Summary
Zebravis blastoderm explantaten worden gegenereerd door embryonale cellen te isoleren van endogene signaleringscentra in het vroege embryo, waardoor relatief naïeve celclusters worden geproduceerd die gemakkelijk ex vivokunnen worden gemanipuleerd en gekweekt. Dit artikel geeft instructies voor het maken van dergelijke explants en toont hun nut aan door rollen te onderzoeken voor nodale signalering tijdens gastrulatie.
Abstract
Vanwege hun optische helderheid en snelle ontwikkeling zijn zebravisembryo's een uitstekend systeem voor het onderzoeken van celgedrag en ontwikkelingsprocessen. Vanwege de complexiteit en redundantie van embryonale signalen kan het echter een uitdaging zijn om de volledige rol van een enkel signaal tijdens vroege embryogenese te onderscheiden. Door het dierlijke gebied van de zebravis blastoderm te explanteren, worden relatief naïeve clusters van embryonale cellen gegenereerd die gemakkelijk ex vivokunnen worden gekweekt en gemanipuleerd . Door een interessant gen te introduceren door RNA-injectie vóór explantatie, kan men het effect van dit molecuul op genexpressie, celgedrag en andere ontwikkelingsprocessen in relatieve isolatie beoordelen. Bovendien kunnen cellen van embryo's van verschillende genotypen of aandoeningen worden gecombineerd in een enkele chimere explant om cel/ weefselinteracties en weefselspecifieke genfuncties te onderzoeken. Dit artikel geeft instructies voor het genereren van zebravis blastoderm explantaten en toont aan dat een enkel signaalmolecuul - een nodaal ligand - voldoende is om kiemlaagvorming en uitbreiding van morfogenese in anders naïeve embryonale weefsels te induceren. Vanwege hun vermogen om embryonaal celgedrag, morfogene gradiënten en genexpressiepatronen in een vereenvoudigd ex vivo-systeem samen te vatten, wordt verwacht dat deze explantaten van groot nut zullen zijn voor veel zebravisonderzoekers.
Introduction
Een eeuwigdijdend doel van het ontwikkelingsbiologieveld is om de complexiteit van het ontwikkelen van embryo's te ontrafelen om de oorsprong van de vorm en functie van dieren te begrijpen. Zelfs vroege embryo's bevatten een complexe medley van signaalmoleculen, cel- en weefselinteracties en mechanische krachten, allemaal onderworpen aan strikte ruimtelijke en temporele regulatie. Om deze reden is het vaak een uitdaging om de precieze rol van een bepaald signaal in een ontwikkelingsproces van belang aan te wijzen. Door embryonale weefsels uit hun endogene omgeving te verwijderen, creëert embryo-explantatie een vereenvoudigd platform om de ontwikkelingsrollen van individuele weefsels en moleculen in relatieve isolatie te onderscheiden. Explantatietechnieken zijn misschien het best bekend in Xenopus laevis, waar ze zijn gebruikt om weefselinductie, celsignalering, celadhesie en morfogenese te bestuderen, naast andere processen1,2,3,4. Zogenaamde animal cap explants, waarbij het dierlijke gebied van blastula stadium Xenopus embryo's wordt geïsoleerd vóór inductieve interacties5,6,7, zijn een wijdverspreide en krachtige explantische techniek. Ongemanipuleerde dierendoppen worden vetgemest om ectoderm7,8te worden. Toch zijn ze bevoegd om te reageren op verschillende inductieve factoren, waardoor ze weefsels van alle drie de kiemlagen kunnen vormen en weefselgeschikte morfogenetische bewegingen kunnen ondergaan9,10,11. Beperkte genetische hulpmiddelen en suboptimale geschiktheid voor live beeldvorming verhinderen echter het gebruik van Xenopus-diercapexplantaten voor veel ontwikkelingsbiologen. Door blastodermcellen van zebravisembryo's te explanteren, kunnen onderzoekers het nut van de dierlijke doptest combineren met de optische helderheid, overvloed aan genetische hulpmiddelen en andere experimentele voordelen van het zebravismodelsysteem.
Tot op heden hebben onderzoekers gebruik gemaakt van twee smaken zebravis explants: zogenaamde pescoids en de blastoderm explants. In het pescoidmodel wordt het volledige blastoderm, inclusief de marginale zone, geïsoleerd van de dooier en ex vivo laten ontwikkelen zonder de extra-mbryonische dooiersyncytiele laag (YSL)12,13. Op deze manier vertonen pescoiden een opmerkelijke gelijkenis met de Fundulus-explantaten die tientallen jaren geleden zijn gegenereerd door Jane Oppenheimer en J.P. Trinkaus14,15. Deze explantaten vatten vele aspecten van embryonale patronen en morfogenese samen12,13. Omdat deze isolaten echter endogene signaleringscentra (de embryonale marge) bevatten, zijn ze niet vereenvoudigd met betrekking tot hun moleculaire milieu. Als alternatief kunnen onderzoekers relatief naïeve zebravis blastoderm explantaten genereren door de marginale zone16,17,18,19,20,21uit te sluiten. Ongemanipuleerde zebravis blastoderm explants drukken hoge niveaus van botmorfogenetisch eiwit (BMP) morfogenenuit 19 en geven aanleiding tot niet-neuraal ectoderm en omhullende laag (EVL) wanneer ze ex vivoworden gekweekt18. Ze vatten echter veel aspecten van axiale patronen en morfogenese samen in reactie op exogene signaalgradiënten19,20,21,vergelijkbaar met Xenopus-dierendoppen. Om deze reden zijn blastoderm-explantaten een voordelig model om de rol van een bepaald morfogeen (of morfogenen) in kiemlaagspecificatie, morfogenetische celbewegingen en signaalgradiënten binnen een vereenvoudigde signaleringsomgeving te bestuderen. Bovendien kunnen blastodermen van embryo's van verschillende genotypen of aandoeningen worden gecombineerd in een enkele chimere explant19,21 om cel / weefselautonomie en inductieve interacties te onderzoeken.
Zebravis blastoderm explantaten kunnen worden gebruikt om de rol van embryonale signalen (bijvoorbeeld Nodal) in morfogenese en weefselspecificatie tijdens gastrulatie te onderzoeken. Door het injecteren van synthetisch ndr2-RNA (coderend voor een nodaal ligand) in het eencellige stadium, wordt nodale signalering geactiveerd in het blastoderm van het embryo. Explantaten van deze embryo's genereren nodale signaalgradiënten, vormen alle drie de kiemlagen en ondergaan convergentie- en extensie (C & E) gastrulatiebewegingen zoals te zien bij intacte embryo's20. Bovendien worden chimere explantaten gebruikt om het vermogen van mesodermweefsels te illustreren om neuro-ectoderm te induceren uit niet-geïnjecteerd (naïef) blastoderm. Dit protocol geeft instructies voor het maken van zebravis blastoderm explants en toont hun nut bij het definiëren van de rol van nodale signalering in weefselinductie en morfogenese.
Protocol
1 Bereid de reagentia en benodigdheden voor
- Reagens voorbereiding
- Bereid 500 ml 3x Danieau's oplossing (oplossing 1, tabel 1).
- Bereid 1 L eiwater (oplossing 2, tabel 1).
- Bereid een 1,2% oplossing van agarose in eiwater. Smelt de agarose volledig in de magnetron en laat vervolgens afkoelen tot 55 °C in een waterbad.
- Bereid 4 ml explantmedia (oplossing 3, tabel 1,licht gewijzigd van19,21) per experimentele toestand.
OPMERKING: Vergeet niet om rekening te houden met ten minste één put explantaten van niet-geïnjecteerde (of controle geïnjecteerde) embryo's bij het berekenen van het vereiste volume.- Ontsmet de werkruimte met 70% ethanol.
- Verwijder celkweekmedia van 4 °C en spuit/doek met 70% ethanol.
- Maak explantmedia en plaats ze in de incubator van 28,5 °C om op te warmen terwijl de embryo's worden geïnjecteerd.
OPMERKING: Voeg altijd leeftijdsgematchte, intacte embryo's van broers en zussen toe voor stadiëringsdoeleinden. Dechorioneer deze embryo's en kweek ze op agarose-gecoate platen in 0,3x Danieau's oplossing (oplossing 4, tabel 1).
- Verwijder pronase aliquots (1 ml bij 20 mg/ml) van -20 °C en laat ontdooien op ijs. Ontdooi één aliquot van 1 ml voor elke drie experimentele omstandigheden.
- Bereid agarose borden
- Maak de injectieplaten.
- Vul een plastic petrischaaltje van 100 mm x 15 mm halverwege met gesmolten agarose in eiwater.
- Plaats de spuitgietmatrijs voorzichtig bovenop de gesmolten agarose in een hoek van 45° en laat deze geleidelijk in de agarose zakken, zodat er geen bubbels onder vast komen te zitten. Laat het helemaal afkoelen.
- Verwijder de vorm. Gebruik de plaat onmiddellijk of bewaar voor later door 2 ml eiwater toe te voegen, de plaat te omwikkelen en bij 4 °C te bewaren. Verwarm de plaat gedurende 15-30 minuten in de incubator van 28,5 °C vóór de injectie.
- Maak explant snijplaten.
- Voeg 3 ml gesmolten 1,2% agarose in eiwater toe aan een petrischaaltje van 60 mm x 15 mm en zorg ervoor dat de hele bodem van de put is bedekt. Laat het helemaal afkoelen.
- Bedek cultuurplaten met agarose.
- Geef voor elke experimentele toestand 1 ml gesmolten 1,2% agarose in eiwater af in één put van een plaat met 6 putten, zodat de hele bodem van de put is bedekt. Laat het helemaal afkoelen.
- Voor het maken van chimere explants, maak een explant snijschaal met kleine putjes door twaalf 1 mm glasparels toe te voegen aan gesmolten agarose in een petrischaaltje van 60 mm x 15 mm. Verwijder de kralen met een tang zodra de agarose volledig is afgekoeld.
- Maak de injectieplaten.
2 Injecteer embryo's met RNA
- Verwijder met handschoenen aan een hoeveelheid synthetisch ndr2 mRNA uit de opslag bij -80 °C en plaats deze onmiddellijk op ijs.
- Bereid de injectienaald voor.
- Vul een getrokken glazen capillaire naald met RNA. Plaats de gevulde naald in een micromanipulator en breek de punt van de naald met een tang.
- Kalibreer het injectievolume met behulp van een trapmicrometer met een druppel minerale olie, waarbij de injectietijd en druk op de pneumatische injector worden aangepast om een bolus van de gewenste grootte te bereiken. Een bolus met een diameter van 120 μm heeft een volume van 1 nL.
OPMERKING: Het gewenste volume van de bolus is afhankelijk van de concentratie van het RNA en de gewenste dosis per embryo. Als RNA bijvoorbeeld aliquoteert bij 10 ng / μL, injecteer dan 1 nL om een uiteindelijke hoeveelheid van 10 pg te bereiken.- Houd de punt van de RNA-naald ondergedompeld in de olie totdat deze klaar is om te injecteren.
- Laad de embryo's en injecteer.
- Trek de verdelers in kweektanks, laat vissen 10-15 minuten spawnen en verzamel de embryo's met behulp van een theezeef.
- Laad de embryo's in de injectieplaat met behulp van een Pasteur pipet en pipetpomp en gebruik vervolgens een gehandschoende vinger om de eieren voorzichtig in de troggen te drukken.
- Injecteer 10 pg ndr2 RNA in de dooier van eencellige embryo's totdat het gewenste aantal embryo's is bereikt of totdat embryo's zich beginnen te delen.
OPMERKING: Injecteer niet na het eencellige stadium om een gelijkmatige verdeling van het RNA door het embryo te garanderen. - Spoel de embryo's uit de injectieplaat in een gelabelde petrischaal van 100 mm x 15 mm met een zachte stroom eiwater uit een knijpfles.
OPMERKING: Houd altijd een groep leeftijdsgematchte, niet-geïnjecteerde broers en zussen als controle. - Plaats de embryo's in de couveuse van 28,5 °C totdat ze het stadium met 128 cellen bereiken. Verwijder onbevruchte eieren en dode embryo's uit het gerecht.
3 Dechorioneer de embryo's
- Zodra de embryo's het stadium van 128 cellen hebben bereikt, plaatst u ze in gelabelde glazen petrischalen en decanteert u er zoveel mogelijk eiwater uit.
- Label glazen kristalliserende schotels met laboratoriumtape (overeenkomend met kleine schotelnamen) en vul 2/3 van de weg met eiwater. Plaats deze gerechten naast de ontleedmicroscoop voor snelle toegankelijkheid.
- Voeg 1 ml pronasebouillon (20 mg /ml, ontdooid op ijs) toe aan 15 ml 3x Danieau's oplossing in een conische buis van 50 ml.
OPMERKING: Deze hoeveelheid is voldoende voor maximaal drie experimentele omstandigheden. Verhoog het volume van pronase en 3x Danieau's oplossing voor extra explantomstandigheden.
LET OP: Pronase is irriterend; draag daarom handschoenen bij het hanteren. - Voeg ten minste 5 ml pronase-oplossing toe aan elke glazen petrischaal met embryo's.
- Roer de glazen schalen in een cirkelvormige beweging en controleer de voortgang van de verjaring consequent onder een ontleedmicroscoop.
- Zodra de chorions beginnen te rimpelen en 1-2 embryo's uit hun chorions zijn, dompelt u voorzichtig de glazen petrischaal met pronase en de embryo's in de overeenkomstige glazen kristalliserende schaal met eiwater.
- Was de ontchorioneerde embryo's.
- Was de embryo's drie keer met eiwater door voorzichtig eiwater uit de schaal toe te voegen en vervolgens te decanteren.
- De derde en laatste wasbeurt is met 0,3x Danieau's oplossing.
OPMERKING: Als de embryo's na het wassen nog steeds chorions hebben, pipetteer de embryo's dan voorzichtig totdat de chorions zijn verwijderd of laat ze een minuut of twee in de was (eiwater of 0,3x Danieau's oplossing) zitten en roer voorzichtig met cirkelvormige bewegingen.
- Dek de embryo's af met een petrischaaldeksel en breng ze terug naar de couveuse (28,5 °C) totdat ze het stadium met 256 cellen bereiken.
4 Snij explantaten
- Vul de met agarose beklede petrischaal van 60 mm x 15 mm met 3x Danieau's oplossing.
- Zodra de embryo's zich in het stadium van 256 cellen bevinden, breng je ze over in de met agarose bedekte plaat met 3x Danieau's oplossing en zet je ze langs het midden van de schaal.
- Knip de explants met een tang(figuur 1).
- Gebruik een tang, gesloten gehouden, om het embryo te stabiliseren en gebruik de andere om door het blastoderm te snijden op ongeveer de helft van de hoogte (van marge tot dierenpaal) (Figuur 1A).
- Om te snijden, knijp je voorzichtig in de blastodermcellen met één tang. Neem vervolgens de stabiliserende tang en laat ze langs de andere tang lopen om ongeveer halverwege het blastoderm te snijden (figuur 1B).
- Draai het embryo, plaats de tang in de bestaande snede en snijd vervolgens het resterende blastoderm orthogonaal door naar de eerstesnede (figuur 1C).
- Bewaar explantaten in 3x Danieau's oplossing gedurende ten minste 5 minuten om te genezen en breng ze vervolgens over naar de put van een 6-well plaat bedekt met agarose en gevuld met 4 ml explant media.
OPMERKING: Knip explantaten van niet-geïnjecteerde (of controle geïnjecteerde) broers en zussen als negatieve controles. Als explantaties correct worden uitgevoerd, zullen deze explants geen markers van endoderm, mesoderm of neuro-ectoderm uitbreiden of uitdrukken. - Plaats de explantcultuurplaten in de incubator van 28,5 °C totdat het gewenste tijdspunt/stadium (bepaald aan de hand van intacte broers en zussen) is bereikt.
OPMERKING: Bij behandeling van explantaten met een verbinding, zoals een kleine molecuulremmer, kan de gewenste concentratie direct worden toegevoegd aan de explantmedia in de putten op de gewenste tijdstippen. Vergeet niet om het volume van agarose op te nemen bij het berekenen van concentraties. (Voorbeeld: 1 ml agarose + 4 ml explantmedia = 5 ml totaal volume per put).
5 Bereid chimere explantaten
- In plaats van een gewone agarose gecoate plaat, snijd chimere explantaten in een schaal met agarose gegoten in twaalf kleine, ondiepe putten met behulp van 1 mm glasparels (sectie 1.2.4). Vul dit bord met 3x Danieau's oplossing.
OPMERKING: Chimere explantaten worden gegenereerd uit blastodermcellen van twee embryo's van verschillende genotypen of aandoeningen. Zorg ervoor dat deze aandoeningen van elkaar kunnen worden onderscheiden door de expressie van transgene of geïnjecteerde fluorescerende markers.- Bereid je voor door twaalf embryo's van één genotype/aandoening toe te voegen aan de linkerkant van de plaat en twaalf embryo's van het andere genotype/aandoening aan de rechterkant van de plaat.
- Verplaats een embryo van elke aandoening naar het midden van de plaat, in de buurt van een van de 12 putten.
- Snijd met behulp van een tang een explant uit elk embryo zoals beschreven voor afzonderlijke embryo-explantaten (stap 4.3).
- Druk snel de snijkanten van de twee explants samen in de ondiepe put met een tang om de twee helften samen te laten genezen tot een enkele explant.
- Ga verder met de resterende elf putten binnen het bord. Zodra explants zijn genezen, breng je ze over naar de put van een 6-well plaat bedekt met agarose en gevuld met 4 ml explant media. Herhaal dit totdat het gewenste aantal explants is bereikt.
6 Cultuur en/of imago de vaste explants
- Kweek explanteert in de incubator van 28,5 °C totdat intacte embryo's van broers en zussen het gewenste stadium bereiken.
- Live explants kunnen worden gemonteerd voor continue time-lapse beeldvorming, periodiek in beeld worden gebracht gedurende de kweekperiode of live worden afgebeeld op het experimentele eindpunt.
- Bevestig de explantaties indien gewenst. Zodra de explantaten het gewenste eindpunt bereiken, noteert u het stadium van intacte embryo-broers en zussen en plaatst u de explantaten in een glazen scintillatieflacon met 1 ml 4% paraformaldehyde in PBS. 's Nachts op een shaker op 4 °C.
LET OP: Paraformaldehyde is giftig. Draag handschoenen bij het hanteren van deze chemische stof en gooi het weg via methoden die door elke instelling zijn goedgekeurd.- Spoel na fixatie de explantatie zes keer, 15 minuten elk met PBS + 0,1% Tween-20, en drogeer geleidelijk uit tot methanol. Bewaar explantaten bij -20 °C voor latere analyse door de whole-mount in situ hybridisatie, immunofluorescente kleuring, enz.
Representative Results
Nodale liganden stimuleren kiemlaagvorming en C & E van zebravis blastoderm explants
Controle-explantaten gesneden uit niet-geïnjecteerde wild-type (WT) embryo's of die geïnjecteerd met 50 pg mRNA coderend groen fluorescerend eiwit (GFP) bleven afgerond gedurende de kweekperiode (Figuur 2A-C) en slaagden er niet in markers van mesoderm, endoderm of neuro-ectoderm uit te drukken ( Figuur3C)20. Samen wijzen deze op een afwezigheid van de morfogenese en kiemlaagvorming die de gastrulatie van gewervelde dieren kenmerken. Explantaten gesneden uit embryo's geïnjecteerd met 10 pg ndr2 mRNA werden echter zeer langwerpig na 8-9 h in cultuur(figuur 2D). Live time-lapse beeldvorming van deze explantaten door differentieel interfererend contrast (DIC) microscopie onthulde dat extensie-onsets op of rond 8 uur na de bevruchting (hpf) (Figuur 2F), dezelfde tijd dat C & E morfogenese begint in intacte zebravisembryo's22. Explantaten gesneden uit MZoep-/- embryo's, die de essentiële tdgf1 Nodal co-receptor23missen, slaagden er niet in om zich uit te breiden in reactie op ndr2-injectie (Figuur 2E), wat aantoont dat nodale activiteit cruciaal is voor deze ex vivo morfogenese. Bovendien toonde whole-mount in situ hybridisatie verder aan dat ndr2-expresserendeexplantaten markers van neuro-elektrodem (sox2) en verschillende mesoderm-subtypen (tbxta, noto, tbx16) (Figuur 2G) tot expressie brengen, evenals endoderm en de embryonale organisator20.
Nodale signalering is niet vereist voor neuro-ctoderm inductie door mesoderm
Nodale signaleringsactiviteit is essentieel voor de inductie van endoderm en de meeste mesoderm, maar is onmisbaar voor neuro-ectodermspecificatie binnen zebravisgastrulae23,24. Terwijl niet-geïnjecteerde blastodermexplantaten van zebravissen geen onderscheid maakten in neuro-ectoderm (figuur 3C18), explantaten van embryo's geïnjecteerd met 10 pg ndr2 vertoonden robuuste expressie van de neuro-ectoderm marker sox2 in verschillende strepen langs de lange as van de explant (Figuur 2G), wat aangeeft dat nodale activiteit vereist is voor neuro-ectodermvorming ex vivo. Het is al lang bekend dat mesodermale weefsels neuraal weefsel kunnen induceren25,26,27,28,29,inclusief in zebravis blastoderm explants17. Het is echter onduidelijk of neuro-ctodermvorming in dit explantatiesysteem direct nodale signalering vereist of dat exogene nodale liganden mesoderm induceren dat vervolgens secundair neurale weefsels induceert.
Chimere explantaten met prospectieve mesoderm- en neuro-ctoderm-delen van twee verschillende embryo's werden gegenereerd om te testen of nodale signalering weefsel-autonoom vereist is voor neuro-ectodermspecificatie ex vivo. Het mesodermgedeelte van elke explant werd gesneden uit een anderszins WT-embryo dat een mesoderm-specifieke transgene GFP-reporter tot expressie bracht, Tg[lhx1a:eGFP]30, geïnjecteerd met een hoge dosis (100 pg) ndr2 (Figuur 3A). Het vermeende neuro-ectodermgedeelte van elke explant werd gesneden uit een controle WT-embryo of nodale signaleringsdeficiënte MZoep- embryo dat alleen werd geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor de fluorescerende nucleaire marker H2B-RFP (figuur 3A). Elke chimere explant werd gegenereerd door één blastoderm van elk van deze twee aandoeningen te combineren, die werden getest op de expressie van weefselspecifieke markers door whole-mount in situ hybridisatie bij 12 hpf.
De meerderheid van de explantaten met één embryo van embryo's geïnjecteerd met 100 pg ndr2 bracht weinig of geen sox2tot expressie en bracht markers van mesoderm tot expressie, waaronder tbxta en de lhx1a:gfp reporter-throughout the explant (Figuur 3B, G). Niet-geïnjecteerd WT-blastoderm (van het type dat het prospectieve neuro-ectodermgedeelte van chimere explantaten omvat) drukte noch mesodermmarkers noch sox2 uit wanneer gekweekt als een enkele explant, wat wijst op een gebrek aan neuro-ectoderm en mesoderm-specificatie(Figuur 3C,H). Single-embryo explantaten van MZoep-/- embryo's misten op dezelfde manier expressie van zowel neuro-ectoderm- als mesodermmarkers, zelfs wanneer geïnjecteerd met ndr2 (figuur 3D). Wanneer echter niet-geïnjecteerde WT-blastodermen werden gecombineerd met mesoderm geïnduceerd door hoge doses nodale liganden, drukten deze chimere explantaten zowel mesodermmarkers als sox2 robuust uit (Figuur 3E,I). Deze resultaten tonen aan dat, zoals eerder waargenomen17,26,27,29, mesoderm neuraal lot kan induceren in cellen die anders niet-neuraal ectoderm zouden worden. Om te testen of nodale signalering direct in het prospectieve neuro-ectodermgedeelte van deze explantaten nodig is voor hun neurale inductie, werden chimere explantaten gemaakt van WT-blastodermen geïnjecteerd met 100 pg ndr2 en blastodermen van MZoep-/- embryo's(Figuur 3J). Ondanks hun onvermogen om nodale signalen van het naburige mesodermale gedeelte te ontvangen, drukten deze explantaten sox2 in dezelfde mate uit als WT-controle chimaera's(figuur 3F). Dit resultaat toont aan dat in overeenstemming met intacte embryo's waarin neurale weefsels worden gespecificeerd in afwezigheid van nodale activiteit, nodale signalering niet weefsel-autonoom vereist is voor neuro-ctoderm inductie ex vivo.
Figuur 1: Procedure voor de explantatie van blastoderm van zebravissen (stap 4.3). (A) Houd de tang in de niet-dominante hand (oranje) gesloten tegen de dooier om het embryo te stabiliseren terwijl u het blastoderm op ongeveer 1/2 van zijn hoogte knijpt met behulp van de tang in de dominante hand (blauw). (B) Laat de oranje tang langs de rand van de blauwe tang lopen en grijp het embryo vast om door het blastoderm te snijden, zodat de eerste snede ongeveer halverwege het blastoderm reikt. (C) Draai het embryo 90 °, plaats vervolgens de blauwe tang in (maar orthogonaal aan) de oorspronkelijke snede en knijp om het resterende blastoderm te snijden. DLaatgeëxplanteerde blastodermcellen gedurende ongeveer 5 minuten genezen in 3x Danieau's oplossing voordat ze worden overgebracht naar explantmedia. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 (gewijzigd van20): Nodale liganden bevorderen C&E morfogenese en kiemlaagvorming in zebravis blastoderm explantaten. (A) Diagram van injectie en explantatie van zebravisembryo's. (B-E) Representatieve helderveldbeelden van levende blastoderm explantaten van de aangegeven condities/genotypen in het equivalent van het 2-4 somietstadium. N = aantal explantaten van twee tot vier onafhankelijke proeven. (F) Time-lapse DIC-serie van een representatieve explant van een WT-embryo geïnjecteerd met 10 pg ndr2 RNA. (G) Representatieve beelden van de whole-mount in situ hybridisatie voor de transcripties aangegeven in explants van WT-embryo's geïnjecteerd met 10 pg ndr2 RNA. Schaalbalken zijn 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 (Gewijzigd van31): Chimere explantaten laten zien dat neuro-ectoderm specificatie geen weefsel-autonome Nodale signalering ex vivovereist . (A) Diagram van de procedure om chimere zebravis explants te genereren. (B-F) Whole-mount in situ hybridisatie voor de mesodermmarker tbxta (boven) en neuro-ectodermmarker sox2 (onder) in explantaten van WT-embryo's geïnjecteerd met 100 pg ndr2 RNA (B), niet-geïnjecteerde WT-controles (C), MZoep-/- geïnjecteerd met 10 pg ndr2 (D), en chimere explantaten die neuro-ecectoderm-porties van WT (E) of MZoepbevatten - / - (F ) embryo's in het equivalent van het 2-4 somietstadium. Fracties geven het aantal explantaten aan met het fenotype dat wordt weergegeven over het totale aantal onderzochte explantaten. (G-J) Representatieve beelden van levende Tg[lhx1a:gfp] explantaten uit een enkel embryo (G-H) of gecombineerd met H2B-expresserende blastodermen (I-J, magenta) van de omstandigheden die worden aangegeven in het equivalent van het 2-4 somietstadium. N = aantal explantaten uit drie onafhankelijke onderzoeken. Schaalbalken zijn 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing 1 | Oplossing 2 | Oplossing 3 | Oplossing 4 | |
| Oplossing | 3x Danieau's | Ei water | Explant Media | 0,3x Danieau's |
| Ingrediënten | 174m NaCl | 60 μg/ml zeezout | DMEM/F12 + 2,5 mM L-Glutamine en 15 mM HEPES | 17,4 mM NaCl |
| 2,1 mM KCl | 1 L gedestilleerd water | 3% totaal volume van newborn calf serum of foetaal runderserum | 0,21 mM KCl | |
| 1,2 mM MgSO4. 7u2o | 1:200 Penicilline (50 eenheden / ml) - Streptomycine (50 μg / ml) | 0,12 mM MgSO4•7H2O | ||
| 1,8 mM Ca(NO3)2 •4H2O | 0,18 mM Ca(NO3)2 •4H2O | |||
| 15 mm hepes | Voorbeeld: | 1,5 mM HEPES | ||
| Gedestilleerd water | 4 ml/conditie x 9 voorwaarden = 36 ml | Gedestilleerd water | ||
| 1,08 ml newborn calf serum (NCS, aliquoted in -20 °C (3%) | ||||
| 0,18 ml 200x Pen-Strep (PS, aliquoted in -20 °C) (1:200) | ||||
| 35 ml DMEM/F12 |
Tabel 1.
Discussion
Dit artikel heeft beschreven hoe zebravis blastoderm explants te genereren en besprak twee praktische toepassingen van deze explants bij het aanpakken van de rol van Nodal morfogene signalering in gastrulatie. Deze methode van het snijden en kweken van explantaten biedt een schone lei van naïeve cellen die kunnen worden gemanipuleerd met behulp van RNA-injecties en behandeling met kleine molecuulverbindingen om een moleculaire route van belang te onderzoeken.
Kritieke stappen
Er zijn vier stappen in dit protocol die bijzonder cruciaal zijn voor het succes ervan. De eerste is het injecteren van de embryo's met de juiste hoeveelheid Nodal. Dit protocol beveelt 10 pg ndr2-RNA aan, en hoewel een reeks doses uitbreiding bevordert, zal te veel of te weinig Nodal optimale explant-extensie voorkomen20. De tweede stap is het dechorioneren van de embryo's. Als de embryo's te lang in pronase blijven, zullen de dooiers barsten en zullen de embryo's niet levensvatbaar zijn om te snijden. Als ze niet lang genoeg in de pronase zitten, worden de chorionen niet losgemaakt door het wassen en vereisen ze in plaats daarvan tijdrovende handmatige dechorionatie. De derde kritische stap is het snijden van de explants. Snijden in 3x Danieau's oplossing wordt aanbevolen, omdat het lagere zoutgehalte van 0,3x Danieau's oplossing of eiwater de genezing en overleving van explantaten niet bevordert.
Bovendien moeten de explantaten op ongeveer de helft van de hoogte van het blastoderm worden gesneden om de naïviteit van de cellen te garanderen. Als ze te dicht bij de dooier worden gesneden, bevatten ze signalen uit de marge (inclusief endogene nodale) die weefselspecificatie en morfogenese bevorderen. De vierde en laatste kritische stap is de genezing van chimere explantaten. Twee explantaten zullen niet samensmelten om chimaera's te vormen, tenzij hun snijranden voorzichtig tegen elkaar worden gedrukt onmiddellijk nadat ze zijn gesneden.
Wijzigingen en probleemoplossing
De hierboven beschreven kritieke stappen bieden mogelijkheden voor het oplossen van problemen. Enkele veelvoorkomende problemen en voorgestelde oplossingen worden hieronder weergegeven.
Als explantaties zich niet uitbreiden in de aanwezigheid van Nodal-signalering, zijn er enkele mogelijke oplossingen. (A) Injecteer embryo's in het eencellige stadium om ervoor te zorgen dat RNA gelijkmatig over het hele embryo wordt verspreid. (B) Vermijd het injecteren van te veel nodaal RNA door ervoor te zorgen dat het geïnjecteerde volume correct is met behulp van een micrometer om de injectiebolus te meten. (C) Vermijd het injecteren van te weinig nodaal RNA door de concentratie ervan te meten om ervoor te zorgen dat het niet is afgebroken. (D) Houd enkele leeftijdsgematchte intacte broers en zussen om het equivalente stadium van de explantaten af te leiden. Explants bereiken maximale extensie wanneer intacte broers en zussen het 2-5 somite stadium bereiken. Als de explants te vroeg worden verzameld, wordt de optimale extensie niet bereikt.
Als de dooiers barsten na dechorionatie en de embryo's niet levensvatbaar zijn om te snijden, verwijder dan de embryo's uit de pronase-oplossing zodra de chorions beginnen te kreuken en 1-2 embryo's hun chorion afwerpen. Spoel vervolgens onmiddellijk af in eiwater.
Als de explantaties aan de randen bubbels lijken, zijn er enkele oplossingen. (A) Uitgesneden explantaten alleen binnen een bepaald tijdsbestek van ontwikkeling. Hoewel explantaten die in elk stadium van 128- tot 1000-celstadia worden gesneden, kunnen overleven en zich in cultuur kunnen uitbreiden, zijn die gesneden in 256- tot 512-celstadia meestal het meest robuust. (B) Zorg ervoor dat explantaten worden gesneden in 3x Danieau's oplossing om een goede genezing te garanderen. (C) Knip explantaten schoon maar voorzichtig. Vermijd het uitrekken of uit elkaar trekken van de cellen tijdens het snijproces.
Als de niet-geïnjecteerde controle-explants zich uitbreiden, zullen explants waarschijnlijk te dicht bij de dooier snijden. Om explantaties naïef te laten zijn, moet u ervoor zorgen dat de sneden halverwege tussen de dooier en de bovenkant van de blastoderm worden gemaakt.
Als de chimere explantaten niet fuseren, is dit waarschijnlijk omdat de neiging van explants in 3x Danieau's oplossing eenmaal gesneden is om af te ronden en te genezen over de snijrand. Om ervoor te zorgen dat de twee blastodermen aan elkaar genezen in plaats van zichzelf, drukt u ze onmiddellijk na het snijden tegen elkaar. Gebruik een tang om zachte druk uit te oefenen op de nieuw samengevoegde blastodermen in de agaroseput om ze aan te moedigen samen te genezen.
Beperkingen
Hoewel deze explantaten een waardevol hulpmiddel zijn om de rol van een bepaald morfogeen (of een ander molecuul van belang) in relatieve isolatie te bestuderen, moeten waarnemingen in elk ex vivo model met zorg worden geïnterpreteerd. Explantaten vertonen C & E-morfogenese die sterk lijkt op die waargenomen in vivo20, maar ze vatten niet alle aspecten van gastrulatie samen, bijvoorbeeld epiboly-bewegingen. Ze missen ook veel andere regulerende factoren en signaalmoleculen die aanwezig zijn in een intact embryo. Hoewel dit een aanzienlijk experimenteel voordeel is van explantaties, kan het ook leiden tot conclusies die niet in vivogelden . Omdat explantaten die geen exogene nodale liganden ontvangen bijvoorbeeld geen neuro-ctodermmarkers tot expressie brengen, zou men alleen uit explants kunnen concluderen dat nodale signalering vereist is voor neuro-ctodermspecificatie. Neuro-ctoderm wordt echter gevormd in intacte embryo's zonder alle nodale signalering23,24,wat de vitale rol van andere signaalmoleculen in neurale specificatie32aantoont. Explantaten kunnen ons vertellen waartoe een morfogeen in staat is in een geïsoleerde omgeving. Toch moeten al dergelijke bevindingen worden bevestigd in / vergeleken met intacte embryo's om de resultaten grondig te interpreteren. Met andere woorden, explantaten kunnen niet de plaats innemen van een zich ontwikkelend embryo. In plaats daarvan zijn ze een aanvullend hulpmiddel om de rol en relatie van een morfogeen met de omgeving te identificeren. Met deze beperkingen in het achterhoofd zijn zebravis blastoderm explants een waardevol hulpmiddel voor veel onderzoeksvragen.
Significantie ten opzichte van bestaande methoden
Met hernieuwde interesse in synthetische embryologie worden regelmatig verschillende ex vivo en in vitro benaderingen gebruikt om aspecten van embryonale ontwikkeling te modelleren. Bijvoorbeeld, 2- en 3-dimensionale gastruloïden bestaande uit muis of menselijke embryonale / geïnduceerde pluripotente stamcellen kunnen worden overgehaald, door de toepassing van exogene signaalmoleculen, om enkele van de patronen en / of morfogenetische gebeurtenissen van gastrulatie, segmentatie en neurulatie samen te vatten33,34,35,36,37 . Hoewel krachtig, vereisen deze methoden moeizame en langdurige kweekmethoden om zowel continu pluripotente stamcellen te behouden als gastruloïden te laten groeien, die vele dagen nodig hebben om gastrulatiestadia te bereiken. Zebravisexplantaten vereisen daarentegen geen onderhoud van stamcelculturen, omdat embryo's eenvoudig worden verzameld als dat nodig is. Ze zijn relatief eenvoudig te genereren en bereiken gastrulatiestadia binnen enkele uren, hetzelfde als zebravisembryo's. Dit benadrukt een ander voordeel van zebravisexplantaties, hun intacte ontwikkelingsklok. Omdat de ontwikkelingsleeftijd van embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen variabel en zeer bediscussieerd kan zijn, zijn embryonale explantaten misschien beter geschikt om temporele regulatie van ontwikkeling te onderzoeken. Ten slotte, terwijl pescoid zebravis explanteert (die de embryonale marge bevatten) zich op dezelfde manier uitbreidt in cultuur12,13, doen ze dit als reactie op endogene signaleringscentra. In plaats daarvan stellen de hier beschreven explantaten onderzoekers in staat om interessante moleculen te onderzoeken met relatief weinig interferentie van dergelijke embryonale signalen.
Mogelijke toekomstige toepassingen
Hier werden explantaten gebruikt om aan te tonen dat nodale signalering noodzakelijk en voldoende is voor C&E morfogenese. Toch wordt verwacht dat ze kunnen en zullen worden gebruikt om de rol van veel verschillende moleculen in vele andere ontwikkelingsprocessen te onderscheiden, bijvoorbeeld regulatie van genexpressie, signaalgradiënten en aanvullende morfogenetische programma's. Bovendien, omdat deze explantaten levensvatbaar zijn tot ten minste 24 hpf19, kan worden verwacht dat hun nut verder zal reiken dan gastrulatie naar processen zoals segmentatie en organogenese, elk proces waarin onderzoekers een ontwikkelingsloze lei wensen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NICHD R00HD091386 aan MLKW en door NIEHS T32ES027801 aan AAE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
| 6-well plates | Fisher | FB012927 | |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
| Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
| DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
| Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
| Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
| Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
| HEPES | VWR | JT4018-1 | |
| Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| KCl | VWR | BDH9258-500G | |
| Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
| MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
| Mineral oil | VWR | MK635704 | |
| NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
| Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
| Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
| Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
| Tween-20 | VWR | 200002-836 |
References
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71 (5), 731-739 (1992).
- Sudarwati, S., Nieuwkoop, P. D. Mesoderm formation in the anuranXenopus laevis (Daudin). Wilhelm Roux Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (3), 189-204 (1971).
- Gurdon, J. B., Fairman, S., Mohun, T. J., Brennan, S. Activation of muscle-specific actin genes in Xenopus development by an induction between animal and vegetal cells of a blastula. Cell. 41 (3), 913-922 (1985).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ariizumi, T., et al. Isolation and differentiation of Xenopus animal cap cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1 Unit 1D.5 (2009).
- Asashima, M., Grunz, H. Effects of inducers on inner and outer gastrula ectoderm layers of Xenopus laevis. Differentiation. 23 (3), 206-212 (1983).
- Jones, E. A., Woodland, H. R. Development of the ectoderm in Xenopus: tissue specification and the role of cell association and division. Cell. 44 (2), 345-355 (1986).
- Keller, R. E. Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis. I. Prospective areas and morphogenetic movements of the superficial layer. Developmental Biology. 42 (2), 222-241 (1975).
- Sokol, S., Wong, G. G., Melton, D. A. A mouse macrophage factor induces head structures and organizes a body axis in Xenopus. Science. 249 (4968), 561-564 (1990).
- Thomsen, G., et al. Activins are expressed early in Xenopus embryogenesis and can induce axial mesoderm and anterior structures. Cell. 63 (3), 485-493 (1990).
- Howard, J. E., Smith, J. C. Analysis of gastrulation: different types of gastrulation movement are induced by different mesoderm-inducing factors in Xenopus laevis. Mechanisms of Development. 43 (1), 37-48 (1993).
- Fulton, T., et al. Axis specification in Zebrafish is robust to cell mixing and reveals a regulation of pattern formation by morphogenesis. Current Biology. 30 (15), 3063-3064 (2020).
- Schauer, A., Pinheiro, D., Hauschild, R., Heisenberg, C. -P. Zebrafish embryonic explants undergo genetically encoded self-assembly. eLife. , 55190 (2020).
- Oppenheimer, J. M. The development of isolated blastoderms of Fundulus heteroclitus. The Journal of Experimental Zoology. 72 (2), 247-269 (1936).
- Trinkaus, J. P., Drake, J. W. Exogenous control of morphogenesis in isolated Fundulus blastoderms by nutrient chemical factors. The Journal of Experimental Zoology. 132 (2), 311-347 (1956).
- Grinblat, Y., Lane, M. E., Sagerström, C., Sive, H. Analysis of zebrafish development using explant culture assays. Methods in Cell Biology. 59, 127-156 (1999).
- Sagerström, C. G., Grinblat, Y., Sive, H. Anteroposterior patterning in the zebrafish, Danio rerio: an explant assay reveals inductive and suppressive cell interactions. Development. 122 (6), 1873-1883 (1996).
- Sagerström, C. G., Gammill, L. S., Veale, R., Sive, H. Specification of the enveloping layer and lack of autoneuralization in zebrafish embryonic explants. Devolopmental Dynamics. 232 (1), 85-97 (2005).
- Xu, P. F., Houssin, N., Ferri-Lagneau, K. F., Thisse, B., Thisse, C. Construction of a vertebrate embryo from two opposing morphogen gradients. Science. 344 (6179), 87-89 (2014).
- Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. Nodal and planar cell polarity signaling cooperate to regulate zebrafish convergence and extension gastrulation movements. eLife. 9, (2020).
- de Olivera-Melo, M., Xu, P. F., Houssin, N., Thisse, B., Thisse, C. Generation of ectopic morphogen gradients in the Zebrafish blastula. Methods in Molecular Biology. 1863, 125-141 (2018).
- Sepich, D. S., Calmelet, C., Kiskowski, M., Solnica-Krezel, L. Initiation of convergence and extension movements of lateral mesoderm during zebrafish gastrulation. Devolopmental Dynamics. 234 (2), 279-292 (2005).
- Gritsman, K., et al. The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodal signaling. Cell. 97 (1), 121-132 (1999).
- Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
- Spemann, H., Manngold, H. Uber inducktion von embryoalanlangen durch implantation artfremder organisatoren. Archiv für mikroskopische Anatomie und Entwicklungsmechanik. 100, 599-638 (1924).
- Mangold, O. Über die Induktionsfähigkeit der verschiedenen Bezirke der Neurula von Urodelen. Naturwissenschaften. 21 (43), 761-766 (1933).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Agathon, A., Thisse, C., Thisse, B. The molecular nature of the zebrafish tail organizer. Nature. 424 (6947), 448-452 (2003).
- Tacke, L., Grunz, H. Close juxtaposition between inducing chordamesoderm and reacting neuroectoderm is a prerequisite for neural induction in Xenopus laevis. Cell Death and Differentiation. 24 (1), 33-43 (1988).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. The International Journal of Developmental Biology. 54 (4), 731-736 (2010).
- Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. A mesoderm-independent role for Nodal signaling in convergence & extension gastrulation movements. BioRxiv. , (2019).
- Londin, E. R., Niemiec, J., Sirotkin, H. I. Chordin, FGF signaling, and mesodermal factors cooperate in zebrafish neural induction. Developmental Biology. 279 (1), 1-19 (2005).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Veenvliet, J. V., et al. Mouse embryonic stem cells self-organize into trunk-like structures with neural tube and somites. Science. 370 (6522), (2020).
- Beccari, L., et al. Multi-axial self-organization properties of mouse embryonic stem cells into gastruloids. Nature. 562 (7726), 272-276 (2018).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582 (7812), 410-415 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomics reveal somitogenesis in gastruloids. Nature. 582 (7812), 405-409 (2020).
