Summary
Los explantes de blastodermo de pez cebra se generan aislando células embrionarias de centros de señalización endógenos dentro del embrión temprano, produciendo grupos de células relativamente ingenuos fácilmente manipulados y cultivados ex vivo. Este artículo proporciona instrucciones para hacer tales explantes y demuestra su utilidad al interrogar los roles para la señalización nodal durante la gastrulación.
Abstract
Debido a su claridad óptica y rápido desarrollo, los embriones de pez cebra son un excelente sistema para examinar los comportamientos celulares y los procesos de desarrollo. Sin embargo, debido a la complejidad y redundancia de las señales embrionarias, puede ser difícil discernir el papel completo de cualquier señal individual durante la embriogénesis temprana. Al explantar la región animal del blastodermo del pez cebra, se generan grupos relativamente ingenuos de células embrionarias que pueden cultivarse y manipularse fácilmente ex vivo. Al introducir un gen de interés por inyección de ARN antes de la explantación, se puede evaluar el efecto de esta molécula en la expresión génica, los comportamientos celulares y otros procesos de desarrollo en relativo aislamiento. Además, las células de embriones de diferentes genotipos o condiciones se pueden combinar en un solo explante quimérico para examinar las interacciones célula/tejido y las funciones genéticas específicas del tejido. Este artículo proporciona instrucciones para generar explantes de blastodermo de pez cebra y demuestra que una sola molécula de señalización, un ligando nodal, es suficiente para inducir la formación de capas germinales y la morfogénesis de extensión en tejidos embrionarios que de otro modo serían ingenuos. Debido a su capacidad para recapitular los comportamientos de las células embrionarias, los gradientes de morfógenos y los patrones de expresión génica en un sistema ex vivo simplificado, se prevé que estos explantes sean de gran utilidad para muchos investigadores de peces cebra.
Introduction
Un objetivo perenne del campo de la biología del desarrollo es desentrañar la complejidad de los embriones en desarrollo para comprender el origen de la forma y función animal. Incluso los embriones tempranos contienen una compleja mezcla de moléculas de señalización, interacciones celulares y tisulares, y fuerzas mecánicas, todas sujetas a una estricta regulación espacial y temporal. Por esta razón, a menudo es difícil identificar el papel preciso de una señal particular en un proceso de desarrollo de interés. Al eliminar los tejidos embrionarios de su entorno endógeno, la explantación embrionaria crea una plataforma simplificada en la que discernir los roles de desarrollo de los tejidos y moléculas individuales en relativo aislamiento. Las técnicas de explantación son quizás más conocidas en Xenopus laevis,donde se han utilizado para estudiar la inducción tisular, la señalización celular, la adhesión celular y la morfogénesis, entre otros procesos1,2,3,4. Los llamados explantes de capuchón animal, en los que se aísla la región animal de los embriones de Xenopus en etapa de blástula antes de las interacciones inductivas5,6,7,son una técnica de explante generalizada y poderosa. Las tapas de animales no manipuladas están destinados a convertirse en ectodermo7,8. Aún así, son competentes para responder a varios factores inductivos, lo que les permite formar tejidos de las tres capas germinales y someterse a movimientos morfogenéticos apropiados para el tejido9,10,11. Sin embargo, las herramientas genéticas limitadas y la idoneidad subóptima para imágenes en vivo impiden el uso de explantes de gorra animal Xenopus para muchos biólogos del desarrollo. Al explantar células de blastodermo de embriones de pez cebra, los investigadores pueden combinar la utilidad del ensayo de la tapa animal con la claridad óptica, la abundancia de herramientas genéticas y otras ventajas experimentales del sistema modelo de pez cebra.
Hasta la fecha, los investigadores han hecho uso de dos sabores de explantes de pez cebra: los llamados pescoides y los explantes blastoderm. En el modelo pescoide, todo el blastodermo, incluida la zona marginal, se aísla de la yema y se permite desarrollar ex vivo sin la capa sincitial de yema extraembrionario (YSL)12,13. De esta manera, los pescoides guardan un notable parecido con los explantes de Fundulus generados hace décadas por Jane Oppenheimer y J.P. Trinkaus14,15. Estos explantes recapitulan muchos aspectos del patrón embrionario y la morfogénesis12,13. Sin embargo, debido a que estos aislados contienen centros de señalización endógenos (el margen embrionario), no se simplifican con respecto a su entorno molecular. Alternativamente, los investigadores pueden generar explantes de blastodermo de pez cebra relativamente ingenuos excluyendo la zona marginal16,17,18,19,20,21. Los explantes de blastodermo de pez cebra no manipulados expresan altos niveles de morfógenos de proteína morfogenética ósea (BMP)19 y dan lugar a ectodermo no neural y capa envolvente (EVL) cuando se cultivan ex vivo18. Sin embargo, recapitulan muchos aspectos del patrón axial y la morfogénesis en respuesta a gradientes de señalización exógenos19,20,21,similares a las tapas de animales Xenopus. Por esta razón, los explantes de blastoderm son un modelo ventajoso para estudiar el papel de un morfógeno dado (o morfógenos) en la especificación de la capa germinal, los movimientos celulares morfogenéticos y los gradientes de señalización dentro de un entorno de señalización simplificado. Además, los blastodermos de embriones de diferentes genotipos o condiciones se pueden combinar en un solo explante quimérico19,21 para investigar la autonomía célula/tejido y las interacciones inductivas.
Los explantes de blastodermo de pez cebra se pueden utilizar para investigar el papel de las señales embrionarias (por ejemplo, nodales) en la morfogénesis y la especificación de tejidos durante la gastrulación. Al inyectar ARN ndr2 sintético (que codifica un ligando ganglionar) en la etapa unicelular, la señalización ganglionar se activa en todo el blastodermo del embrión. Los explantes de estos embriones generan gradientes de señalización nodal, forman las tres capas germinales y experimentan movimientos de gastrulación de convergencia y extensión (C&E) como se ve en embriones intactos20. Además, los explantes quiméricos se utilizan para ilustrar la capacidad de los tejidos mesodérmicos para inducir neuroectodermo a partir de blastodermo no inyectado (ingenuo). Este protocolo proporciona instrucciones para crear explantes de blastodermo de pez cebra y demuestra su utilidad para definir el papel de la señalización ganglionar en la inducción y morfogénesis tisular.
Protocol
1 Preparar los reactivos y suministros
- Preparación de reactivos
- Preparar 500 ml de 3 veces la solución de Danieau (Solución 1, Tabla 1).
- Preparar 1 L de agua de huevo (Solución 2, Tabla 1).
- Prepare una solución al 1,2% de agarosa en agua de huevo. Derretir la agarosa completamente en el microondas y luego enfriar a 55 ° C en un baño de agua.
- Preparar 4 ml de medios de explante (Solución 3, Tabla 1,modificado ligeramente a partir de19,21)por condición experimental.
NOTA: Recuerde tener en cuenta al menos un pozo de explantes de embriones no inyectados (o inyectados de control) al calcular el volumen requerido.- Desinfecte el espacio de trabajo con etanol al 70%.
- Retire los medios de cultivo celular de 4 °C y rocíe/limpie con etanol al 70%.
- Hacer medios de explante y colocar en la incubadora de 28,5 °C para calentar mientras se inyectan los embriones.
NOTA: Siempre incluya embriones hermanos intactos y adaptados a la edad para fines de estadificación. Decorionar estos embriones y cultivarlos en placas recubiertas de agarosa en solución de Danieau 0,3x (Solución 4, Tabla 1).
- Retire las alícuotas de pronasa (1 ml a 20 mg/ml) de -20 °C y deje descongelar en hielo. Descongelar una alícuota de 1 ml por cada tres condiciones experimentales.
- Preparar placas de agarosa
- Haga las placas de inyección.
- Llene una placa de Petri de plástico de 100 mm x 15 mm hasta la mitad con agarosa fundida en agua de huevo.
- Coloque suavemente el molde de inyección sobre la agarosa fundida en un ángulo de 45 ° y baje gradualmente en la agarosa, asegurándose de que no queden atrapadas burbujas debajo. Deja que se enfríe por completo.
- Retire el molde. Use el plato inmediatamente o guárdelo para más tarde agregando 2 ml de agua de huevo, envolviendo el plato y almacenándolo a 4 ° C. Caliente la placa durante 15-30 min en la incubadora de 28,5 °C antes de la inyección.
- Hacer placas de corte explante.
- Agregue 3 ml de agarosa fundida al 1,2% en agua de huevo a una placa de Petri de 60 mm x 15 mm, asegurándose de que todo el fondo del pozo esté recubierto. Deja que se enfríe por completo.
- Cubra las placas de cultivo con agarosa.
- Para cada condición experimental, dispense 1 ml de agarosa fundida al 1,2% en agua de huevo en un pozo de una placa de 6 pozos, asegurándose de que todo el fondo del pozo esté recubierto. Deja que se enfríe por completo.
- Para hacer explantes quiméricos, cree un plato de corte explante con pequeños pozos agregando doce cuentas de vidrio de 1 mm a la agarosa fundida en una placa de Petri de 60 mm x 15 mm. Retire las cuentas con las pórceps una vez que la agarosa se enfríe por completo.
- Haga las placas de inyección.
2 Inyectar embriones con ARN
- Con guantes, retire una alícuota de ARNm sintético ndr2 del almacenamiento a -80 °C e in situéquela inmediatamente sobre hielo.
- Prepare la aguja de inyección.
- Llene una aguja capilar de vidrio tirado con ARN. Coloque la aguja llena en un micro-manipulador y rompa la punta de la aguja con pinzas.
- Calibre el volumen de inyección utilizando un micrómetro de etapa con una gota de aceite mineral, ajustando el tiempo de inyección y la presión en el inyector neumático para lograr un bolo del tamaño deseado. Un bolo con un diámetro de 120 μm tiene un volumen de 1 nL.
NOTA: El volumen deseado del bolo dependerá de la concentración del ARN y de la dosis deseada por embrión. Por ejemplo, si el ARN se ali cotiza a 10 ng/μL, inyectar 1 nL para lograr una cantidad final de 10 pg.- Mantenga la punta de la aguja de ARN sumergida en el aceite hasta que esté lista para inyectar.
- Cargue los embriones e inyecte.
- Tire de los divisores en los tanques de reproducción, permita que los peces desoven durante 10-15 minutos y recolecte los embriones con un colador de té.
- Cargue los embriones en la placa de inyección con una pipeta Pasteur y una bomba de pipeta, y luego use un dedo enguantado para presionar los huevos en los comederos suavemente.
- Inyecte 10 pg ndr2 RNA en la yema de embriones unicelulares hasta que se alcance el número deseado de embriones o hasta que los embriones comiencen a dividirse.
NOTA: No se inyecte después de la etapa unicelular para garantizar una distribución uniforme del ARN en todo el embrión. - Lave los embriones de la placa de inyección en una placa de Petri etiquetada de 100 mm x 15 mm con un chorro suave de agua de huevo de una botella de compresión.
NOTA: Siempre mantenga un grupo de hermanos de la misma edad y no expulsados como controles. - Coloque los embriones en la incubadora de 28,5 °C hasta que alcancen la etapa de 128 células. Retire los huevos no fertilizados y los embriones muertos del plato.
3 Dechorionar los embriones
- Una vez que los embriones hayan alcanzado la etapa de 128 células, colóquelos en placas de Petri de vidrio etiquetadas y decante la mayor cantidad de agua de huevo posible de ellos.
- Etiquete los platos cristalizantes de vidrio con cinta de laboratorio (correspondiente a los nombres de platos pequeños) y llene 2/3 del camino con agua de huevo. Coloque estos platos junto al microscopio de disección para una rápida accesibilidad.
- Añadir 1 ml de caldo de pronasa (20 mg/ml, descongelado en hielo) a 15 ml de 3 veces la solución de Danieau en un tubo cónico de 50 ml.
NOTA: Esta cantidad es suficiente para hasta tres condiciones experimentales. Aumente el volumen de pronasa y 3 veces la solución de Danieau para condiciones de explante adicionales.
PRECAUCIÓN: La pronasa es un irritante; por lo tanto, use guantes cuando manipule. - Añadir al menos 5 ml de solución de pronasa a cada placa de Petri de vidrio que contenga embriones.
- Agitar los platos de vidrio en un movimiento circular, monitoreando el progreso de la decoroción consistentemente bajo un microscopio de disección.
- Una vez que los coriones comiencen a arrugarse y 1-2 embriones estén fuera de sus coriones, sumerja cuidadosamente la placa de Petri de vidrio que contiene pronasa y los embriones en el plato cristalizador de vidrio correspondiente que contiene agua de huevo.
- Lavar los embriones descoronados.
- Lave los embriones tres veces con agua de huevo agregando suavemente y luego decantando el agua de huevo del plato.
- El tercer y último lavado es con la solución de Danieau 0.3x.
NOTA: Si los embriones todavía tienen coriones después del lavado, pipetee suavemente los embriones hasta que se retiren los coriones o déjelos reposar en el lavado (agua de huevo o 0.3x solución de Danieau) durante uno o dos minutos y agite suavemente con movimientos circulares.
- Cubra los embriones decororonados con una tapa de placa de Petri y devuélvalos a la incubadora (28,5 °C) hasta que alcancen la etapa de 256 células.
4 Explantes cortados
- Llene la placa de Petri recubierta de agarosa de 60 mm x 15 mm con 3 soluciones de Danieau.
- Una vez que los embriones estén en la etapa de 256 células, transfiéralos a la placa recubierta de agarosa que contiene 3 veces la solución de Danieau, alineándolos a lo largo del centro del plato.
- Cortar los explantes con fórceps (Figura 1).
- Use un par de fórceps, mantenidos cerrados, para estabilizar el embrión y use el otro para cortar a través del blastodermo a aproximadamente la mitad de su altura (desde el margen hasta el polo del animal) (Figura 1A).
- Para cortar, apriete suavemente las células del blastodermo con un par de bórceps. Luego, tome las fórceps estabilizadoras y colórtelas a lo largo de las otras fórceps para cortar aproximadamente la mitad del blastodermo(Figura 1B).
- Girar el embrión, colocando los fórceps en el corte existente, y luego cortar el blastodermo ortogonal restante al primer corte (Figura 1C).
- Mantenga los explantes en la solución de Danieau 3x durante al menos 5 minutos para sanar, luego transfiéralos al pozo de una placa de 6 pozos recubierta con agarosa y llena con 4 ml de medios de explante.
NOTA: Cortar explantes de hermanos no inyectados (o inyectados de control) como controles negativos. Si los explantes se realizan correctamente, estos explantes no extenderán ni expresarán marcadores de endodermo, mesodermo o neuroectodermo. - Coloque las placas de cultivo de explante en la incubadora de 28,5 °C hasta que se alcance el punto de tiempo/etapa deseado (determinado a partir de hermanos intactos).
NOTA: Si se tratan explantes con un compuesto, como un inhibidor de moléculas pequeñas, la concentración deseada se puede agregar directamente al medio de explante dentro de los pozos en los puntos de tiempo deseados. Recuerde incluir el volumen de agarosa al calcular las concentraciones. (Ejemplo: 1 ml de agarosa + 4 ml de medios de explante = 5 ml de volumen total por pozo).
5 Preparar explantes quiméricos
- En lugar de una placa recubierta de agarosa regular, corte los explantes quiméricos en un plato con agarosa moldeada en doce pozos pequeños y poco profundos utilizando perlas de vidrio de 1 mm (sección 1.2.4). Llene este plato con 3 veces la solución de Danieau.
NOTA: Los explantes quiméricos se generan a partir de células blastodérmicas de dos embriones de diferentes genotipos o afecciones. Asegúrese de que estas condiciones puedan distinguirse entre sí por la expresión de marcadores fluorescentes transgénicos o inyectados.- Prepárese agregando doce embriones de un genotipo / condición al lado izquierdo de la placa y doce embriones del otro genotipo / condición al lado derecho de la placa.
- Mueva un embrión de cada condición al centro de la placa, cerca de uno de los 12 pozos.
- Usando fórceps, corte un explante de cada embrión como se describe para los explantes de un solo embrión (paso 4.3).
- Presione rápidamente los bordes cortados de los dos explantes juntos dentro del pozo poco profundo usando forrceps para permitir que las dos mitades sanen juntas en un solo explante.
- Continúe con los once pozos restantes dentro de la placa. Una vez que los explantes estén curados, transfiéralos al pozo de una placa de 6 pozos recubierta con agarosa y llena con 4 ml de medios de explante. Repetir hasta que se logre el número deseado de explantes.
6 Cultivo y/o imagen de los explantes fijos
- Explantes de cultivo en la incubadora de 28,5 °C hasta que los embriones hermanos intactos alcancen la etapa deseada.
- Los explantes vivos se pueden montar para obtener imágenes continuas de lapso de tiempo, obtener imágenes periódicamente durante todo el período de cultivo o imágenes en vivo en el punto final experimental.
- Arregle los explantes si lo desea. Una vez que los explantes alcanzan el punto final deseado, observe la etapa de los hermanos embrionarios intactos y coloque los explantes en un vial de centelleo de vidrio con 1 ml de paraformaldehído al 4% en PBS. Fijar durante la noche en una coctelera a 4 °C.
PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico. Use guantes cuando manipule este producto químico y deséchelo a través de métodos aprobados por cada institución.- Después de la fijación, enjuague los explantes seis veces, 15 minutos cada uno con PBS + 0.1% Tween-20, y deshidrate gradualmente en metanol. Almacene los explantes a -20 °C para su posterior análisis mediante hibridación in situ de montaje completo, tinción inmunofluorescente, etc.
Representative Results
Los ligandos ganglionares impulsan la formación de la capa germinal y la C&E de los explantes de blastodermo del pez cebra
Los explantes de control cortados de embriones de tipo silvestre (WT) no inyectados o aquellos inyectados con 50 pg de ARNm que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) permanecieron redondeados durante todo el período de cultivo(Figura 2A-C)y no lograron expresar marcadores de mesodermo, endodermo o neuroectodermo(Figura 3C)20. Juntos, estos indican una ausencia de la morfogénesis y la formación de capas germinales que caracterizan la gastrulación de vertebrados. Sin embargo, los explantes cortados de embriones inyectados con 10 pg de ARNm ndr2 se alargaron mucho después de 8-9 h en cultivo (Figura 2D). Las imágenes de lapso de tiempo en vivo de estos explantes por microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) revelaron que la extensión comienza en o alrededor de las 8 h posteriores a la fertilización (hpf)(Figura 2F),el mismo tiempo que comienza la morfogénesis C&E en embriones intactos de pez cebra22. Los explantes cortados de MZoep-/- embriones, que carecen del co-receptor esencial tdgf1 Nodal23,no se extendieron en respuesta a la inyección de ndr2 (Figura 2E),demostrando que la actividad nodal es crítica para esta morfogénesis ex vivo. Además, la hibridación in situ de montaje completo mostró además que los explantes que expresan ndr2 expresanmarcadores de neuroectodermo(sox2)y varios subclases de mesodermo(tbxta, noto, tbx16)(Figura 2G),así como endodermo y el organizador embrionario20.
No se requiere señalización ganglionar para la inducción del neuroectodermo por mesodermo
La actividad de señalización ganglionar es esencial para la inducción del endodermo y la mayoría de los mesodermos, pero es prescindible para la especificación de neuroectodermo dentro de las gastrulas del pez cebra23,24. Mientras que los explantes de blastodermo de pez cebra no inyectados no se diferenciaron en neuroectodermo(Figura 3C18),los explantes de embriones inyectados con 10 pg ndr2 exhibieron una expresión robusta del marcador de neuroectodermo sox2 en franjas distintas a lo largo del eje largo del explante(Figura 2G),lo que indica que se requiere actividad ganglionar para la formación de neuroectodermos ex vivo. Desde hace tiempo se sabe que los tejidos mesodérmicos pueden inducir tejido neural25,26,27,28,29,incluso en explantes de blastodermo de pez cebra17. Sin embargo, no está claro si la formación de neuroectodermo en este sistema de explante requiere señalización ganglionar directamente o si los ligandos ganglionares exógenos inducen mesodermo que luego induce los tejidos neurales secundariamente.
Se generaron explantes quiméricos que contenían porciones prospectivas de mesodermo y neuroectodermo de dos embriones diferentes para probar si se requiere señalización ganglionar de forma autónoma para la especificación de neuroectodermo ex vivo. La porción del mesodermo de cada explante se cortó de un embrión WT que expresaba un reportero transgénico GFP específico del mesodermo, Tg[lhx1a:eGFP]30, inyectado con una dosis alta (100 pg) de ndr2 (Figura 3A). La supuesta porción de neuroectodermo de cada explante se cortó de un embrión WT de control o de un embrión MZ deficiente en señalización ganglionaroep-/- inyectado solo con ARNm que codifica el marcador nuclear fluorescente H2B-RFP(Figura 3A). Cada explante quimérico se generó combinando un blastodermo de cada una de estas dos condiciones, que se ensayaron para la expresión de marcadores específicos del tejido mediante hibridación in situ de montaje completo a 12 hpf.
La mayoría de los explantes de un solo embrión de embriones inyectados con 100 pg ndr2 expresaron poco o ningún sox2,y expresaron marcadores de mesodermo, incluyendo tbxta y el reportero lhx1a:gfp- a lo largo del explante(Figura 3B,G). Wt blastoderm no inyectado (del tipo que comprende la porción prospectiva de neuroectodermo de explantes quiméricos) no expresó marcadores de mesodermo ni sox2 cuando se cultvó como un solo explante, lo que indica una falta de especificación de neuroectodermo y mesodermo(Figura 3C,H). Los explantes de un solo embrión de MZoep-/- embriones carecían de manera similar de expresión de marcadores de neuroectodermo y mesodermo, incluso cuando se inyectaban con ndr2 (Figura 3D). Sin embargo, cuando los blastodermos WT no inyectados se combinaron con mesodermo inducido por altas dosis de ligandos ganglionares, estos explantes quiméricos expresaron tanto los marcadores de mesodermo como sox2 de manera robusta(Figura 3E,I). Estos resultados demuestran que, como se observó anteriormente17,26,27,29,el mesodermo puede inducir el destino neural en células que de otro modo se convertirían en ectodermo no neural. Para probar si se requiere señalización ganglionar directamente dentro de la porción prospectiva de neuroectodermo de estos explantes para su inducción neural, se crearon explantes quiméricos a partir de blastodermos WT inyectados con 100 pg ndr2 y blastodermos de MZoep-/- embriones(Figura 3J). A pesar de su incapacidad para recibir señales ganglionares de la porción mesodérmica vecina, estos explantes expresaron sox2 en un grado similar al de las quimeras de control WT(Figura 3F). Este resultado demuestra que, de acuerdo con embriones intactos en los que se especifican tejidos neurales en ausencia de actividad ganglionar, no se requiere señalización ganglionar de forma autónoma para la inducción del neuroectodermo ex vivo.
Figura 1: Procedimiento para laexplantación de blastodermo del pez cebra (paso 4.3). (A) Mantenga los fórceps en la mano no dominante (naranja) cerrados contra la yema para estabilizar el embrión mientras pellizca el blastodermo a aproximadamente 1/2 de su altura usando las pinzas en la mano dominante (azul). (B) Pase las pinzas naranjas a lo largo del borde de las pinzas azules que agarran el embrión para cortar a través del blastodermo de modo que el primer corte alcance aproximadamente la mitad del blastodermo. (C) Gire el embrión 90°, luego coloque las pinzas azules dentro (pero ortogonales a) el corte original y pellizque para cortar el blastodermo restante. (D) Permita que las células de blastodermo explantadas sanen en 3x solución de Danieau durante aproximadamente 5 minutos antes de transferirse a los medios de explante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 (modificada a partir de20):Losligandos ganglionares promueven la morfogénesis C&E y la formación de capas germinales en explantes de blastodermo de pez cebra. (A) Diagrama de inyección y explantación de embriones de pez cebra. (B-E) Imágenes representativas de campo brillante de explantes de blastodermo vivos de las condiciones/genotipos indicados en la etapa de somita equivalente a 2-4. N = número de explantes de dos a cuatro ensayos independientes. (F) Serie DIC de lapso de tiempo de un explante representativo de un embrión WT inyectado con ARN 10 pg ndr2. (G) Imágenes representativas de la hibridación in situ de montaje completo para las transcripciones indicadas en explantes de embriones WT inyectados con ARN ndr2 de 10 pg. Las barras de escala son de 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 (Modificado a partir del31):Los explantes quiméricos revelan que la especificación del neuroectodermo no requiere señalización ganglionar autónoma del tejido ex vivo. (A) Diagrama del procedimiento para generar explantes quiméricos de pez cebra. (B-F) Hibridación in situ de montaje completo para el marcador de mesodermo tbxta (arriba) y el marcador de neuroectodermo sox2 (abajo) en explantes de embriones WT inyectados con ARN de 100 pg ndr2 (B),controles WT no inyectados(C),MZoep-/- inyectados con 10 pg ndr2 (D), y explantes quiméricos que contienen porciones de neuroectodermo de WT (E) o MZoep-/- (F ) embriones en el equivalente de la etapa de 2-4 somitas. Las fracciones indican el número de explantes con el fenotipo mostrado sobre el número total de explantes examinados. (G-J) Imágenes representativas de explantes vivos de Tg[lhx1a:gfp] de un solo embrión (G-H) o combinados con blastodermos que expresan H2B (I-J, magenta) de las condiciones indicadas en el equivalente de la etapa de somita 2-4. N = número de explantes de tres ensayos independientes. Las barras de escala son de 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución 1 | Solución 2 | Solución 3 | Solución 4 | |
| Solución | 3x Danieau's | Agua de huevo | Medios de explante | 0.3x Danieau's |
| Ingredientes | NaCl de 174 mM | 60 μg/ml de sales marinas | DMEM/F12 + 2,5 mM L-Glutamina y 15 mM HEPES | NaCl de 17,4 mM |
| 2,1 mM KCl | 1 L de agua destilada | 3% de volumen total de suero de ternero recién nacido o suero bovino fetal | 0,21 mM KCl | |
| 1.2 mM MgSO4. 7H2O | 1:200 Penicilina (50 unidades/ml)-Estreptomicina (50 μg/ml) | 0.12 mM MgSO4•7H2O | ||
| 1.8 mM Ca(NO3)2 •4H2O | 0.18 mM Ca(NO3)2 •4H2O | |||
| 15 mM HEPES | Ejemplo: | 1,5 mM HEPES | ||
| Agua destilada | 4 mL/condición x 9 Condiciones = 36 mL | Agua destilada | ||
| 1,08 ml de suero para terneros recién nacidos (NCS, aliciado en -20 °C (3%) | ||||
| 0.18 mL 200x Pen-Strep (PS, aliciado en -20 °C) (1:200) | ||||
| 35 ml DMEM/F12 |
Tabla 1.
Discussion
Este artículo ha descrito cómo generar explantes de blastodermo de pez cebra y ha discutido dos aplicaciones prácticas de estos explantes para abordar el papel de la señalización del morfógeno nodal en la gastrulación. Este método de corte y cultivo de explantes proporciona una pizarra en blanco de células ingenuas que pueden manipularse mediante inyecciones de ARN y tratamiento con compuestos de moléculas pequeñas para investigar una vía molecular de interés.
Pasos críticos
Hay cuatro pasos en este protocolo que son particularmente críticos para su éxito. La primera es inyectar a los embriones la cantidad adecuada de Nodal. Este protocolo recomienda 10 pg de ARN ndr2, y aunque un rango de dosis promueve la extensión, demasiado o muy poco Nodal impedirá la extensión óptima del explante20. El segundo paso es descororionar los embriones. Si los embriones permanecen en pronasa durante demasiado tiempo, las yemas estallarán y los embriones no serán viables de cortar. Si no están en la pronasa el tiempo suficiente, los coriones no se aflojarán con el lavado y, en cambio, requerirán una decoorción manual que consume mucho tiempo. El tercer paso crítico es cortar los explantes. Se recomienda cortar en 3x solución de Danieau, ya que el menor contenido de sal de la solución de Danieau 0.3x o agua de huevo no promueve la curación y la supervivencia de los explantes.
Además, los explantes deben cortarse a aproximadamente la mitad de la altura del blastodermo para garantizar la ingenuidad de las células. Si se cortan demasiado cerca de la yema, contendrán señales del margen (incluido el nodal endógeno) que promueven la especificación del tejido y la morfogénesis. El cuarto y último paso crítico es en la curación de los explantes quiméricos. Dos explantes no se fusionarán para formar quimeras a menos que sus bordes cortados se presionen suavemente inmediatamente después de cortar.
Modificaciones y solución de problemas
Los pasos críticos descritos anteriormente brindan oportunidades para la solución de problemas. A continuación se presentan algunos problemas comunes y soluciones propuestas.
Si los explantes no se extienden en presencia de señalización nodal, hay algunas soluciones posibles. (A) Inyectar embriones en la etapa unicelular para asegurar que el ARN se disperse uniformemente en todo el embrión. (B) Evite inyectar demasiado ARN ganglionar asegurándose de que el volumen inyectado sea correcto utilizando un micrómetro para medir el bolo de inyección. (C) Evite inyectar muy poco ARN ganglionar midiendo su concentración para asegurarse de que no se ha degradado. (D) Mantenga algunos hermanos intactos de la edad para inferir la etapa equivalente de los explantes. Los explantes logran la máxima extensión cuando los hermanos intactos alcanzan la etapa de 2-5 somitas. Si los explantes se recogen demasiado pronto, entonces no se alcanzará la extensión óptima.
Si las yemas están estallando después de la decorolinación, y los embriones no son viables para cortar, retire los embriones de la solución de pronasa una vez que los coriones comiencen a arrugarse y 1-2 embriones arrojen su corion. Luego, enjuague inmediatamente en agua de huevo.
Si los explantes aparecen burbujeantes alrededor de los bordes, hay algunas soluciones. (A) Cortar explantes sólo dentro de un marco de tiempo específico de desarrollo. Aunque los explantes cortados en cualquier etapa de 128 a 1000 etapas de células pueden sobrevivir y extenderse en cultivo, los cortados en etapas de 256 a 512 células tienden a ser los más robustos. (B) Asegúrese de que los explantes se corten en la solución 3x de Danieau para garantizar una curación adecuada. (C) Cortar los explantes limpiamente pero suavemente. Evite estirar o separar las células durante el proceso de corte.
Si los explantes de control no inyectados se están extendiendo, es probable que los explantes corten demasiado cerca de la yema. Para que los explantes sean ingenuos, asegúrese de que los cortes se realicen a medio camino entre la yema y la parte superior del blastodermo.
Si los explantes quiméricos no se fusionan, es probable que se deba a que la tendencia de los explantes en la solución de Danieau 3x una vez cortada es redondear y sanar sobre el borde cortado. Para asegurarse de que los dos blastodermos se curen entre sí en lugar de a sí mismos, presiónelos juntos inmediatamente después del corte. Use bórceps para aplicar una presión suave a los blastodermos recién unidos dentro del pozo de agarosa para alentarlos a sanar juntos.
Limitaciones
Si bien estos explantes son una herramienta valiosa para estudiar el papel de un morfógeno dado (u otra molécula de interés) en el aislamiento relativo, las observaciones realizadas en cualquier modelo ex vivo deben interpretarse con cuidado. Los explantes exhiben morfogénesis C&E que es muy similar a la observada in vivo20,pero no recapitulan todos los aspectos de la gastrulación, por ejemplo, los movimientos epibósicos. También carecen de muchos otros factores reguladores y moléculas de señalización que están presentes dentro de un embrión intacto. Si bien esta es una ventaja experimental significativa de los explantes, también puede llevar a conclusiones que no se sostienen in vivo. Por ejemplo, dado que los explantes que no reciben ligandos ganglionares exógenos no expresan marcadores de neuroectodermo, se podría concluir a partir de explantes solos que la señalización ganglionar es necesaria para la especificación del neuroectodermo. Sin embargo, el neuroectodermo se forma dentro de embriones intactos que carecen de toda la señalización ganglionar23,24, lo que demuestra el papel vital de otras moléculas de señalización en la especificación neuronal32. Los explantes pueden decirnos de qué es capaz un morfógeno en un entorno aislado. Aún así, todos estos hallazgos deben confirmarse en / compararse con embriones intactos para que los resultados se interpreten a fondo. En otras palabras, los explantes no pueden tomar el lugar de un embrión en desarrollo. En cambio, son una herramienta complementaria para identificar el papel y la relación de un morfógeno con el entorno. Con estas limitaciones en mente, los explantes de blastodermo de pez cebra son una herramienta valiosa para muchas preguntas de investigación.
Importancia con respecto a los métodos existentes
Con un renovado interés en la embriología sintética, se emplean regularmente varios enfoques ex vivo e in vitro para modelar aspectos del desarrollo embrionario. Por ejemplo, los gastruloides de 2 y 3 dimensiones compuestos de células madre pluripotentes embrionarias / inducidas de ratón o humanos pueden ser persuadidos, mediante la aplicación de moléculas de señalización exógenas, para recapitular algunos de los eventos de patrones y / o morfogenéticos de la gastrulación, segmentación y neurulación33,34,35,36,37 . Aunque poderosos, estos métodos requieren métodos de cultivo laboriosos y prolongados tanto para mantener continuamente las células madre pluripotentes como para cultivar gastruloides, que tardan muchos días en alcanzar las etapas de gastrulación. Por el contrario, los explantes de pez cebra no requieren mantenimiento de cultivos con células madre, ya que los embriones simplemente se recolectan según sea necesario. Son relativamente simples de generar y alcanzan etapas de gastrulación en cuestión de horas, lo mismo que los embriones de pez cebra. Esto resalta otra ventaja de los explantes de pez cebra, su reloj de desarrollo intacto. Debido a que la edad de desarrollo de las células madre pluripotentes embrionarias e inducidas puede ser variable y muy debatida, los explantes embrionarios son quizás más adecuados para investigar la regulación temporal del desarrollo. Finalmente, mientras que los explantes de pez cebra pescoide (que contienen el margen embrionario) se extienden de manera similar en el cultivo12,13,lo hacen en respuesta a los centros de señalización endógenos. En cambio, los explantes descritos aquí permiten a los investigadores investigar moléculas de interés con relativamente poca interferencia de tales señales embrionarias.
Posibles aplicaciones futuras
Aquí, se utilizaron explantes para demostrar que la señalización nodal es necesaria y suficiente para la morfogénesis C&E. Aún así, se anticipa que pueden y se utilizarán para discernir el papel de muchas moléculas diferentes en muchos otros procesos de desarrollo, por ejemplo, la regulación de la expresión génica, los gradientes de señalización y los programas morfogenéticos adicionales. Además, debido a que estos explantes son viables hasta al menos 24 hpf19,se puede esperar que su utilidad se extienda más allá de la gastrulación en procesos como la segmentación y la organogénesis, cualquier proceso en el que los investigadores deseen una pizarra en blanco de desarrollo.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por NICHD R00HD091386 a MLKW y por NIEHS T32ES027801 a AAE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
| 6-well plates | Fisher | FB012927 | |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
| Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
| DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
| Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
| Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
| Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
| HEPES | VWR | JT4018-1 | |
| Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| KCl | VWR | BDH9258-500G | |
| Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
| MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
| Mineral oil | VWR | MK635704 | |
| NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
| Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
| Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
| Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
| Tween-20 | VWR | 200002-836 |
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