Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøgelse af strukturelle og dynamiske egenskaber ved handel med subcellulære nanostrukturer ved spatiotemporal fluktuationsspektroskopi

Published: August 16, 2021 doi: 10.3791/62790
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation@NEST CNI@NEST

Summary

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analyse anvendes på makropinosomer for at fremhæve deres iboende tidsudviklende natur med hensyn til strukturelle og dynamiske egenskaber. Makropinosomer sammenlignes derefter med insulinsekretoriske granulater (ISG'er) som reference for subcellulære strukturer med tidsinvariante gennemsnitlige strukturelle/dynamiske egenskaber.

Abstract

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) bruges til at adressere de strukturelle og dynamiske egenskaber ved subcellulære nanostrukturer, såsom vesikler involveret i endo / exocytotisk handel med opløste stoffer og biomolekyler. iMSD er afhængig af standard time-lapse-billeddannelse, er kompatibel med enhver optisk opsætning og behøver ikke at dvæle ved enkelte objekter for at udtrække baner. Fra hvert iMSD-spor beregnes en unik triplet af gennemsnitlige strukturelle og dynamiske parametre (dvs. størrelse, lokal diffusivitet, uregelmæssig koefficient) og kombineres for at opbygge "iMSD-signaturen" af den nanostruktur, der undersøges.

Styrken af denne tilgang er bevist her med det eksemplariske tilfælde af makropinosomer. Disse vesikler udvikler sig i tide og ændrer deres gennemsnitlige størrelse, antal og dynamiske egenskaber, der går fra tidlige til sene stadier af intracellulær handel. Som en kontrol anvendes insulinsekretoriske granulater (ISG'er) som reference for subcellulære strukturer, der lever i stationær tilstand, hvor de gennemsnitlige strukturelle og dynamiske egenskaber for hele populationen af objekter er uforanderlige i tide. iMSD-analysen fremhæver disse ejendommelige træk kvantitativt og baner vejen for lignende anvendelser på subcellulært niveau, både i de fysiologiske og patologiske tilstande.

Introduction

Subcellulære nanostrukturer (f.eks. endocytiske/sekretoriske vesikler, organeller) spiller en central rolle i cellesignaleringsregulering1. Korrekt indstilling af deres strukturelle (f.eks. Størrelse) og/eller dynamiske (f.eks. diffusivitet) egenskaber bestemmer, hvordan cellen reagerer på interne eller eksterne stimuli 2,3,4. Baseret på dette bevis er det ikke overraskende, at ændringer af disse egenskaber findes i mange patologiske tilstande. Eksempler omfatter den rolle, som misreguleret endocytose spiller i kræft 2,3, de strukturelle og dynamiske ændringer, der findes på niveauet af ISG'er i β-celler udsat for type 2-diabetesbetingelser5, misregulering af lysosomale strukturelle og transportegenskaber i globoid-celle leukodystrofi eller galactosylceramidlipidose6 og dysfunktionaliteter i den endo-lysosomale vej i neurodegenerative lidelser (f.eks. Alzheimers sygdom)7.

I denne sammenhæng har forskere for nylig bevist, at ydeevnen for standard optiske mikroskopimetoder kan forbedres ved korrekt indstilling af rumlig og tidsmæssig prøveudtagningsopløsning8. Dette kan igen give yderligere indsigt i biologiske processer af relevans. I praksis er dette muliggjort af en algoritme for spatiotemporal udsvingsanalyse, som samtidig ekstraherer de gennemsnitlige strukturelle og dynamiske egenskaber ved diffuserende objekter direkte fra standardstakken af optiske mikroskopibilleder uden behov for foreløbig viden om det biologiske objekt af interesse og ekstraktion af enkeltobjektbaner. Alle disse oplysninger er vedlagt i et enkelt output af metoden: et iMSD-spor9 (detaljer om iMSD-sporingsafledning og analyse findes i Supplerende fil 1).

Den resulterende eksperimentelle protokol består af et par trin. For det første udføres billeddannelse af interesseområdet ved høj tidsmæssig opløsning. Derefter beregnes gennemsnitlige rumlige-tidsmæssige korrelationsfunktioner ud fra stakken af billeder. Endelig opnås den gennemsnitlige 'diffusionslov' ved gaussisk tilpasning af serien af korrelationsfunktioner direkte fra billeddannelse og analyseres for at genkende objektdiffusionstilstanden. Metodens potentiale var allerede bevist for en række biologiske objekter, lige fra molekyler til nanopartikler og endda hele subcellulære organeller / strukturer 9,10,11,12,13,14,15.

Dette papir rapporterer iMSD-anvendelse på makropinosomer for at fremhæve deres iboende, irreversible tidsudviklende karakter med hensyn til deres gennemsnitlige (dvs. på hele befolkningsniveau) strukturelle og dynamiske egenskaber. Endvidere sammenlignes disse endocytiske vesikler med ISG'er som reference for subcellulære strukturer i en 'stationær tilstand', dvs. en tilstand, hvor de gennemsnitlige strukturelle/dynamiske egenskaber for hele populationen af granulater forbliver konstante på ethvert tidspunkt. Makropinocytose definerer en række begivenheder initieret af den omfattende omorganisering (eller ruffling) af plasmamembranen for at danne en ekstern makropinocytisk struktur, der derefter internaliseres16. De dannede makropinosomer i det tidlige stadium ligner meget fagosomer. Samtidig kan de skelnes fra andre former for endocytiske vesikler på grund af deres karakteristiske store størrelse, morfologiske heterogenitet og mangel på protein-coat strukturer.

Biokemiske assays afslørede, at makropinosomer ved internalisering gradvist bliver beriget med proteinmarkører af andre endocytiske veje, hvilket igen tyder på, at deres identiteter løbende ændrer sig under menneskehandel17. Ved hjælp af antistoffer mod kendte markører for den endosomale vej blev det påvist, at makropinosomer gradvist vedtager klassiske endosomale træk: de formindskes i størrelse, udvikler sig til sene endocytiske strukturer (f.eks. Lysosomer) eller til sidst mister deres identitet via membranmedieret hentning af specifikke molekylære markører (f.eks. Sortering af nexiner)18,19 . Det overordnede scenario er, at hvert eneste makropinosom i cellen irreversibelt ændrer sin strukturelle og dynamiske (såvel som molekylære) identitet under handel fra plasmamembranen til dens endelige intracellulære skæbne. Som følge heraf ændres de strukturelle/dynamiske/molekylære egenskaber for hele populationen af makropinosomer også langs den samme tidsmæssige vej. Da iMSD-metoden er iboende følsom over for de gennemsnitlige egenskaber for hele populationen af observerede objekter, skildrer den kvantitativt den "udviklende natur" ved kvantificering af vigtige gennemsnitsparametre, dvs. den lokale diffusivitet og unormale koefficient (dynamiske egenskaber) og den gennemsnitlige størrelse af makropinosomerne (strukturelle egenskaber) på ethvert stadium af deres intracellulære handel.

Til sammenligning blev lignende målinger udført på en velkendt intracellulær membranlukket struktur, ISG, i en model af β-celler. Ligesom makropinosomer er reguleringen af ISG'ernes strukturelle og dynamiske egenskaber, fra deres genese ved Trans Golgi-netværket (TGN) til deres exocytose ved plasmamembranen, afgørende for korrekt udførelse af ISG-funktion20. I modsætning til makropinosomer lever ISG'er imidlertid i en 'stationær tilstand', hvor alle de funktionelle/strukturelle/molekylære stadier af ISG-levetiden til enhver tid er til stede samtidigt i cellen, og hver er repræsenteret af en specifik underpopulation af ISG'er. Det betyder, at selv om hvert enkelt granulat irreversibelt udvikler sig fra biogenese til sekretion, forventes de gennemsnitlige strukturelle/dynamiske egenskaber for hele granulpopulationen at forblive konstante på ethvert tidspunkt (medmindre de stationære tilstandsbetingelser ændres, for eksempel af eksterne stimuli såsom glukose, kolesterol og cytokiner13). Dette bekræftes af iMSD-analyse.

Protocol

1. Prøveforberedelse

  1. Før mikroskopieksperimentet, subkulturceller i retter egnet til mikroskopi applikationer.
    1. Vask en 10 cm vævskulturbehandlet skål med sammenflydende HeLa eller INS 1E (insulinom β-cellelignende) celler to gange med 0,01 M 1x PBS, tilsæt 1 ml 0,05% trypsin-EDTA (1x), og læg den i en 37 ° C, befugtet, 5% CO 2-inkubator i 5 minutter.
    2. Resuspend de løsrevne celler ved at tilføje 9 ml komplet DMEM (for HeLa-celler) eller RPMI 1640 (for INS-1E-celler) medium, og opsaml de sidste 10 ml i centrifugerør.
    3. Frø ca. 2 × 105 celler i hver 35 mm x 10 mm skål i et endeligt volumen på 1 ml af mediet. Inkuber cellerne i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
  2. For at fluorescerende mærke lysosomer skal du bruge LysoTracker Red DND-99.
    1. Fortynd stamopløsningen i 1 ml forvarmet medium til en endelig farvestofkoncentration på 70 nM.
    2. Udskift mediet fra fadet med frisk LysoTracker-holdige medium. Inkuber cellerne i LysoTracker-holdige medium i 20 minutter ved 37 °C i en 5% CO2 - atmosfære, og vask dem to gange med frisk medium før eksperimentet.
    3. For fluorescerende mærkning af makropinosomer skal du bruge 70-kDa fluorescein isothiocyanat-dextran. De subkulturerede celler vaskes tre gange med 0,01 M 1x fosfatbufret saltvand (PBS), erstattes med dextranholdigt medium (1 mg/ml) og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Før du fortsætter med mikroskopieksperimentet, skal du vaske cellerne tre gange med frisk medium.
    4. For fluorescerende mærkning af ISG'er i INS-1E-celler skal du transfektere cellerne ved hjælp af transfektionsreagens (se materialetabellen) og C-peptidforstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) plasmid13 i henhold til producentens protokol og inkubere ved 37 ° C i 24 timer i en 5% CO2 - atmosfære før eksperimentet.

2. Dataindsamling

  1. For at lade mikroskopet udligne ved den ønskede temperatur og atmosfære skal du tænde mikroskopets inkubatorstyresystem mindst 2 timer før eksperimentet.
    BEMÆRK: Hver erhvervelse er en time-lapse-serie.
  2. Anskaf billederne ved hjælp af et omvendt konfokalmikroskop udstyret med et 60x, 1,2 numerisk blænde (NA) vandnedsænkningsmål.
  3. Brug en 488 nm Argon-laser til excitation af EGFP (transfekterede celler) og fluoresceinmærkede makropinosomer. Opsaml fluorescensemissionen mellem 500 og 600 nm ved hjælp af en standard fotomultiplikatorrørdetektor.
  4. Brug en 543 nm HeNe-laser til at ophidse Lysotracker og indsamle dens fluorescensemission mellem 555 og 655 nm.
  5. Indstil diameteren på detektionshullet til størrelsen 1 Luftig. For hver erhvervelse skal du samle en serie på 1000 sekventielle rammer. Indstil pixel-opholdstiden til 2 μs/pixel for en billedtid på 129 ms.
    BEMÆRK: Hver ramme bestod af 256 x 256 pixels (16 bit/pixel) med en fysisk dimension på 69 nm/pixel, svarende ca. til et areal på 17 μm x 17 μm.

3. iberegning af muskel- og skeletsret

BEMÆRK: For at udføre beregningen korrekt skal du bruge software, der er i stand til numerisk beregning og scriptprogrammering. Det specifikke script (dvs. for scriptfilen "iMSD.m", se Understøttende fil 1) skal være til stede i den samme mappe, der indeholder den billedserie, der skal behandles. Hvert billede i serien skal gemmes som en særskilt '.tif'-fil.

  1. For korrekt initialisering af de instrumentelle parametre, der bruges til erhvervelserne, skal du åbne iMSD.m med softwareteksteditoren og ændre dens første afsnit som følger.
    1. Indstil N som antallet af billeder i tidsserien (f.eks. 1000 i denne protokol).
    2. Indstil px_size: pixelstørrelse, udtrykt i μm (f.eks. 0,069 i denne protokol).
    3. Sæt f: tidsmæssig opløsning af hver ramme, udtrykt i sekunder (f.eks. 0,129 i denne protokol).
    4. Indstil filter: binært input til baggrundskorrektion, indstil værdien til '0' for at behandle raw-billeder, eller indstil værdien til '1' for at udføre en tærskelbaseret baggrundssubtraktion.
    5. Indstil av_toll: tærskel for baggrundskorrektion; enhver pixel med en intensitet, der er lavere end denne værdi, indstilles til 0, hvis Filter=1.
    6. Indstil bit som heltalsnummeret, der bestemmer intensitetsprøveudtagningen (f.eks. 8 bit, 16 bit).
  2. Gem og kør den redigerede iMSD.m-scriptfil.
  3. Kontroller scriptudførelsen.
    BEMÆRK: Beregningsbehandlingsstatus kan kontrolleres i kommandovinduet; Hvis der opstår et fatalt problem, afbrydes processen, og der vises en advarselsmeddelelse for at vise fejltypen og den relaterede linjekode. Ellers skal du følge trin 3.3.1-3.3.3.
    1. Importer billedstakken, og træk baggrunden fra (hvis det er nødvendigt).
    2. Beregn den spatiotemporale korrelationsfunktion G(ξ,η,τ) ved hjælp af Fourier-metoden.
    3. Tilpas den spatiotemporale korrelationsfunktion med en 2D Gaussisk funktion.
      BEMÆRK: Ved afslutningen af processen vises outputværdierne for σ2(τ) tilpasningsprocedurerne i kommandovinduet: gennemsnit, fejl og tilsvarende godhed (R 2) aftilpasningen rapporteres.
  4. Kontroller det grafiske output.
    BEMÆRK: iMSD-kurven og de tilsvarende tilpasningskurver er vist i tre separate paneler, hver for en anden type passende ligning, der anvendes: Brownsk diffusion, uregelmæssig diffusion eller begrænset diffusion. For hver kurve rapporteres R2-værdien i grafforklaringen.
  5. Kontroller tekstoutputtet.
    BEMÆRK: I slutningen af processen oprettes en '.xls'-fil med samme navn som den oprindelige time-lapse'-fil '.tif'. Det første ark indeholder værdierne ξ, η, τ og σ2 beregnet for hver tidsforsinkelse. Inputparametrene og de vigtigste beregnede outputværdier rapporteres i det andet ark, dvs. diffusionskoefficient, unormal koefficient og y-akse σ20-aflytning .

Representative Results

Metodens generelle arbejdsgang er vist i figur 1. Det rekapitulerer de vigtigste trin, der præsenteres i protokolafsnittet, fra prøveforberedelse (figur 1A) til time-lapse-billeddannelse af intracellulære nanostrukturer (figur 1B), fluktuationsanalyse til beregning af serien af spatiotemporale korrelationsfunktioner (figur 1C) og tilpasning til afledning af de gennemsnitlige strukturelle / dynamiske egenskaber for objektet under undersøgelse (figur 1D).

En kritisk parameter er den tidsopløsning, der er vedtaget til billeddannelse af det subcellulære objekt af interesse. Denne eksperimentelle værdi vil indstille tidstærsklen, hvor den mindste gennemsnitlige forskydning af objekterne af interesse vil blive målt. Den foretrukne betingelse er imidlertid at indstille en tidsopløsning af billeddannelse, hvor objektet af interesse fremstår 'ubevægeligt' inden for den optagne ramme, dvs. det viser en karakteristisk størrelse, der i gennemsnit ikke deformeres på grund af billeddannelseshastigheden. Dette er teknisk muligt, hvis objektet af interesse er en membranlukket subcellulær struktur eller organel (som i dette tilfælde). Subcellulære strukturer udviser typisk lokale diffusionskoefficienter (D, μm2/s, se tabel 1), der er flere størrelsesordener lavere end for isolerede enkeltmolekyler i cytoplasmaet (f.eks. GFP21). Validering kan udføres ved kunstigt at immobilisere den organelle af interesse (f.eks. Ved kemisk fiksering). Faktisk kan denne tilstand tjene som en reference til bestemmelse af den faktiske organelstørrelse under de anvendte eksperimentelle betingelser (f.eks. Excitationsbølgelængde, pixelstørrelse, mål).

Her, selvom lysosomer blev anvendt som testorganeller til denne procedure, er resultaterne gyldige uafhængigt af målstrukturen. Figur 2A viser et billede af et fast (dvs. immobilt) lysosom sammen med en erhvervelse udført på levende celler i den passende tidsmæssige opløsning (dvs. typisk under 100 ms/frame; f.eks. 65 ms/frame i eksemplet i figur 2B) og en erhvervelse udført forsætligt ved meget lav tidsmæssig opløsning (f.eks. 10 s/frame i eksemplet i figur 2C ). For hver betingelse ekstraheres størrelsen af det diffuserende objekt som følger: i) en intensitetsprofil af stedet er afledt af linjeværktøjet i ImageJ-softwaren; ii) intensitetsprofilen afbildes og interpoleres af en gaussisk funktion til beregning af den fulde bredde ved halv maksimal (FWHM) værdi, der igen bruges som et skøn over spotdiameteren (figur 2D). Som forventet og vist i plottet i figur 2E giver erhvervelsen ved meget høj tidsmæssig opløsning (dvs. 65 ms/ramme) en gennemsnitlig størrelse af strukturen tæt på den, der opnås i den faste prøve, enten ved hjælp af det ovenfor beskrevne standardværktøj eller ved at udtrække iMSD y-akse-aflytningen. I stedet giver erhvervelsen ved langsom hastighed en stigning i strukturens tilsyneladende størrelse på grund af den naturlige strukturdynamik under billeddannelse. Under suboptimale eksperimentelle forhold afspejler den strukturelle/dynamiske information, der ekstraheres, ikke trofast de iboende egenskaber ved det undersøgte objekt.

Når de vigtigste eksperimentelle parametre er valgt, kan datasæt produceres til de målintercellulære strukturer. For makropinosomer blev der efter 20 minutters inkubation af cellerne med 70 kDa dextrans erhvervet tidsserier af de mærkede intracellulære strukturer på forskellige tidspunkter efter behandling, fra 30 minutter op til ca. 180 minutter. Interessant nok opdages en gradvis ændring i makropinosomers strukturelle og dynamiske egenskaber under menneskehandel (figur 3; fordelinger af σ02, Dm, α og N for makropinosomer rapporteres i plottene til venstre). Selv om der ikke opdages nogen åbenlyse ændringer i makropinosomers lokale diffusivitet (Dm) under menneskehandel, udvikler både den karakteristiske størrelse (σ02) og den overordnede bevægelsesmåde (α) sig i tide.

Det bemærkes især, at der observeres et fald i makropinosomernes gennemsnitlige størrelse under menneskehandel (figur 3A, til venstre) sammen med en samtidig stigning i deres bevægelses subdiffusive karakter (dvs. betegnet som et fald i α værdier, figur 3C, venstre panel). Derudover blev antallet af makropinosomer ekstraheret fra hver erhvervelse: Resultaterne, der er rapporteret i figur 3D, venstre panel, afslører tydeligt en stigning i antallet af makropinosomer i tide. Alle disse resultater er i god overensstemmelse med forventningerne, fordi dextran-mærkede makropinosomer formodes at stamme fra isolerede, store membranlukkede vesikler ved plasmamembranen (som også er kompetente til bevægelse langs cytoskeletale komponenter), men formodes gradvist at kommunikere med den endo-lysosomale vej, der består af en stor population af mindre og tilfældigt diffuserende strukturer.

Som forventet ovenfor er resultaterne for makropinosomer i modsætning til lignende målinger udført på ISG'er (figur 3, højre kolonne). Insulingranulater viser ikke en tidsudviklende tendens til de iMSD-afledte strukturelle/dynamiske parametre (og deres gennemsnitlige antal i cellen) i det samme tidsvindue, der observeres for makropinosomer. Desuden er de karakteristiske værdier af σ02, Dm og α helt forskellige fra lysosomer, der anvendes igen som reference. Dette resultat bekræfter ideen om, som forventet ovenfor, at granulater undersøges i en 'stationær tilstand', hvor de gennemsnitlige strukturelle/dynamiske egenskaber for hele populationen af ISG'er til enhver tid er uændrede (dvs. de forbliver konstante, medmindre de stationære tilstandsforhold ændres, for eksempel på grund af eksterne stimuli).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel arbejdsgang. (A) Celler blev belagt 24 timer (48 timer til transfektionseksperimenter) før konfokale eksperimenter på celleskåle, der var egnede til mikroskopiske anvendelser. Celler blev derefter passende behandlet i henhold til mærkningsmetoden (se protokol) for at plette den cytoplasmatiske organel af interesse. (B) En typisk konfokal erhvervelse består af en stak billeder (time-lapse) af en cytoplasmatisk del af en levende celle, der beskriver tidsudviklingen af mærket organeldynamik. (C) Time-lapse-film analyseres med et specialfremstillet Matlab-script, der først beregner spatiotemporal billedkorrelationsfunktion og Gaussisk tilpasning til plot af iMSD-kurver (D) og relaterede ekstraherede tilpasningsparametre, der beskriver strukturelle dynamikparametre for afbildede organeller. Forkortelser: iMSD = billedafledt gennemsnitlig kvadratisk forskydning; STICS = spatiotemporal billedkorrelationsspektroskopi; α = uregelmæssig diffusionskoefficient; Dm = lokal diffusivitet; σ2(τ) = varians. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Korrekte eksperimentelle parametre. (A) Eksemplarisk billede af farvede lysosomer i en fast prøve. Skalabjælke = 2 μm. (B) Den første ramme af en stak billeder af farvede lysosomer i en levende celle, erhvervet med de relevante parametre. Tidsmæssig opløsning: 65 ms/ramme. Skalabjælke = 2 μm. (C) Den første ramme af en stak billeder af farvede lysosomer i en levende celle, erhvervet ved lav hastighed: kunstig deformation af den tilsyneladende lysosomstørrelse på grund af organelbevægelse under billeddannelse er synlig. Tidsmæssig opløsning: 10 s/ramme. Skalabjælke = 2 μm. (D) Eksempel på størrelsesberegning for afbildede lysosomer i et blåt investeringsafkast på (A), (B) og (C). Intensitetsprofilen langs den blå linje var udstyret med en gaussisk funktion til at hente FWHM, dvs. et skøn over pletstørrelsen. FWHM-værdier rapporteres for hvert beslag. (E) Grafisk repræsentation af størrelsesværdier opnået ved billedanalyse beskrevet i panel (D) for alle afbildede lysosomer (sort firkant, middelværdi og standardafvigelse), for lysosomer indesluttet i det blå ROI (blå trekant) og hentet ved iMSD-analyse (rød cirkel). Dette tal er fra 22. Forkortelser: ROI = region af interesse; FWHM = fuld bredde ved halv maksimum; iMSD = billedafledt gennemsnitlig kvadratisk forskydning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Tidsmæssig udvikling af mærkede organeller. (A) Plots af iMSD-ekstraherede størrelsesværdier vs. tidsprogression af efterfølgende erhvervelser repræsenteret som et gennemsnit af målte værdier i erhvervelser udført på et 10-minutters tidsvindue. Til venstre er progressiv reduktion i den gennemsnitlige størrelse af makropinosomer (sorte cirkler) og til højre den tidsinvariante størrelse af insulinsekretoriske granulater (sorte firkanter) sammenlignet med lysosomer, repræsenteret som gennemsnitlig størrelsesværdi (tykkere rød linje) ± standardafvigelse (stiplede røde linjer). (B) og (C) Tidsprogression af Dm og α koefficienter for makropinosomer (venstre) og insulingranulat (højre) ekstraheret ved iMSD-analyse. D) Tidsudvikling af antallet af mærkede makropinosomer og insulingranulater målt i det første billede af hver erhvervet timelapse-film. Forkortelser: iMSD = billedafledt gennemsnitlig kvadratisk forskydning; α = uregelmæssig diffusionskoefficient; Dm = lokal diffusivitet, N = tal. Klik her for at se en større version af denne figur.

Organelle Mærkning Celle linje Størrelse (nm) Dm ( × 10-3 μm2/s) α N Ref.
Tidligt endosom (EE) CellLight tidlig endosom GFP Hela 395±74 3.0±2.4 1.02±0.20 40 10
Sen endosom (LE) CellLight Late Endosome GFP Hela 693±102 15.4±10.6 0.57±0.16 58 10
Lysosom (LY) LysoTracker DND-99 Hela 471±76 15.3±9.0 0.49±0.13 143 10, 14
Caveola (CAV) Caveolin-EGFP Hela 405±49 3.1±1.8 13.00±0.22 15 10
Clathrin Coated Vescicle (CCV) Transferrin-Alexa 488 Hela 513±62 16.2±9.9 0.48±0.17 33 10
Insulingranulat (IG) C-peptid-EGFP INS-1E 335±56 3.0±1.7 0.70±0.14 107 11
Tidligt makropinosom (EMCR) Fluorescein-Dextran 70 kDa Hela 979±423 8.3±9 0.79±0.27 36 10
Mellemliggende makropinosom (IMCR) Fluorescein-Dextran 70 kDa Hela 702±180 13.7±19.9 0.60±0.38 29 10
Sent makropinosom (LMCR) Fluorescein-Dextran 70 kDa Hela 592±127 5.8±4.7 0.39±0.21 21 10

Tabel 1: Strukturelle og dynamiske iMSD-ekstraherede parametre. Tabellen viser værdierne for størrelse, Dm og α koefficient målt for forskellige organeller med angivelse af mærkningsstrategier, den anvendte cellelinje og antallet af analyserede erhvervelser. Værdier rapporteres som gennemsnitlig ± standardafvigelse. Forkortelser: iMSD = billedafledt gennemsnitlig kvadratisk forskydning; α = uregelmæssig diffusionskoefficient; Dm = lokal diffusivitet, N = antal; GFP = grønt fluorescerende protein; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein.

Supplerende fil 1: Detaljer om iMSD-sporingsafledning og -analyse. Klik her for at downloade denne fil.

Understøttende fil 1: Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Egenskaberne og fordelene ved iMSD er tydelige sammenlignet med de tilgængelige teknikker til at hente analog information. For strukturel information er det foretrukne valg transmissionselektronmikroskopi (TEM) analyse. Ved denne metode kan ultrastrukturelle detaljer ved molekylær opløsning og endda ud over hentes, selv for subcellulære nanostrukturer. Ikke desto mindre opnås den ejendommelige rumlige opløsning af TEM på bekostning af oplysningerne i den tidsmæssige dimension, som er af interesse her. For at kompensere for dette er de seneste fremskridt inden for levende cellebilleddannelsesteknologier af særlig interesse. Disse omfatter nye fluorescerende markører med øget ydeevne (f.eks. Lysstyrke og fotostabilitet), optimerede mærkningsprocedurer og mere følsomme detektorer. Derudover er der analyseværktøjer til rådighed til at adressere både strukturelle (f.eks. 'størrelse' ved fasorbaseret analyse af lokal billedkorrelationsspektroskopi, PLICS23, aggregering/oligomerisering ved tal&lysstyrkeanalyse24) og dynamisk (f.eks. diffusionslov ved enkeltpartikelsporing, dvs. (SPT)25,26,27,28 ) parametre på den subcellulære skala. SPT-metoden giver direkte adgang til objektets bane og dets MSD. Ulempen er imidlertid behovet for en lav densitet af sonden og meget lyse etiketter og mange enkeltobjektbaner, der skal måles for at opfylde statistiske kriterier. Med hensyn til målingens tidsmæssige opløsning kan uorganiske, fotostable sonder (f.eks. kvanteprikker eller metalnanopartikler) øge SPT-ydeevnen, men på bekostning af komplekse produktions- og mærkningsprocedurer.

Sammenlignet med disse standarder viser iMSD-metoden, der er beskrevet her, nogle vigtige fordele. For det første kan denne tilgang anvendes sammen med relativt svage fluorescerende tags, såsom genetisk kodede fluorescerende proteiner (f.eks. Anvendelsen på ISG'er). Sammenlignet med SPT opnås således en højere tidsmæssig opløsning (ved hjælp af den samme etiket) på grund af den lavere mængde fotoner, der kræves8. For det andet er iMSD-metoden kun begrænset af den tidsmæssige opløsning, men ikke diffraktion. På trods af den anvendte diffraktionsbegrænsede optiske opsætning kan gennemsnitlige molekylære forskydninger selv under diffraktionsgrænsen måles, som allerede påvist for molekylære strømme ved anvendelse af STICS29. Den faktiske opløsning i målingen af forskydninger afhænger af, hvor præcist (med hensyn til signal til støj) korrelationsfunktionen kan måles, hvilket forklarer, hvorfor den ikke er begrænset af diffraktion. Det forekommer således klart, at den mindste forskydning, der kan måles, afhænger af diffusiviteten af objektet af interesse og den tidsmæssige opløsning af billeddannelsesopsætningen.

I den henseende er det vigtigt at overveje, at anvendelse på subcellulære nanostrukturer, såsom makropinosomer eller insulingranulater, med et laserscanningsmikroskop er optimal: den tilgængelige scanningshastighed er signifikant højere end dynamikken i objektet af interesse. I et sådant tilfælde er bevægelsen af objekterne under erhvervelsen ubetydelig, og korrelationsfunktionen kan tilnærmes af en gaussisk funktion. Endelig kan iMSD-tilgangen let anvendes på en lang række kommercielle optiske mikroskopiopsætninger baseret på rasterscanning eller vidvinkelkamerabaseret billeddannelse uden behov for systemkalibrering (kræves kun, hvis der skal opnås et nøjagtigt skøn over partikelstørrelsen). En vigtig parameter for, at metoden kan fungere, er korrekt rumlig prøveudtagning. For at opnå en tilfredsstillende konvergens mellem tilpasningsalgoritmen bør minimumsstørrelsen af det område, der er af interesse for billeddannelse, som hovedregel være mindst 3 gange større end den maksimale forskydning af interesse.

Afslutningsvis kræver iMSD-metoden kun et mikroskop udstyret til hurtig erhvervelse. Strukturen af interesse kan mærkes til enhver genetisk kodet eller organisk fluorofor, hvilket muliggør multikanals billeddannelse. Det forventes, at cross-iMSD-analyse vil blive brugt i den nærmeste fremtid til at vælge subpopulationer af subcellulære nanostrukturer og afsløre deres interaktioner og co-diffusion i cellen, hvor sidstnævnte er et varmt emne inden for cellulær biofysik. Hvis nogen detaljer går tabt ved iMSD-analyse, er dette bestemt relateret til den store mængde molekylær information inden for dynamiske subcellulære nanostrukturer. Sådanne oplysninger er uundgåeligt gennemsnitlige under målingen på grund af dårlig tidsmæssig opløsning. Teoretisk set er der imidlertid ingen teknisk grænse på grund af muligheden for at hente molekylær information, forudsat at der kan opnås tilstrækkelige anskaffelseshastigheder8. På grund af de løbende forbedringer i detektorhastighed / følsomhed og billeddannelsesteknologier forventes det, at information om hele det subcellulære rum og dets molekylære bestanddele vil blive ekstraheret fra et enkelt datasæt.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (EFR) under EU's Forsknings- og Innovationsprogram Horisont 2020 (tilskudsaftale nr. 866127, projekt CAPTUR3D).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine Gibco 10378-016 Cell medium supplement
C-peptide-EGFP Plasmid
DMEM High Glucose Gibco 31053028 Cell medium (HeLa)
FBS Gibco 10082147 Cell medium supplement
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa Sigma Aldrich 46945-100MG-F Reagent
HeLa ATCC CCL-61 Cell Line
Lipofectamine 2000 TermoFisher 11668019 Trasfection reagent
Lysotracker Red DND-99 Gibco L7528 Reagent
Matlab MathWork Software
Microscope-suitable cell dishes Willco GWSt-3522 Petri dishes
Olympus FV1000 Olympus Japan Confocal microscope
RPMI 1640 Gibco 11835063 Cell medium (INS-1E)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murphy, J. E., Padilla, B. E., Hasdemir, B., Cottrell, G. S., Bunnett, N. W. Endosomes: a legitimate platform for the signaling train. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17615-17622 (2009).
  2. Mosesson, Y., Mills, G. B., Yarden, Y. Derailed endocytosis: an emerging feature of cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (11), 835-850 (2008).
  3. Mellman, I., Yarden, Y. Endocytosis and cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (12), 016949 (2013).
  4. Di Fiore, P. P. Endocytosis, signaling and cancer, much more than meets the eye. Preface. Molecular Oncology. 3 (4), 273-279 (2009).
  5. Bogan, J. S., Xu, Y., Hao, M. Cholesterol accumulation increases insulin granule size and impairs membrane trafficking. Traffic. 13 (11), 1466-1480 (2012).
  6. Ballabio, A., Gieselmann, V. Lysosomal disorders: From storage to cellular damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (4), 684-696 (2009).
  7. Hu, Y. -B., Dammer, E. B., Ren, R. -J., Wang, G. The endosomal-lysosomal system: from acidification and cargo sorting to neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 4, 18 (2015).
  8. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Spatiotemporal fluctuation analysis: a powerful tool for the future nanoscopy of molecular processes. Biophysical Journal. 111 (4), 679-685 (2016).
  9. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12307-12312 (2013).
  10. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51994 (2014).
  11. Digiacomo, L., et al. Dynamic fingerprinting of sub-cellular nanostructures by image mean square displacement analysis. Scientific Reports. 7 (1), 14836 (2017).
  12. Durso, W., et al. Lysosome dynamic properties during neuronal stem cell differentiation studied by spatiotemporal fluctuation spectroscopy and organelle tracking. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3397 (2020).
  13. Ferri, G., et al. Insulin secretory granules labelled with phogrin-fluorescent proteins show alterations in size, mobility and responsiveness to glucose stimulation in living β-cells. Scientific Reports. 9 (1), 2890 (2019).
  14. Durso, W., D'Autilia, F., Amodeo, R., Marchetti, L., Cardarelli, F. Probing labeling-induced lysosome alterations in living cells by imaging-derived mean squared displacement analysis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2704-2709 (2018).
  15. Digiacomo, L., Digman, M. A., Gratton, E., Caracciolo, G. Development of an image Mean Square Displacement (iMSD)-based method as a novel approach to study the intracellular trafficking of nanoparticles. Acta Biomaterialia. 42, 189-198 (2016).
  16. Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
  17. Jones, A. T. Macropinocytosis: searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 670-684 (2007).
  18. Falcone, S., et al. Macropinocytosis: regulated coordination of endocytic and exocytic membrane traffic events. Journal of Cell Science. 119, Pt 22 4758-4769 (2006).
  19. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 3967-3980 (2006).
  20. Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
  21. Di Rienzo, C., Piazza, V., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Probing short-range protein Brownian motion in the cytoplasm of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5891 (2014).
  22. Ferri, G., et al. Time-lapse confocal imaging datasets to assess structural and dynamic properties of subcellular nanostructures. Scientific Data. 5 (1), 180191 (2018).
  23. Scipioni, L., Gratton, E., Diaspro, A., Lanzanò, L. Phasor analysis of local ICS detects heterogeneity in size and number of intracellular vesicles. Biophysical Journal. 111 (3), 619-629 (2016).
  24. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  25. Li, C. H., Bai, L., Li, D. D., Xia, S., Xu, T. Dynamic tracking and mobility analysis of single GLUT4 storage vesicle in live 3T3-L1 cells. Cell Research. 14 (6), 480-486 (2004).
  26. Donovan, K. W., Bretscher, A. Tracking individual secretory vesicles during exocytosis reveals an ordered and regulated process. Journal of Cell Biology. 210 (2), 181-189 (2015).
  27. Westphal, V., et al. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
  28. Tabei, S. M. A., et al. Intracellular transport of insulin granules is a subordinated random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 4911-4916 (2013).
  29. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).

Tags

Biologi udgave 174
Undersøgelse af strukturelle og dynamiske egenskaber ved handel med subcellulære nanostrukturer ved spatiotemporal fluktuationsspektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ferri, G., Azzarello, F., D'Autilia, … More

Ferri, G., Azzarello, F., D'Autilia, F., Cardarelli, F. Probing Structural and Dynamic Properties of Trafficking Subcellular Nanostructures by Spatiotemporal Fluctuation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (174), e62790, doi:10.3791/62790 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter