Summary
Dette papiret gir en detaljert protokoll for å forberede prøvegitter ved temperaturer så høye som 70 ° C, før dypping for kryo-EM-eksperimenter.
Abstract
Prøvegitterene for kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) eksperimenter fremstilles vanligvis ved en temperatur som er optimal for lagring av biologiske prøver, hovedsakelig ved 4 ° C og noen ganger ved romtemperatur. Nylig oppdaget vi at proteinstrukturen løst ved lav temperatur kanskje ikke er funksjonelt relevant, spesielt for proteiner fra termofil archaea. En prosedyre ble utviklet for å forberede proteinprøver ved høyere temperaturer (opptil 70 ° C) for kryo-EM-analyse. Vi viste at strukturene fra prøver fremstilt ved høyere temperaturer er funksjonelt relevante og temperaturavhengige. Her beskriver vi en detaljert protokoll for fremstilling av prøvegitter ved høy temperatur, med 55 °C som eksempel. Forsøket benyttet et vitrifikasjonsapparat modifisert ved hjelp av et ekstra sentrifugerør, og prøver ble inkubert ved 55 °C. De detaljerte prosedyrene ble finjustert for å minimere dampkondens og oppnå et tynt lag med is på rutenettet. Eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter er gitt.
Introduction
Kryo-EM-teknologien for å løse strukturene til proteinkomplekser har fortsatt å forbedre seg, spesielt i retning av å oppnå høyoppløselige strukturer 1,2. I mellomtiden har landskapet av applikasjonen også blitt utvidet ved å variere prøveforholdene som pH eller ligander før vitrifiseringsprosessen3, som innebærer fremstilling av prøvegitter etterfulgt av stupfrysing 4,5. En annen viktig betingelse er temperaturen. Selv om kryo-EM-eksperimenter, som røntgenkrystallografi, utføres ved lave temperaturer, reflekterer strukturen løst av cryo-EM strukturen ved løsningstilstanden før vitrifisering. Inntil nylig bruker flertallet av kryo-EM-studier (Single Particle Analysis) prøver som holdes på is (dvs. ved 4 ° C) før vitrifisering6, selv om en rekke studier bruker prøver ved rundt romtemperatur 7,8,9,10 eller så høyt som 42 ° C 11. I en fersk rapport utførte vi temperaturavhengige studier av enzymet ketolsyrereduktoisomerase (KARI) fra den termofile archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) ved seks forskjellige temperaturer fra 4 ° C til 70 ° C12. Våre studier tyder på at det er viktig å forberede prøvegitter ved funksjonelt relevante temperaturer, og at cryo-EM er den eneste strukturelle metoden som er praktisk gjennomførbar for å løse strukturen til det samme proteinkomplekset ved flere temperaturer.
Den største vanskeligheten for vitrifisering ved høye temperaturer er å minimere dampkondens og oppnå tynn is. Her rapporterer vi den detaljerte protokollen som ble brukt til å forberede prøvenett ved høye temperaturer i vår tidligere studie av Sso-KARI 12. Vi antar at leserne eller seerne allerede har erfaring med de generelle prøvepreparerings- og databehandlingsprosedyrene for kryo-EM-eksperimenter og legger vekt på aspektene som er relevante for høy temperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen tar sikte på å bruke et modifisert kommersielt vitrifikasjonsapparat for å forberede kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prøvene ved bestemte temperaturer, spesielt høyere enn 37 ° C. Det samlede eksperimentelle oppsettet er vist i figur 1. Protokollen bruker 55 °C som eksempel. For de spesifikke forholdene ved andre temperaturer, se tilleggstabell 2 i referanse12.
1. Klargjøring av vitrifikasjonsapparatet
- Lag et 1 cm hull i et 50 ml sentrifugerør på den lukkede enden.
- Plasser røret i vitrifikasjonsapparatkammeret ved ultralydvannuttaket, som vist i figur 2.
MERK: Hensikten er å minimere vannkondens ved å lede vanndamp til varmeveksleren gjennom røret før den når hele kammeret. - Sett opp vitrifikasjonsapparatets temperatur til den angitte temperaturen (f.eks. 55 °C, som vist i figur 3), og la vitrifikasjonsapparatkammeret nå 55 °C og 100 % relativ fuktighet. La det stå i minst en halv time for å stabilisere forholdene før du starter eksperimentet.
2. Oppvarming av prøven og verktøyene
- Legg vannbadet på en kokeplate og sett kokeplaten til ønsket temperatur (her 55 °C). Sjekk med et termometer for å sikre at vannet når 55 °C.
- Inkuber prøven i vannbadet og forvarm pipettespissen på kanten av kokeplaten i 2 minutter eller lenger før blottingforsøket.
MERK: Den høyeste temperaturinnstillingen for vitrifikasjonsapparatkammeret er 60 °C. For å forberede høyere temperaturgitter for cyro-EM-eksperiment (f.eks. 70 °C), inkuberes prøven i vannbadet ved 80 °C, og gjennomsnittet mellom prøvetemperaturen og vitrifikasjonsapparatets temperatur anslås å være den faktiske temperaturen på prøven på rutenettet (70 °C i dette tilfellet). Se diskusjonsdelen for ytterligere detaljer og begrensninger på denne estimeringen.
3. Forberedelse til blottingeksperimentet
- Glød utladning et hullete karbonstøttet rutenett ved 25 mA i 30 s, eller alternativ til verdiene avhengig av enheten som brukes.
- Inkuber pinsetten med rutenettet i vitrifikasjonsapparatet i 2 minutter eller lenger.
- Fyll etanbeholderen med etan i henhold til standardprosedyrer. Ikke la etan renne over.
MERK: Dette trinnet tar ca 10 minutter og bør følges umiddelbart med blotting eksperimentet for å unngå frysing. - Plasser vitrifikasjonsfilterpapiret i vitrifikasjonsapparatkammeret ikke før 5 minutter før blottingeksperimentet.
MERK: Hvis du plasserer filterpapiret i kammeret for tidlig, blir det for vått.
4. Blotting eksperiment
MERK: Når du holder rutenettet, må du sørge for at rutenettet er stabilt og at det er et minimalt kontaktområde med pinsetten (figur 4). Dette gjøres for å opprettholde den beste kjøleeffektiviteten til etan og for å unngå ikke-glassaktig is.
- Bruk en pipettespiss til å påføre 7-9 μL av prøven på rutenettet. Vent deretter på 1-2 s, flekk i 1-1,5 s, og dypp prøven raskt til flytende etan.
- Overfør rutenettet fra flytende etan til kryoboksen, som lagres i flytende nitrogen.
MERK: Dette trinnet må utføres veldig nøye fordi pinsetten fortsatt er varm, så hele kjøletanken er full av damp på dette tidspunktet.
5. Kvalitetskontroll av rutenettene
- Klipp rutenettene og last dem opp til et cryo-EM-instrument.
- Bruk skjermen på cryo-EM-instrumentet og lavdosefunksjonen til programvaren for å skjerme istilstanden på rutenettet og fordelingen av prøven på rutenettet.
MERK: Ofte er ristene veldig tørre, eller islaget er for tykt. Suksessraten for ristene som er tilberedt ved høye temperaturer er vesentlig lavere enn ved romtemperatur eller 4 °C. Representative resultater av gode nett og ikke-tilfredsstillende nett er vist i neste avsnitt. - Hvis kvaliteten på det resulterende rutenettet ikke er bra, gjenta prosessen med nettforberedelse med varierte forhold (for eksempel ventetid, blottingstid, etc.). Hvis kvaliteten på det resulterende rutenettet er bra, gjenta de samme trinnene for å lage rister med en annen temperatur.
6. Innsamling av data
- Overfør rutenettene av god kvalitet til et høyoppløselig cryo-EM-instrument.
- Utføre datainnsamling og dataanalyser i henhold til etablerte prosedyrer.
MERK: Som vist i vår forrige publikasjon, påvirkes ikke oppløsningen av strukturen av høy temperatur12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversikten over lav forstørrelse er vist i figur 5A,B. Panel A er et eksempel på et vellykket rutenett. Det er en isgradient fra øverst til venstre (tykkere) til nederst til høyre (tynnere eller tom). Et slikt rutenett gjør det lettere å finne en passende tykkelse på islaget i midtområdet som er egnet for datainnsamling, for eksempel de blå og grønne boksene. Rutenettet B er for tørt. Rutene i rutenettet har lys kontrast, noe som betyr at islaget er for tynt eller det ikke er noe islag i det hele tatt. Bare de to rutene som er angitt med de røde pilene, er egnet for datainnsamling.
Videre er eksempler på lavdosebilder fra ulike rutenett vist i figur 5C,D. Bildet i panel C viser at det meste av isen er i krystallinsk form, ikke egnet for datainnsamling. På den annen side viser bildet i panel D at islaget for det meste er i en amorf tilstand, egnet for datainnsamling.
Vær oppmerksom på at dette er et kort papir med fokus på nettforberedelse ved høye temperaturer. Rutenettet inneholder bare eksemplet for datainnsamling. Et godt rutenett har en god sjanse, men ikke en klar sjanse, for å generere gode data for å løse en høyoppløselig struktur. De virkelige cryo-EM-dataene og de endelige strukturene for eksemplene beskrevet i denne artikkelen er allerede beskrevet i den publiserte artikkelen12. Kort sagt har vi fått gitter som er gode nok for datainnsamling, løst strukturene til to Sso-KARI-komplekser ved seks forskjellige temperaturer hver, og sammenlignet strukturene fra forskjellige temperaturer for hvert kompleks, samt strukturene mellom de to kompleksene fra samme temperatur. Resultatene indikerer at strukturen til hvert kompleks er temperaturavhengig og at de temperaturavhengige endringene er forskjellige mellom de to kompleksene. Det er viktig at de påfølgende strukturelle endringene korrelerer godt med de påfølgende temperaturendringene, noe som er en sterk indikasjon på suksessen til den temperaturavhengige prøvegitterforberedelsen.
Figur 1: Det samlede eksperimentelle oppsettet for høytemperatur cryo-EM-prøvepreparering. Elementene som vises inkluderer vitrifikasjonsapparat, inkubator, timer, pipettespissplassering, kjøletank og pinsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Modifisering av vitrifikasjonsapparatkammeret. Et 50 ml rør er installert ved ultralydsutløpet som angitt med den røde pilen12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Utseende av vitrifikasjonsapparatet under forsøket. Skjermen viser temperaturen ved 55 °C og fuktigheten ved 100 %. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bruke pinsett for å ta tak i rutenettet. Det anbefales at pinsetten griper rutenettet med så lite kontakt som mulig, men det må kunne holde rutenettet stabilt under driftsprosessen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Representative resultater: Rutenettkontroll av Cryo-EM. (A,B) viser rutenettets generelle tilstand. (C,D) viser eksempler på lavdosebilder fra ulike rutenett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I trinn 1 i protokollen må du kontrollere at sentrifugerøret er installert godt og ikke faller når eksperimentet pågår. På grunn av akkumulering av et stort antall vanndråper i kammeret, noe som kan endre adsorpsjonskapasiteten til filterpapiret, anbefales det at den totale tiden for forsøket ikke overstiger 30 minutter etter at vitrifikasjonsapparatkammeret nådde likevektstemperaturen. Hvis driftstiden overstiger 30 minutter, må operatøren bytte filterpapir og vente på at hytta balanserer temperatur og fuktighet igjen. Ved trinn 8 i protokollen er det foreslåtte prøvevolumet på 7-9 μL større enn vanlig, siden prøven ellers fordampes raskt ved høy temperatur, noe som fører til tomme firkanter på rutenettet. På den annen side anbefales det sterkt at prøven som påføres ikke overstiger 9 μL. Ellers er det svært sannsynlig at prøven vil dryppe ned under prosessen med å flytte pinsetten før blotting. Samlet sett er en nøkkel til suksessen til denne teknikken stabil og rask griping av rutenett og korrekt og stabil utførelse av hver tidsbegrenset handling. Videre anbefales det at hver forsøksrunde kun omhandler én spesifikk høy temperatur. Før du fortsetter å utføre eksperimentet ved en annen temperatur, må alle systemer være fullstendig gjenvunnet og tilbakestilt.
På grunn av kammerets høye temperatur og høye luftfuktighet, er vinduet ofte dekket av tåke som fører til vanskeligheter med å starte eksperimentet. Bruk av litt soapsuds anbefales å fjerne vinduet. Dersom rutenettet ikke er bra, kan det skyldes at trinnene beskrevet over ikke følges nøyaktig og/eller at trinnene tar for lang tid. Prøv å gjenta forberedelsen av prøvegitter med presisjon og hurtighet. Hvis rutenettene fortsatt ikke er gode etter gjentakelser, kan du prøve å justere forholdene. Det hyppigere problemet observert i dette eksperimentet er ingen is på rutenettet ved høy temperatur. I så fall, prøv å redusere blottingtiden ytterligere. På den annen side, hvis isen er for tykk, prøv å øke blottingtiden.
En begrensning av høytemperatur cryo-EM er at maksimal oppvarmingstemperatur på vitrifikasjonsapparatet er 60 °C. For å nå den høyere temperaturen ble prøven oppvarmet over 60 °C (f.eks. 80 °C), og gjennomsnittet mellom prøvetemperaturen og vitrifikasjonstemperaturen ble estimert til å være den reelle temperaturen til prøven på rutenettet (70 °C, i dette tilfellet). Det kan være noe unøyaktighet basert på denne estimeringen. En mulig fremtidig løsning er å bygge et termoelement for å måle netttemperaturen nøyaktig rett før stupfrysing. En annen potensiell begrensning er stabiliteten til proteinet ved høye temperaturer. Et eget eksperiment med sirkulær dikroisme bør utføres for å sikre at proteinet er stabilt ved temperaturen for det planlagte kryo-EM-eksperimentet.
En annen begrensning er at bare to typer kommersielt tilgjengelige vitrifikasjonsapparater kan varmes opp til over 37 °C og opp til 60 °C som nevnt ovenfor (f.eks. Thermo Fischer Vitrobot og Leica EM-GP). Vitrifikasjonsapparatene fra andre leverandører er enten begrenset til romtemperatur eller justerbare bare mellom 4 °C og 37 °C. Det er imidlertid mulig for forskningsgrupper å bygge sine egne stupeinnretninger med utvidede temperaturområder i fremtiden.
Vår protokoll er modifisert fra eksisterende protokoller 4,5,6, med det formål å forberede nettene ved temperaturer høyere enn romtemperatur. Uten å gjøre endringene som er beskrevet her, er sjansen for å lykkes med å lage gode høytemperaturprøvegitter egnet for cryo-EM-bildesamling svært liten.
To artikler i 2019 har vist at proteinstrukturer er temperaturavhengige, i sammenheng med temperaturavhengigheten av proteinfunksjoner, i området 4 °C til 42 °C for TRP-kanalen TRPV311 og 4 °C til 70 °C for Sso-KARI 12. Disse rapportene vil sannsynligvis oppmuntre til en endring i kryo-EM-forskning ved at flere fremtidige studier vil bli utført ved funksjonelt relevante temperaturer, vanligvis ved 37 °C. Stabiliteten til det rensede proteinet ved denne temperaturen kan være en bekymring. Det er imidlertid nødvendig å inkubere proteinprøven ved denne temperaturen i bare 2 minutter i henhold til vår protokoll. Alternativt kan fysiologiske forhold oppnås ved å avbilde proteiner i celler ved hjelp av tomografi og sub-tomo gjennomsnitt. Videre kan cryo-EM brukes til å studere mekanismen og mellomprodukter av protein som utfolder seg ved høye temperaturer, sannsynligvis i området 40 °C til 80 °C. Disse studiene vil alle dra nytte av protokollen som er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Hervé Remigy fra Thermo Fisher Scientific for nyttige råd. Kryo-EM-eksperimentene ble utført ved Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM er støttet av Academia Sinica (Grant nr. AS-CFII-108-110) og Taiwan Protein Project (Grant nr. AS-KPQ-109-TPP2). Forfatterne takker også Hui-Ju Huang for hjelpen med prøveprepareringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
