Summary
توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجات حرارة تصل إلى 70 درجة مئوية، قبل التجمد الغاطس لتجارب التبريد الكهرومغناطيسي.
Abstract
عادة ما يتم إعداد شبكات العينات لتجارب المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) عند درجة حرارة مثالية لتخزين العينات البيولوجية ، معظمها عند 4 درجات مئوية وأحيانا في درجة حرارة الغرفة. في الآونة الأخيرة ، اكتشفنا أن بنية البروتين التي تم حلها في درجة حرارة منخفضة قد لا تكون ذات صلة وظيفية ، خاصة بالنسبة للبروتينات من العتائق المحبة للحرارة. تم تطوير إجراء لإعداد عينات البروتين في درجات حرارة أعلى (تصل إلى 70 درجة مئوية) لتحليل cryo-EM. أظهرنا أن الهياكل من العينات المعدة في درجات حرارة أعلى ذات صلة وظيفية وتعتمد على درجة الحرارة. هنا نصف بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجة حرارة عالية ، باستخدام 55 درجة مئوية كمثال. استخدمت التجربة جهاز تزجيج تم تعديله باستخدام أنبوب طرد مركزي إضافي ، وتم تحضين العينات عند 55 درجة مئوية. تم ضبط الإجراءات التفصيلية بدقة لتقليل تكثيف البخار والحصول على طبقة رقيقة من الجليد على الشبكة. يتم تقديم أمثلة على التجارب الناجحة وغير الناجحة.
Introduction
استمرت تقنية cryo-EM لحل هياكل مجمعات البروتين في التحسن ، خاصة في اتجاه الحصول على هياكل عالية الدقة 1,2. في غضون ذلك ، تم توسيع نطاق تطبيقه أيضا عن طريق تغيير ظروف العينة مثل الرقم الهيدروجيني أو الليكاندات قبل عملية التزجيج3 ، والتي تنطوي على إعداد شبكات العينات تليها تجميد الغطس 4,5. شرط آخر مهم هو درجة الحرارة. على الرغم من أن تجارب cryo-EM ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية ، يتم إجراؤها في درجات حرارة منخفضة ، إلا أن البنية التي تم حلها بواسطة cryo-EM تعكس البنية في حالة الحل قبل التزجيج. حتى وقت قريب، تستخدم غالبية دراسات تحليل الجسيمات المفردة (SPA) cryo-EM عينات يتم الاحتفاظ بها على الجليد (أي عند 4 درجات مئوية) قبل التزجيج6، على الرغم من أن عددا من الدراسات تستخدم عينات عند درجة حرارة الغرفة حوالي7،8،9،10 أو تصل إلى 42 درجة مئوية 11. في تقرير حديث ، أجرينا دراسات تعتمد على درجة الحرارة لإنزيم اختزال حمض الكيتول (KARI) من الأركايون المحب للحرارة Sulfolobus solfataricus (Sso) في ست درجات حرارة مختلفة من 4 درجات مئوية إلى 70 درجة مئوية12. تشير دراساتنا إلى أنه من المهم إعداد شبكات العينات في درجات حرارة ذات صلة وظيفيا وأن cryo-EM هي الطريقة الهيكلية الوحيدة الممكنة عمليا لحل بنية نفس مركب البروتين في درجات حرارة متعددة.
تتمثل الصعوبة الرئيسية للتزجيج في درجات الحرارة العالية في تقليل تكثيف البخار وتحقيق جليد رقيق. هنا نبلغ عن البروتوكول التفصيلي المستخدم لإعداد شبكات العينات في درجات حرارة عالية في دراستنا السابقة ل Sso-KARI 12. نفترض أن القراء أو المشاهدين لديهم خبرة بالفعل في إجراءات إعداد العينات ومعالجة البيانات الشاملة لتجارب cryo-EM ونؤكد على الجوانب ذات الصلة بارتفاع درجة الحرارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام جهاز تزجيج تجاري معدل لإعداد عينات المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) في درجات حرارة محددة، وخاصة أعلى من 37 درجة مئوية. يظهر الإعداد التجريبي العام في الشكل 1. يستخدم البروتوكول 55 درجة مئوية كمثال. للاطلاع على الظروف المحددة في درجات الحرارة الأخرى، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 2 في المرجع12.
1. إعداد جهاز التزجيج
- قم بعمل ثقب 1 سم في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل في نهايته المغلقة.
- ضع الأنبوب في غرفة جهاز التزجيج عند مخرج المياه بالموجات فوق الصوتية ، كما هو موضح في الشكل 2.
ملاحظة: الغرض من ذلك هو تقليل تكثيف الماء عن طريق توجيه بخار الماء إلى المبادل الحراري عبر الأنبوب قبل الوصول إلى الغرفة بأكملها. - قم بإعداد درجة حرارة جهاز التزجيج إلى درجة الحرارة المحددة (على سبيل المثال ، 55 درجة مئوية ، كما هو موضح في الشكل 3) ، واسمح لغرفة جهاز التزجيج بالوصول إلى 55 درجة مئوية ورطوبة نسبية 100٪. دعها تقف لمدة نصف ساعة على الأقل لتحقيق الاستقرار في الظروف قبل بدء التجربة.
2. تسخين العينة والأدوات
- ضع الحمام المائي على صفيحة موقد واضبط الموقد على درجة الحرارة المطلوبة (هنا 55 درجة مئوية). تحقق من ذلك باستخدام ميزان حرارة للتأكد من أن الماء يصل إلى 55 درجة مئوية.
- احتضن العينة في الحمام المائي وقم بتسخين طرف الماصة مسبقا على حافة السخان لمدة 2 دقيقة أو أكثر قبل تجربة النشاف.
ملاحظة: أعلى إعداد لدرجة الحرارة لغرفة جهاز التزجيج هو 60 درجة مئوية. لإعداد شبكات درجة حرارة أعلى لتجربة cyro-EM (على سبيل المثال ، 70 درجة مئوية) ، يتم تحضين العينة في الحمام المائي عند 80 درجة مئوية ، ويقدر المتوسط بين درجة حرارة العينة ودرجة حرارة جهاز التزجيج بأنه درجة الحرارة الفعلية للعينة على الشبكة (70 درجة مئوية في هذه الحالة). انظر قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل والقيود على هذا التقدير.
3. التحضير لتجربة النشاف
- قم بتفريغ شبكة مدعومة بالكربون عند 25 مللي أمبير لمدة 30 ثانية ، أو بديل للقيم اعتمادا على الجهاز المستخدم.
- احتضان الملقط مع الشبكة في جهاز التزجيج لمدة 2 دقيقة أو أكثر.
- املأ حاوية الإيثان بالإيثان وفقا للإجراءات القياسية. لا تدع الإيثان يفيض.
ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة حوالي 10 دقائق ويجب اتباعها على الفور مع تجربة النشاف لتجنب التجميد. - ضع ورقة تصفية التزجيج في غرفة جهاز التزجيج في موعد لا يتجاوز 5 دقائق قبل تجربة النشاف.
ملاحظة: سيؤدي وضع ورقة الترشيح في الغرفة في وقت مبكر جدا إلى أن تصبح رطبة جدا.
4. تجربة اللطخة
ملاحظة: عند الإمساك بالشبكة ، تأكد من أن الشبكة مستقرة وأن هناك الحد الأدنى من منطقة التلامس مع الملقط (الشكل 4). يتم ذلك للحفاظ على أفضل كفاءة تبريد للإيثان وتجنب الجليد غير الزجاجي.
- استخدم طرف ماصة لتطبيق 7-9 ميكرولتر من العينة على الشبكة. ثم انتظر 1-2 ثانية ، ولطخ لمدة 1-1.5 ثانية ، وسرعان ما تغرق العينة في الإيثان السائل.
- انقل الشبكة من الإيثان السائل إلى صندوق التبريد ، الذي يتم تخزينه في النيتروجين السائل.
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية فائقة لأن الملقط لا يزال ساخنا ، وبالتالي فإن خزان التبريد بأكمله مليء بالبخار في هذا الوقت.
5. فحص الجودة للشبكات
- قم بقص الشبكات وتحميلها على أداة cryo-EM.
- استخدم شاشة العرض الخاصة بجهاز cryo-EM ووظيفة الجرعة المنخفضة للبرنامج لفحص حالة الجليد على الشبكة وتوزيع العينة على الشبكة.
ملاحظة: في كثير من الأحيان ، تكون الشبكات جافة جدا ، أو تكون طبقة الجليد سميكة جدا. معدل نجاح الشبكات المعدة في درجات حرارة عالية أقل بكثير من ذلك في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية. يتم عرض النتائج التمثيلية للشبكات الجيدة والشبكات غير المرضية في القسم التالي. - إذا لم تكن جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر عملية إعداد الشبكة بظروف متنوعة (مثل وقت الانتظار ، وقت النشاف ، إلخ). إذا كانت جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر نفس الخطوات لإنشاء شبكات عند درجة حرارة مختلفة.
6. جمع البيانات
- انقل الشبكات ذات النوعية الجيدة إلى أداة cryo-EM عالية الدقة.
- إجراء جمع البيانات وتحليلها وفقا للإجراءات المعمول بها.
ملاحظة: كما هو موضح في منشورنا السابق ، لا تتأثر دقة الهيكل بدرجة الحرارة المرتفعة12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض نظرة عامة على التكبير المنخفض في الشكل 5A و B. اللوحة A هي مثال على شبكة ناجحة. هناك تدرج جليدي من أعلى اليسار (أكثر سمكا) إلى أسفل اليمين (أرق أو فارغ). تسهل هذه الشبكة العثور على سمك مناسب لطبقة الجليد في المنطقة الوسطى مناسب لجمع البيانات ، مثل المربعات الزرقاء والخضراء. الشبكة B جافة جدا. تحتوي المربعات الموجودة في الشبكة على تباين ساطع ، مما يعني أن الطبقة الجليدية رقيقة جدا أو لا توجد طبقة جليدية على الإطلاق. فقط المربعان المشار إليهما بالأسهم الحمراء مناسبان لجمع البيانات.
علاوة على ذلك ، تظهر أمثلة على صور الجرعة المنخفضة من شبكات مختلفة في الشكل 5C ، D. تظهر الصورة في اللوحة C أن معظم الجليد في شكل بلوري ، غير مناسب لجمع البيانات. من ناحية أخرى ، تظهر الصورة في اللوحة D أن الطبقة الجليدية في الغالب في حالة غير متبلورة ، ومناسبة لجمع البيانات.
يرجى ملاحظة أن هذه ورقة قصيرة تركز على إعداد الشبكة في درجات حرارة عالية. تحتوي الشبكة فقط على نموذج لجمع البيانات. تتمتع الشبكة الجيدة بفرصة جيدة ، وإن لم تكن فرصة محددة ، لتوليد بيانات جيدة لحل بنية عالية الدقة. تم بالفعل وصف بيانات cryo-EM الحقيقية والهياكل النهائية للأمثلة الموضحة في هذه الورقة في الورقة المنشورة12. باختصار ، حصلنا على شبكات جيدة بما يكفي لجمع البيانات ، وحلنا هياكل مجمعين Sso-KARI عند ست درجات حرارة مختلفة لكل منهما ، وقارنا الهياكل من درجات حرارة مختلفة لكل مجمع ، وكذلك الهياكل بين المجمعين من نفس درجة الحرارة. تشير النتائج إلى أن بنية كل مجمع تعتمد على درجة الحرارة وأن التغيرات المعتمدة على درجة الحرارة تختلف بين المعقدين. الأهم من ذلك ، أن التغيرات الهيكلية المتتالية ترتبط ارتباطا جيدا بالتغيرات المتتالية في درجات الحرارة ، وهو مؤشر قوي على نجاح إعداد شبكة العينات المعتمدة على درجة الحرارة.
الشكل 1: الإعداد التجريبي العام لإعداد عينة التبريد EM عالية الحرارة. وتشمل العناصر المعروضة جهاز التزجيج، والحاضنة، والمؤقت، ووضع طرف الماصة، وخزان التبريد، والملقط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تعديل غرفة جهاز التزجيج. يتم تثبيت أنبوب 50 مل في منفذ الرش بالموجات فوق الصوتية كما هو موضح في السهم الأحمر12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ظهور جهاز التزجيج أثناء التجربة. تظهر الشاشة درجة الحرارة عند 55 درجة مئوية والرطوبة عند 100٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: استخدام ملاقط للاستيلاء على الشبكة. يوصى بأن تمسك الملقط بالشبكة بأقل قدر ممكن من الاتصال ، ولكن يجب أن تكون قادرة على الاحتفاظ بالشبكة بثبات أثناء عملية التشغيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية: فحص الشبكة بواسطة Cryo-EM. (A,B) تظهر الحالة الكلية للشبكة. (C,D) تعرض أمثلة على صور الجرعة المنخفضة من شبكات مختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الخطوة 1 من البروتوكول ، تأكد من تثبيت أنبوب جهاز الطرد المركزي بشكل جيد ولا يسقط عندما تكون التجربة قيد التقدم. نظرا لتراكم عدد كبير من قطرات الماء في الغرفة ، مما قد يغير قدرة الامتزاز لورق الترشيح ، يوصى بعدم تجاوز الوقت الإجمالي للتجربة 30 دقيقة بعد وصول غرفة جهاز التزجيج إلى درجة حرارة التوازن. إذا تجاوز وقت التشغيل 30 دقيقة، يحتاج المشغل إلى استبدال ورق الترشيح والانتظار حتى توازن المقصورة بين درجة الحرارة والرطوبة مرة أخرى. في الخطوة 8 من البروتوكول ، يكون حجم العينة المقترح من 7-9 ميكرولتر أكبر من المعتاد لأنه بخلاف ذلك ، تتبخر العينة بسرعة عند درجة حرارة عالية ، مما يؤدي إلى مربعات فارغة على الشبكة. من ناحية أخرى ، يوصى بشدة ألا تتجاوز العينة المطبقة 9 ميكرولتر. خلاف ذلك ، فمن المحتمل جدا أن تقطر العينة أثناء عملية تحريك الملقط قبل النشاف. بشكل عام ، فإن مفتاح نجاح هذه التقنية هو الإمساك المستقر والسريع بالشبكات والتنفيذ الصحيح والمستقر لكل إجراء محدود زمنيا. علاوة على ذلك ، يوصى بأن تتعامل كل جولة من التجارب مع درجة حرارة عالية محددة واحدة فقط. قبل الشروع في إجراء التجربة عند درجة حرارة أخرى ، يجب استعادة جميع الأنظمة بالكامل وإعادة ضبطها.
نظرا لارتفاع درجة الحرارة والرطوبة العالية للغرفة ، غالبا ما تكون النافذة مغطاة بالضباب مما يؤدي إلى صعوبات في إطلاق التجربة. يوصى باستخدام القليل من الصابون لمسح النافذة. إذا لم تكن الشبكات جيدة ، فإن الأسباب المحتملة هي أن الخطوات الموضحة أعلاه لا يتم اتباعها بدقة و / أو أن الخطوات تستغرق وقتا طويلا. حاول تكرار إعداد شبكات العينات بدقة وسرعة. إذا كانت الشبكات لا تزال غير جيدة بعد التكرار ، فحاول ضبط الشروط. المشكلة الأكثر شيوعا التي لوحظت في هذه التجربة هي عدم وجود جليد على الشبكة عند درجة الحرارة المرتفعة. إذا كان الأمر كذلك ، فحاول تقليل وقت النشاف أكثر. من ناحية أخرى ، إذا كان الجليد سميكا جدا ، فحاول زيادة وقت النشاف.
أحد قيود cryo-EM ذات درجة الحرارة العالية هو أن الحد الأقصى لدرجة حرارة التسخين على جهاز التزجيج هو 60 درجة مئوية. للوصول إلى درجة حرارة أعلى ، تم تسخين العينة فوق 60 درجة مئوية (على سبيل المثال ، 80 درجة مئوية) ، وقدر المتوسط بين درجة حرارة العينة ودرجة حرارة التزجيج بأنه درجة الحرارة الحقيقية للعينة على الشبكة (70 درجة مئوية ، في هذه الحالة). قد يكون هناك بعض عدم الدقة بناء على هذا التقدير. الحل المستقبلي المحتمل هو بناء ثنائي حراري لقياس درجة حرارة الشبكة بدقة قبل الغطس بالتجميد مباشرة. هناك قيد محتمل آخر هو استقرار البروتين في درجات حرارة عالية. يجب إجراء تجربة منفصلة باستخدام الثنائيات الدائرية لضمان استقرار البروتين عند درجة الحرارة لتجربة cryo-EM المخطط لها.
هناك قيد آخر هو أنه يمكن تسخين نوعين فقط من أجهزة التزجيج المتاحة تجاريا إلى أعلى من 37 درجة مئوية وحتى 60 درجة مئوية كما هو مذكور أعلاه (على سبيل المثال ، Thermo Fischer Vitrobot و Leica EM-GP). تقتصر أجهزة التزجيج من البائعين الآخرين إما على درجة حرارة الغرفة أو قابلة للتعديل فقط بين 4 درجات مئوية و 37 درجة مئوية. ومع ذلك ، من الممكن للمجموعات البحثية بناء أجهزة الغطس الخاصة بهم مع نطاقات درجات حرارة ممتدة في المستقبل.
يتم تعديل بروتوكولنا من البروتوكولات الحالية4،5،6 ، بهدف إعداد الشبكات في درجات حرارة أعلى من درجة حرارة الغرفة. بدون إجراء التعديلات الموضحة هنا ، فإن فرصة النجاح في إنشاء شبكات عينات جيدة ذات درجة حرارة عالية مناسبة لجمع صور cryo-EM صغيرة جدا.
أظهرت ورقتان بحثيتان في عام 2019 أن هياكل البروتين تعتمد على درجة الحرارة ، بالتزامن مع اعتماد درجة حرارة وظائف البروتين ، في حدود 4 درجات مئوية إلى 42 درجة مئوية لقناة TRP TRPV311 و 4 درجات مئوية إلى 70 درجة مئوية ل Sso-KARI 12. من المرجح أن تشجع هذه التقارير على حدوث تغيير في أبحاث التبريد EM حيث سيتم إجراء المزيد من الدراسات المستقبلية في درجات حرارة ذات صلة وظيفيا ، وعادة ما تكون عند 37 درجة مئوية. استقرار البروتين النقي عند درجة الحرارة هذه يمكن أن يكون مصدر قلق. ومع ذلك ، يلزم احتضان عينة البروتين عند درجة الحرارة هذه لمدة 2 دقيقة فقط وفقا لبروتوكولنا. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق الظروف الفسيولوجية عن طريق تصوير البروتينات في الخلايا باستخدام التصوير المقطعي ومتوسط التومو الفرعي. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام cryo-EM لدراسة آلية ووسيطات البروتين التي تتكشف في درجات حرارة عالية ، على الأرجح في حدود 40 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية. ستستفيد جميع هذه الدراسات من البروتوكول الموضح هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتور هيرفي ريميجي من Thermo Fisher Scientific على المشورة المفيدة. تم إجراء تجارب cryo-EM في منشأة Academia Sinica Cryo-EM (ASCEM). يتم دعم ASCEM من قبل Academia Sinica (رقم المنحة. AS-CFII-108-110) ومشروع تايوان للبروتين (رقم المنحة. AS-KPQ-109-TPP2). كما يشكر المؤلفون السيدة هوي - جو هوانغ على المساعدة التي قدمتها في إعداد العينة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
