间体，可能在40°C至80°C的范围内。 这些研究都将受益于此处描述的方案。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者感谢赛默飞世尔科技的Hervé Remigy博士提供的有用建议。冷冻电镜实验在中央研究院冷冻电镜设施（ASCEM）进行。ASCEM由中央研究院支持（批准号）。AS-CFII-108-110）和台湾蛋白质计划（批准号。AS-KPQ-109-TPP2）。作者还感谢黄慧菊女士在样品制备方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
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