Summary
Zebrafisk blastoderm explants genereres ved at isolere embryonale celler fra endogene signalcentre i det tidlige embryo, der producerer relativt naive celle klynger let manipuleret og kultiveret ex vivo. Denne artikel indeholder instruktioner til fremstilling af sådanne explants og demonstrerer deres nytte ved at forhøre roller for Nodal signalering under gastrulation.
Abstract
På grund af deres optiske klarhed og hurtige udvikling er zebrafiskembryoner et fremragende system til undersøgelse af celleadfærd og udviklingsprocesser. Men på grund af kompleksiteten og redundansen af embryonale signaler kan det være udfordrende at skelne den komplette rolle af et enkelt signal under tidlig embryogenese. Ved at eksplante dyreregionen af zebrafisk blastoderm genereres relativt naive klynger af embryonale celler, der let kan dyrkes og manipuleres ex vivo. Ved at indføre et gen af interesse ved RNA injektion før explantation, kan man vurdere effekten af dette molekyle på genekspression, celle adfærd, og andre udviklingsmæssige processer i relativ isolation. Desuden kan celler fra embryoner af forskellige genotyper eller tilstande kombineres i en enkelt kimær explant for at undersøge celle /vævsinteraktioner og vævsspecifikke genfunktioner. Denne artikel indeholder instruktioner til generering af zebrafisk blastoderm explants og viser, at et enkelt signalmolekyle - en Nodal ligand - er tilstrækkelig til at fremkalde kimlag dannelse og udvidelse morfogenese i ellers naive embryonale væv. På grund af deres evne til at generobre embryonale celle adfærd, morfogen gradienter, og genekspression mønstre i en forenklet ex vivo system, disse explants forventes at være af stor nytte for mange zebrafisk forskere.
Introduction
Et flerårigt mål for udviklingsbiologiområdet er at optrævle kompleksiteten af at udvikle embryoner for at forstå oprindelsen af dyrs form og funktion. Selv tidlige embryoner indeholder et komplekst medley af signalmolekyler, celle- og vævsinteraktioner og mekaniske kræfter, der alle er underlagt streng rumlig og tidsmæssig regulering. Derfor er det ofte en udfordring at udpege den præcise rolle, som et bestemt signal spiller i en udviklingsproces af interesse. Ved at fjerne embryonale væv fra deres endogene miljø skaber embryo explantation en forenklet platform til at skelne de enkelte vævs og molekylers udviklingsroller i relativ isolation. Eksplantation teknikker er måske bedst kendt i Xenopus laevis, hvor de er blevet brugt til at studere væv induktion, celle signalering, celle vedhæftning, og morfogenese, blandt andre processer1,2,3,4. Såkaldte dyrehætte explants, hvor dyreregionen blastula fase Xenopus embryoner er isoleret før induktive interaktioner5,6,7, er en udbredt og kraftfuld explant teknik. Unmanipulated dyrehætter er skæbnebestemt til at blive ectoderm7,8. Alligevel er de kompetente til at reagere på flere induktive faktorer, så de kan danne væv af alle tre kimlag og gennemgå vævssvarende morfogenetiske bevægelser9,10,11. Begrænsede genetiske værktøjer og suboptimal egnethed til levende billeddannelse forhindrer imidlertid brugen af Xenopus dyrehætte explants for mange udviklingsbiologer. Ved at explanting blastoderm celler fra zebrafisk embryoner, kan forskerne kombinere nytten af dyrehætte assay med optisk klarhed, overflod af genetiske værktøjer, og andre eksperimentelle fordele ved zebrafisk model system.
Til dato har forskere gjort brug af to varianter af zebrafisk explants: såkaldte pescoids og blastoderm explants. I den pescoid model, hele blastoderm, herunder den marginale zone, er isoleret fra æggeblommen og lov til at udvikle ex vivo uden extraembryonic æggeblomme syncytial lag (YSL)12,13. På denne måde har pescoids en bemærkelsesværdig lighed med Fundulus explants genereret årtier siden af Jane Oppenheimer og JP Trinkaus14,15. Disse explants rekapitulere mange aspekter af embryonale mønstre og morfogenese12,13. Men fordi disse isolater indeholder endogene signalcentre (den embryonale margen), er de ikke forenklet med hensyn til deres molekylære miljø. Alternativt kan forskere generere relativt naive zebrafisk blastoderm explants ved at udelukke marginal zone16,17,18,19,20,21. Unmanipulated zebrafisk blastoderm explants udtrykke høje niveauer af knogle morfogenetisk protein (BMP) morfogener19 og give anledning til ikke-neurale ectoderm og omsluttende lag (EVL) når kultiveret ex vivo18. Men de rekapitulerer mange aspekter af aksial mønster og morfogenese som reaktion på udefrakommende signalgradienter19,20,21, svarende til Xenopus dyrehætter. Af denne grund er blastoderm explants en fordelagtig model til at studere en given morfogens (eller morfogener) rolle i kimlagspecifikation, morfogenetiske cellebevægelser og signaleringsgradienter inden for et forenklet signalmiljø. Desuden kan blastodermer fra embryoner af forskellige genotyper eller tilstande kombineres i en enkelt kimær explant19,21 for at undersøge celle / væv autonomi og induktive interaktioner.
Zebrafisk blastoderm explants kan bruges til at undersøge den rolle, embryonale signaler (for eksempel Nodal) i morfogenese og væv specifikation under gastrulation. Ved at injicere syntetisk ndr2 RNA (kodning af en Nodal ligand) på encellet fase aktiveres Nodal-signalering i hele embryoets blastoderm. Explants fra disse embryoner generere Nodal signalering gradienter, danne alle tre kim lag, og gennemgå konvergens og udvidelse (C &E) gastrulation bevægelser som set i intakte embryoner20. Derudover bruges kimær explants til at illustrere mesodermvævs evne til at fremkalde neuroectoderm fra uinjectederede (naive) blastoderm. Denne protokol giver instruktioner til at skabe zebrafisk blastoderm explants og viser deres nytte i at definere den rolle, Nodal signalering i væv induktion og morfogenese.
Protocol
1 Forbered reagenser og forsyninger
- Reagensforberedelse
- Klargør 500 mL 3x Danieaus opløsning (Løsning 1, tabel 1).
- Tilbered 1 L æggevand (Løsning 2, tabel 1).
- Forbered en 1,2% opløsning af agarose i æggevand. Smelt agarose helt i mikrobølgeovnen, og afkøles derefter til 55 °C i et vandbad.
- Forbered 4 mL explant-medier (Løsning 3, tabel 1, ændret en smule fra19,21) pr. forsøgsbetingelse.
BEMÆRK: Husk at tegne mindst én brønd af explants fra ikke-injicerede (eller kontrol injicerede) embryoner ved beregning af det krævede volumen.- Saner arbejdsområdet med 70% ethanol.
- Fjern cellekulturmedier fra 4 °C, og spray/tør med 70 % ethanol.
- Der fremstilles explantmedier, og der skal i inkubatoren på 28,5 °C placeres for at blive varme, mens embryonerne injiceres.
BEMÆRK: Medtag altid aldersmatchede, intakte søskendefostre til iscenesættelsesformål. Dechorionat disse embryoner og kultur dem på agarose-coatede plader i 0,3 x Danieau opløsning (Løsning 4, tabel 1).
- Pronase aliquots (1 mL ved 20 mg/mL) fjernes fra -20 °C, og optø på is. Optø en 1 mL aliquot for hver tre eksperimentelle betingelser.
- Forbered agarose plader
- Lav injektionspladerne.
- Fyld en 100 mm x 15 mm plastik Petriskål halvvejs med smeltet agarose i æggevand.
- Placer forsigtigt sprøjteformen oven på den smeltede agarose i en 45° vinkel og sænk den gradvist ind i agarose, så ingen bobler er fanget nedenunder. Lad det køle helt af.
- Fjern formen. Pladen skal straks eller opbevares til senere ved at tilsætte 2 mL æggevand, indpakning af pladen og opbevaring af den ved 4 °C. Pladen opvarmes i 15-30 min.
- Lav explant skæreplader.
- Tilsæt 3 mL smeltet 1,2% agarose i æggevand til en 60 mm x 15 mm Petriskål, hvilket sikrer, at hele bunden af brønden er belagt. Lad det køle helt af.
- Coat kultur plader med agarose.
- For hver eksperimentel tilstand dispenseres 1 mL smeltet 1,2% agarose i æggevand i en brønd af en 6-brønds plade, hvilket sikrer, at hele bunden af brønden er belagt. Lad det køle helt af.
- Til fremstilling af kimær explants, skabe en explant skære parabol med små brønde ved at tilføje tolv 1 mm glasperler til smeltet agarose i en 60 mm x 15 mm Petri fad. Fjern perlerne med sammentræd, når agarose køler helt.
- Lav injektionspladerne.
2 Injicer embryoner med RNA
- Brug handsker, fjern en aliquot af syntetisk ndr2 mRNA fra opbevaring ved -80 °C, og læg den straks på is.
- Forbered injektionsnålen.
- Fyld en trukket glas kapillær nål med RNA. Placer den fyldte nål i en mikromanipulator, og bryd spidsen af nålen med sammentrak.
- Kalibrer injektionsvolumen ved hjælp af et fasemikrometer med en dråbe mineralsk olie, justering af injektionstid og tryk på den pneumatiske injektor for at opnå en bolus af den ønskede størrelse. En bolus med en diameter på 120 μm har et volumen på 1 nL.
BEMÆRK: Den ønskede volumen af bolus vil afhænge af koncentrationen af RNA og den ønskede dosis pr embryo. Hvis RNA f.eks. er underholdsret ved 10 ng/μL, skal du injicere 1 nL for at opnå en endelig mængde på 10 pg.- Hold RNA-nålespidsen nedsænket i olien, indtil den er klar til at injicere.
- Læg embryonerne og indsprøjt.
- Træk skillevæggene i avlstanke, lad fisk gyde i 10-15 minutter, og saml embryonerne ved hjælp af en tes si.
- Læg embryonerne i injektionspladen ved hjælp af en Pasteur pipette og pipettepumpe, og brug derefter en behandsket finger til at presse æggene forsigtigt ind i trugene.
- Indsprøjt 10 pg ndr2 RNA i æggeblommen af encellede embryoner, indtil det ønskede antal embryoner er nået, eller indtil embryoner begynder at dele sig.
BEMÆRK: Sprøjt ikke efter enkeltcellestadiet for at sikre jævn fordeling af RNA'et i hele embryoet. - Vask embryonerne ud af injektionspladen i en mærket 100 mm x 15 mm Petriskål med en blid strøm af æggevand fra en klemmeflaske.
BEMÆRK: Hold altid en gruppe aldersmatchede, ikke-injicerede søskende som kontroller. - Embryonerne placeres i inkubatoren på 28,5 °C, indtil de når 128-cellestadiet. Fjern ubefrugtede æg og døde embryoner fra fadet.
3 Dechorionate embryonerne
- Når embryonerne har nået 128-cellestadiet, skal du placere dem i mærket glas Petriskåle og dekantere så meget ægvand som muligt fra dem.
- Mærk glas krystallisering retter med lab tape (svarende til små parabol navne) og fylde 2/3 af vejen med æg vand. Placer disse retter ved siden af dissekering mikroskop for hurtig tilgængelighed.
- Tilsæt 1 mL pronaselager (20 mg/mL, optøet på is) til 15 mL af 3x Danieaus opløsning i et 50 mL konisk rør.
BEMÆRK: Dette beløb er tilstrækkeligt til op til tre forsøgsbetingelser. Forøg mængden af pronase og 3x Danieaus opløsning til yderligere explant betingelser.
FORSIGTIG: Pronase er irriterende; derfor bære handsker ved håndtering. - Tilsæt mindst 5 mL pronaseopløsning til hvert glas Petriskål indeholdende embryoner.
- Agiter glasskålene i en cirkulær bevægelse, der overvåger udviklingen af dechorionation konsekvent under et dissekeringmikroskop.
- Når chorions begynder at rynke og 1-2 embryoner er ude af deres chorions, forsigtigt dunk glasset Petriskål indeholder pronase og embryoner i den tilsvarende glas krystallisering fad, der indeholder æggevand.
- Vask de de sammensokionerede embryoner.
- Vask embryonerne tre gange med æggevand ved forsigtigt at tilføje og derefter dekantere æggevand fra skålen.
- Den tredje og sidste vask er med 0,3x Danieaus løsning.
BEMÆRK: Hvis embryonerne stadig har chorions efter vask, skal embryonerne forsigtigt pipettes, indtil chorions er fjernet, eller lad dem sidde i vasken (æggevand eller 0,3x Danieaus opløsning) i et minut eller to og forsigtigt agitere med cirkulære bevægelser.
- Dæk afkosionerede embryoner med et petriskållåg, og sæt dem tilbage til inkubatoren (28,5 °C), indtil de når 256-cellestadiet.
4 Klip explants
- Fyld den agarosebelagte 60 mm x 15 mm Petriskål med 3x Danieaus opløsning.
- Når embryonerne er på 256-cellestadiet, overfør dem til den agarosebelagte plade, der indeholder 3x Danieaus opløsning, foring dem op langs midten af skålen.
- Skær explants ved hjælp af sammentak (figur 1).
- Brug det ene par sammenkæd, holdt lukket, til at stabilisere embryoet og bruge den anden til at skære gennem blastoderm på ca halvdelen af sin højde (fra margen til dyr pol) (Figur 1A).
- For at skære, klem forsigtigt blastodermcellerne med et par sammenkædninger. Tag derefter de stabiliserende sammenkædninger og kør dem langs de andre sammenkædninger for at skære ca. halvvejs over blastoderm (Figur 1B).
- Roter embryoet, placere de sammenkædninger i den eksisterende snit, og derefter afskære de resterende blastoderm ortogonale til den første snit (Figur 1C).
- Hold explants i 3x Danieau's opløsning i mindst 5 minutter for at helbrede, og overfør dem derefter til brønden af en 6-brønds plade belagt med agarose og fyldt med 4 mL explant medier.
BEMÆRK: Klip explants fra ikke-injicerede (eller kontrol injicerede) søskende som negative kontroller. Hvis explants udføres korrekt, vil disse explants hverken udvide eller udtrykke markører for endoderm, mesoderm, eller neuroectoderm. - Explantkulturpladerne placeres i 28,5 °C-inkubatoren, indtil det ønskede tidspunkt/stadium (bestemt ud fra intakte søskende) er nået.
BEMÆRK: Hvis man behandler explants med en forbindelse, såsom en lille molekylehæmmer, kan den ønskede koncentration tilsættes direkte til explantmediet i brøndene på de ønskede tidspunkter. Husk at inkludere mængden af agarose ved beregning af koncentrationer. (Eksempel: 1 mL agarose + 4 mL explant medier = 5 mL samlede volumen pr. Brønd).
5 Forbered kimær explants
- I stedet for en regelmæssig agarosebelagt plade skæres kimær explants i en skål med agarose støbt i tolv små, lavvandede brønde ved hjælp af 1 mm glasperler (punkt 1.2.4). Fyld denne plade med 3x Danieaus opløsning.
BEMÆRK: Kimær explants genereres fra blastodermceller af to embryoner af forskellige genotyper eller tilstande. Sørg for, at disse betingelser kan skelnes fra hinanden ved at udtrykke transgene eller injicerede fluorescerende markører.- Forbered ved at tilføje tolv embryoner af en genotype / tilstand til venstre side af pladen og tolv embryoner af den anden genotype / tilstand til højre side af pladen.
- Flyt et embryo af hver tilstand ind i midten af pladen, nær en af de 12 brønde.
- Ved hjælp af sammentakter skæres en explant fra hvert embryo som beskrevet for enkelte embryo explants (trin 4.3).
- Tryk hurtigt de afskårne kanter af de to explants sammen i den lavvandede brønd ved hjælp af sammentakkerne for at give de to halvdele mulighed for at helbrede sammen i en enkelt explant.
- Fortsæt med de resterende elleve brønde i pladen. Når explants er helet, overføre dem til brønden af en 6-brønd plade belagt med agarose og fyldt med 4 mL explant medier. Gentag indtil det ønskede antal explants er opnået.
6 Kultur og/eller billede af de faste explants
- Kultur explants i 28,5 °C inkubatoren, indtil intakte søskende embryoner når det ønskede stadium.
- Levende explants kan monteres for kontinuerlig time-lapse imaging, afbildet periodisk i hele kulturperioden, eller afbildet live på den eksperimentelle endpoint.
- Fix explants hvis det ønskes. Når explants når det ønskede endepunkt, skal du bemærke stadiet af intakte embryo søskende og placere explants i et glas scintillation hætteglas med 1 mL af 4% paraformaldehyd i PBS. Fastgør natten over på en shaker ved 4 °C.
FORSIGTIG: Paraformaldehyd er giftigt. Brug handsker ved håndtering af dette kemikalie, og kassér det ved hjælp af metoder, der er godkendt af hver institution.- Efter fiksering skylles explants seks gange, 15 min hver med PBS + 0,1% Tween-20, og dehydrerer gradvist til methanol. Opbevar explants ved -20 °C til senere analyse af hele monteringen in situ hybridisering, immunofluorescent farvning osv.
Representative Results
Nodal ligands drive kim lag dannelse og C &E af zebrafisk blastoderm explants
Kontrol explants udskåret fra ikke-injicerede wild-type (WT) embryoner eller dem injiceret med 50 pg mRNA kodning grøn fluorescerende protein (GFP) forblev afrundet i hele kulturperioden (figur 2A-C) og undlod at udtrykke markører for mesoderm, endoderm, eller neuroectoderm ( Figur3C)20. Tilsammen indikerer disse fravær af morphogenese og kimlagsformation, der karakteriserer hvirveldyrgastrulation. Eksplanter skåret af embryoner injiceret med 10 pg ndr2 mRNA blev imidlertid meget langstrakt efter 8-9 timer i kultur (Figur 2D). Levende time-lapse imaging af disse explants ved differentialinterfering kontrast (DIC) mikroskopi viste, at udvidelse onsets på eller omkring 8 timer efter befrugtning (HPF) (Figur 2F), samme tid som C &E morfogenese begynder i intakt zebrafisk embryoner22. Explants skåret fra MZoep-/- embryoner, som mangler den essentielle tdgf1 Nodal co-receptor23, undlod at strække sig som reaktion på ndr2 injektion (Figur 2E), der viser, at Nodal aktivitet er afgørende for denne ex vivo morfogenese. Hertil kommer, at hele mount in situ hybridisering yderligere viste, at ndr2-udtrykkeexplants udtrykke markører af neuroectoderm (sox2) og flere mesoderm sub-typer (tbxta, noto, tbx16) (Figur 2G), samt endoderm og embryonaleorganisator 20.
Nodal signalering er ikke nødvendig for neuroectoderm induktion af mesoderm
Nodal signalering aktivitet er afgørende for induktion af endoderm og de fleste mesoderm, men kan undværes til neuroectoderm specifikation inden zebrafisk gastrulae23,24. Mens ikke-injicerede zebrafisk blastoderm explants ikke differentiere sig til neuroectoderm (Figur 3C18), explants fra embryoner injiceret med 10 pg ndr2 udstillet robust udtryk for neuroectoderm markør sox2 i forskellige striber langs den lange akse af explant (Figur 2G), hvilket indikerer, at Nodal aktivitet er nødvendig for neuroectoderm dannelse ex vivo. Det har længe været kendt, at mesodermale væv kan fremkalde neurale væv25,26,27,28,29, herunder i zebrafisk blastoderm explants17. Det er dog uklart, om neuroectoderm dannelse i denne explant system kræver Nodal signalering direkte eller om udefrakommende Nodal ligands induce mesoderm, der derefter inducerer neurale væv sekundært.
Kimær explants indeholdende potentielle mesoderm og neuroectoderm portioner fra to forskellige embryoner blev genereret for at teste, om Nodal signalering er påkrævet væv-autonomt for neuroectoderm specifikation ex vivo. Mesoderm-delen af hver explant blev skåret af et ellers WT-embryo, der udtrykker en mesodermspecifik transgen GFP-reporter, Tg[lhx1a:eGFP]30, injiceret med en høj dosis (100 pg) af ndr2 (Figur 3A). Den putative neuroectoderm del af hver explant blev skåret fra enten en kontrol WT embryo eller Nodal signalering mangelfuld MZoep-/- embryo injiceres kun med mRNA kodning fluorescerende nukleare markør H2B-RFP (Figur 3A). Hver kimær explant blev genereret ved at kombinere en blastoderm fra hver af disse to betingelser, som blev analyseret for udtryk for vævsspecifikke markører ved hel-mount in situ hybridisering på 12 hk.
Størstedelen af enkelt-embryo explants fra embryoner injiceret med 100 pg ndr2 udtrykt lidt eller ingen sox2,og udtrykte markører for mesoderm, herunder tbxta og lhx1a: gfp reporter-hele explant (Figur 3B,G). Uinjectederede WT blastoderm (af den type, der omfatter den potentielle neuroectoderm del af kimær explants) udtrykte hverken mesoderm markører eller sox2, når dyrkes som en enkelt explant, hvilket indikerer en mangel på neuroectoderm og mesoderm specifikation (Figur 3C, H). Enkelt-embryo explants fra MZoep-/- embryoner ligeledes manglede udtryk for både neuroectoderm og mesoderm markører, selv når injiceres med ndr2 (Figur 3D). Men når uinjectederede WT blastodermer blev kombineret med mesoderm induceret af høje doser af Nodal ligands, disse kimær explants udtrykt både mesoderm markører og sox2 robust (Figur 3E, I). Disse resultater viser, at, som tidligere observeret17,26,27,29, mesoderm kan fremkalde neural skæbne i celler, der ellers ville blive ikke-neurale ectoderm. For at teste, om Nodal signalering er påkrævet direkte inden for den potentielle neuroectoderm del af disse explants for deres neurale induktion, kimær explants blev skabt fra WT blastodermer injiceret med 100 pg ndr2 og blastodermer fra MZoep-/- embryoner (Figur 3J). På trods af deres manglende evne til at modtage Nodal signaler fra den nærliggende mesodermal del, disse explants udtrykt sox2 i samme grad som WT kontrol kimærer (Figur 3F). Dette resultat viser, at i overensstemmelse med intakte embryoner, hvor neurale væv er specificeret i mangel af Nodal aktivitet, Nodal signalering er ikke påkrævet væv-autonomt for neuroectoderm induktion ex vivo.
Figur 1: Procedure for zebrafisk blastoderm explantation (trin 4.3). (A) Hold sammenkæverne i den ikke-dominerende hånd (orange) lukket mod æggeblommen for at stabilisere embryoet, mens du klemmer blastodermen på ca. 1/2 af højden ved hjælp af sammenkæderne i den dominerende hånd (blå). (B) Kør de orange sammenkædning langs kanten af de blå sammenkædning, der griber embryoet for at skære gennem blastodermen, så det første snit når cirka halvvejs over blastodermen. (C) Roter embryoet 90°, og placer derefter de blå sammenkæd inde (men ortogonale til) det oprindelige snit og klem for at afskære de resterende blastoderm. (D) Lad explantede blastodermceller hele i 3x Danieaus opløsning i ca. 5 minutter, før de overføres til explantmedier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 (ændret fra20): Nodal ligands fremmer C&E morfogenese og kimlagsdannelse i zebrafisk blastoderm explants. (A) Diagram over injektion og explantation af zebrafisk embryoner. (B-E) Repræsentative lyse feltbilleder af levende blastoderm explants af de angivne forhold / genotyper på samme 2-4 somit fase. N = antal explants fra to til fire uafhængige forsøg. (F) DIC-serie, der er timeforsynet, af en repræsentativ explant fra et WT-embryo injiceret med 10 pg ndr2 RNA. (G) Repræsentative billeder af hele mount in situ hybridisering for udskrifter angivet i explants fra WT embryoner injiceret med 10 pg ndr2 RNA. Skalalinjer er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 (Ændret fra31):Kimær explants viser, at neuroectoderm specifikation ikke kræver væv-autonome Nodal signalering ex vivo. (A) Diagram over proceduren til fremstilling af kimær zebrafisk explants. (B-F) Helmonteret in situ hybridisering for mesoderm markør tbxta (top) og neuroectoderm markør sox2 (nederst) i explants fra WT embryoner injiceret med 100 pg ndr2 RNA (B), uinjectederede WT kontrol (C), MZoep-/- injiceres med 10 pg ndr2 (D),og kimær explants indeholdende neuroectoderm portioner fra WT (E) eller MZ oep -/- ( Færmeje explants indeholdende neuroectoderm portioner fra WT ( E ) eller MZ oep -/- ( Færmeje explants indeholdende neuroectoderm portioner fra WT ( E ) eller MZ oep -/- ( Færmeje explants indeholdende neuroectoderm portioner fra WT ( E ) eller MZ oep -/- ( Færmeme explants indeholdende neuroectoderm portioner fra WT ( E ) eller MZ oep -/- ( Færmeriske explants indeholdende neuroectoderm portioner fra WT ( E ) eller MZ oep -/- ( Færkemeje explants indeholdende neuroectoderm portioner fra WT ( E ) eller MZ oep -/- ( Færmeje explants indeholdende neuroectoderm portioner fra WT ( E ) eller MZ oep -/- ( Færmeje explants indeholdende neuroectoderm portioner fra WT ( E ) eller MZoep-/- (Færmeje ) embryoner, der svarer til 2-4-somitstadiet. Fraktioner angiver antallet af explants med fænotypen vist over det samlede antal eksplanter undersøgt. (G-J) Repræsentative billeder af levende Tg[lhx1a:gfp] explants fra et enkelt embryo (G-H) eller kombineret med H2B-udtrykke blastodermer (I-J, magenta) af de betingelser, der er angivet på ækvivalenten af 2-4 somit fase. N = antal explants fra tre uafhængige forsøg. Skalalinjer er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning 1 | Løsning 2 | Løsning 3 | Løsning 4 | |
| Opløsning | 3x Danieau's | Æg vand | Explant-medier | 0,3 x Danieau's |
| Ingredienser | 174 mM NaCl | 60 μg/mL havsalte | DMEM/F12 + 2,5 mM L-Glutamin og 15 mM HEPES | 17,4 mM NaCl |
| 2,1 mM KCl | 1 L destilleret vand | 3% samlet volumen af Nyfødte Kalv Serum eller Føtal Bovine Serum | 0,21 mM KCl | |
| 1,2 mM MgSO4. 7H2O | 1:200 Penicillin (50 enheder/mL)-Streptomycin (50 μg/mL) | 0,12 mM MgSO4•7H2O | ||
| 1,8 mM Ca(NR.3)2 •4H2O | 0,18 mM Ca(NO3)2 •4H2O | |||
| 15 mM HEPES | Eksempel: | 1,5 mM HEPES | ||
| Destilleret vand | 4 mL/betingelse x 9 Betingelser = 36 mL | Destilleret vand | ||
| 1,08 mL Nyfødte Kalveserum (NCS, aliquoted i -20 °C (3%) | ||||
| 0,18 mL 200x Pen-Strep (PS, aliquoted i -20 °C) (1:200) | ||||
| 35 mL DMEM/F12 |
Tabel 1.
Discussion
Denne artikel har beskrevet, hvordan man genererer zebrafisk blastoderm explants og drøftet to praktiske anvendelser af disse explants i behandlingen af den rolle Nodal morfogen signalering i gastrulation. Denne metode til skæring og dyrkning af explants giver en blank skifer af naive celler, der kan manipuleres ved hjælp af RNA injektioner og behandling med små molekyle forbindelser til at undersøge en molekylær vej af interesse.
Kritiske skridt
Der er fire trin i denne protokol, der er særligt afgørende for dens succes. Den første er at injicere embryonerne med den passende mængde Nodal. Denne protokol anbefaler 10 pg ndr2 RNA, og selv om en række doser fremmer forlængelse, for meget eller for lidt Nodal vil forhindre optimal explant udvidelse20. Det andet skridt er at dechorionating embryonerne. Hvis embryonerne forbliver i pronase for længe, vil æggeblommerne briste, og embryonerne vil ikke være levedygtige at skære. Hvis de ikke er i pronase længe nok, chorions vil ikke blive løsnet ved vask og vil i stedet kræve tidskrævende manuel dechorionation. Det tredje kritiske skridt er at skære explants. Skæring i 3x Danieaus opløsning anbefales, da det lavere saltindhold i 0,3x Danieaus opløsning eller æggevand ikke fremmer heling og overlevelse af explants.
Derudover skal explants skæres på ca. halvdelen af højden af blastoderm for at sikre naivitet af cellerne. Hvis de skæres for tæt på æggeblommen, vil de indeholde signaler fra margenen (herunder endogene Nodal), der fremmer vævsspecifikation og morfogenese. Det fjerde og sidste kritiske skridt er i helbredelsen af kimær explants. To explants vil ikke smelte sammen for at danne kimærer, medmindre deres afskårne kanter forsigtigt presses sammen umiddelbart efter, at de er skåret.
Ændringer og fejlfinding
De vigtige trin, der er beskrevet ovenfor, giver muligheder for fejlfinding. Nogle fælles spørgsmål og foreslåede løsninger er beskrevet nedenfor.
Hvis explants ikke strækker sig i nærværelse af Nodal signalering, er der nogle mulige løsninger. A) Injicer embryoner i encellestadiet for at sikre, at RNA spredes jævnt i hele embryoet. (B) Undgå at injicere for meget nodal RNA ved at sikre, at den injicerede volumen er korrekt ved hjælp af et mikrometer til måling af injektions bolus. (C) Undgå at injicere for lidt nodal RNA ved at måle koncentrationen for at sikre, at det ikke er nedbrudt. (D) Hold nogle aldersmatchede intakte søskende for at udlede det tilsvarende stadium af explants. Explants opnå maksimal udvidelse, når intakte søskende nå 2-5 somite fase. Hvis explants indsamles for tidligt, vil den optimale udvidelse ikke blive nået.
Hvis æggeblommer brister efter dechorionation, og embryonerne ikke er levedygtige at skære, skal du fjerne embryonerne fra pronaseopløsningen, når chorions begynder at crinkle og 1-2 embryoner kaste deres chorion. Skyl derefter straks i æggevand.
Hvis explants vises boblende rundt om kanterne, er der nogle løsninger. A) Skær kun explants inden for en bestemt udviklingshorisont. Selv om explants skåret på ethvert tidspunkt fra 128- til 1000-celle stadier kan overleve og udvide i kultur, dem skåret på 256- til 512-celle faser tendens til at være den mest robuste. (B) Sørg for, at explants skæres i 3x Danieaus opløsning for at sikre korrekt heling. (C) Skær explants rent, men forsigtigt. Undgå at strække eller trække cellerne fra hinanden under skæreprocessen.
Hvis de ikke-injicerede kontrol explants strækker sig, explants var tilbøjelige til at skære for tæt på æggeblommen. For explants at være naive, sikre, at nedskæringerne er lavet halvvejs mellem æggeblommen og toppen af blastoderm.
Hvis de kimær explants undlader at smelte, er det sandsynligt, fordi tendensen til explants i 3x Danieau opløsning, når skåret er at runde op og helbrede over cut kant. For at sikre, at de to blastodermer heler til hinanden i stedet for sig selv, skal du trykke dem sammen umiddelbart efter skæring. Brug kraften til at lægge et blidt tryk på de nyligt sluttede blastodermer i agarose godt for at opmuntre dem til at helbrede sammen.
Begrænsninger
Mens disse explants er et værdifuldt redskab til at studere en given morfogens (eller et andet interessemolekyles) rolle i relativ isolation, skal observationer i enhver ex vivo-model fortolkes med omhu. Explants udviser C &E morfogenese, der er meget lig den observerede in vivo20, men de generobrer ikke alle aspekter af gastrulation, for eksempel epiboly bevægelser. De mangler også mange andre regulatoriske faktorer og signalering molekyler, der er til stede i en intakt embryo. Selv om dette er en betydelig eksperimentel fordel ved explants, kan det også føre til konklusioner, der ikke holder in vivo. For eksempel, da explants, der ikke modtager udefrakommende Nodal ligands undlader at udtrykke neuroectoderm markører, kan man konkludere fra explants alene, at Nodal signalering er nødvendig for neuroectoderm specifikation. Men neuroectoderm dannes i intakte embryoner mangler alle Nodal signalering23,24, der viser den vitale rolle andre signalering molekyler i neural specifikation32. Explants kan fortælle os, hvad en morfogen er i stand til i et isoleret miljø. Alligevel bør alle sådanne fund bekræftes i/sammenlignet med intakte embryoner, for at resultaterne kan fortolkes grundigt. Med andre ord kan explants ikke træde i stedet for et embryo under udvikling. I stedet er de et supplerende værktøj til at identificere en morfogens rolle og relation til omgivelserne. Med disse begrænsninger i tankerne er zebrafisk blastoderm explants et værdifuldt værktøj til mange forskningsspørgsmål.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Med fornyet interesse for syntetisk embryologi anvendes der regelmæssigt flere ex vivo- og in vitro-tilgange til at modellere aspekter af embryonal udvikling. For eksempel kan 2- og 3-dimensionelle gastruloider bestående af mus eller menneskelige embryonale / inducerede pluripotente stamceller lokkes gennem anvendelse af udefrakommende signalmolekyler for at generobre nogle af de mønstrende og / eller morfogenetiske hændelser af gastrulation, segmentering og neurulation33,34,35,36,37 . Selvom disse metoder er kraftfulde, kræver de besværlige og langvarige dyrkningsmetoder til både kontinuerligt at opretholde pluripotente stamceller og til at dyrke gastruloider, som tager mange dage at nå gastrulationsstadier. I modsætning hertil kræver zebrafisk explants ingen vedligeholdelse af stamcellekulturer, da embryoner simpelthen indsamles efter behov. De er relativt enkle at generere og nå gastrulationsstadier inden for få timer, det samme som zebrafiskembryoner. Dette fremhæver en anden fordel ved zebrafisk explants, deres intakte udviklingsmæssige ur. Fordi udviklingsalderen for embryonale og inducerede pluripotente stamceller kan være varierende og meget omdiskuteret, er embryonale explants måske bedre egnet til at undersøge tidsmæssig regulering af udviklingen. Endelig, mens pescoid zebrafisk explants (som indeholder embryonale margin) ligeledes udvide i kultur12,13, de gør det som reaktion på endogene signalcentre. I stedet gør de tidligere beskrevet forskere i stand til at undersøge molekyler af interesse med relativt lidt interferens fra sådanne embryonale signaler.
Potentielle fremtidige ansøgninger
Her blev explants brugt til at påvise, at Nodal signalering er nødvendig og tilstrækkelig til C &E morfogenese. Alligevel forventes det, at de kan og vil blive brugt til at skelne mange forskellige molekylers rolle i mange andre udviklingsprocesser, for eksempel regulering af genekspression, signaleringsgradienter og yderligere morfogenetiske programmer. Derudover, fordi disse explants er levedygtige indtil mindst 24 hkf19, kan det forventes, at deres nytte vil strække sig ud over gastrulation i processer som segmentering og organogenese, enhver proces, hvor forskerne ønsker en udviklingsmæssig blank tavle.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NICHD R00HD091386 til MLKW og af NIEHS T32ES027801 til AAE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
| 6-well plates | Fisher | FB012927 | |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
| Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
| DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
| Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
| Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
| Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
| HEPES | VWR | JT4018-1 | |
| Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| KCl | VWR | BDH9258-500G | |
| Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
| MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
| Mineral oil | VWR | MK635704 | |
| NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
| Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
| Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
| Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
| Tween-20 | VWR | 200002-836 |
References
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71 (5), 731-739 (1992).
- Sudarwati, S., Nieuwkoop, P. D. Mesoderm formation in the anuranXenopus laevis (Daudin). Wilhelm Roux Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (3), 189-204 (1971).
- Gurdon, J. B., Fairman, S., Mohun, T. J., Brennan, S. Activation of muscle-specific actin genes in Xenopus development by an induction between animal and vegetal cells of a blastula. Cell. 41 (3), 913-922 (1985).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ariizumi, T., et al. Isolation and differentiation of Xenopus animal cap cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1 Unit 1D.5 (2009).
- Asashima, M., Grunz, H. Effects of inducers on inner and outer gastrula ectoderm layers of Xenopus laevis. Differentiation. 23 (3), 206-212 (1983).
- Jones, E. A., Woodland, H. R. Development of the ectoderm in Xenopus: tissue specification and the role of cell association and division. Cell. 44 (2), 345-355 (1986).
- Keller, R. E. Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis. I. Prospective areas and morphogenetic movements of the superficial layer. Developmental Biology. 42 (2), 222-241 (1975).
- Sokol, S., Wong, G. G., Melton, D. A. A mouse macrophage factor induces head structures and organizes a body axis in Xenopus. Science. 249 (4968), 561-564 (1990).
- Thomsen, G., et al. Activins are expressed early in Xenopus embryogenesis and can induce axial mesoderm and anterior structures. Cell. 63 (3), 485-493 (1990).
- Howard, J. E., Smith, J. C. Analysis of gastrulation: different types of gastrulation movement are induced by different mesoderm-inducing factors in Xenopus laevis. Mechanisms of Development. 43 (1), 37-48 (1993).
- Fulton, T., et al. Axis specification in Zebrafish is robust to cell mixing and reveals a regulation of pattern formation by morphogenesis. Current Biology. 30 (15), 3063-3064 (2020).
- Schauer, A., Pinheiro, D., Hauschild, R., Heisenberg, C. -P. Zebrafish embryonic explants undergo genetically encoded self-assembly. eLife. , 55190 (2020).
- Oppenheimer, J. M. The development of isolated blastoderms of Fundulus heteroclitus. The Journal of Experimental Zoology. 72 (2), 247-269 (1936).
- Trinkaus, J. P., Drake, J. W. Exogenous control of morphogenesis in isolated Fundulus blastoderms by nutrient chemical factors. The Journal of Experimental Zoology. 132 (2), 311-347 (1956).
- Grinblat, Y., Lane, M. E., Sagerström, C., Sive, H. Analysis of zebrafish development using explant culture assays. Methods in Cell Biology. 59, 127-156 (1999).
- Sagerström, C. G., Grinblat, Y., Sive, H. Anteroposterior patterning in the zebrafish, Danio rerio: an explant assay reveals inductive and suppressive cell interactions. Development. 122 (6), 1873-1883 (1996).
- Sagerström, C. G., Gammill, L. S., Veale, R., Sive, H. Specification of the enveloping layer and lack of autoneuralization in zebrafish embryonic explants. Devolopmental Dynamics. 232 (1), 85-97 (2005).
- Xu, P. F., Houssin, N., Ferri-Lagneau, K. F., Thisse, B., Thisse, C. Construction of a vertebrate embryo from two opposing morphogen gradients. Science. 344 (6179), 87-89 (2014).
- Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. Nodal and planar cell polarity signaling cooperate to regulate zebrafish convergence and extension gastrulation movements. eLife. 9, (2020).
- de Olivera-Melo, M., Xu, P. F., Houssin, N., Thisse, B., Thisse, C. Generation of ectopic morphogen gradients in the Zebrafish blastula. Methods in Molecular Biology. 1863, 125-141 (2018).
- Sepich, D. S., Calmelet, C., Kiskowski, M., Solnica-Krezel, L. Initiation of convergence and extension movements of lateral mesoderm during zebrafish gastrulation. Devolopmental Dynamics. 234 (2), 279-292 (2005).
- Gritsman, K., et al. The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodal signaling. Cell. 97 (1), 121-132 (1999).
- Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
- Spemann, H., Manngold, H. Uber inducktion von embryoalanlangen durch implantation artfremder organisatoren. Archiv für mikroskopische Anatomie und Entwicklungsmechanik. 100, 599-638 (1924).
- Mangold, O. Über die Induktionsfähigkeit der verschiedenen Bezirke der Neurula von Urodelen. Naturwissenschaften. 21 (43), 761-766 (1933).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Agathon, A., Thisse, C., Thisse, B. The molecular nature of the zebrafish tail organizer. Nature. 424 (6947), 448-452 (2003).
- Tacke, L., Grunz, H. Close juxtaposition between inducing chordamesoderm and reacting neuroectoderm is a prerequisite for neural induction in Xenopus laevis. Cell Death and Differentiation. 24 (1), 33-43 (1988).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. The International Journal of Developmental Biology. 54 (4), 731-736 (2010).
- Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. A mesoderm-independent role for Nodal signaling in convergence & extension gastrulation movements. BioRxiv. , (2019).
- Londin, E. R., Niemiec, J., Sirotkin, H. I. Chordin, FGF signaling, and mesodermal factors cooperate in zebrafish neural induction. Developmental Biology. 279 (1), 1-19 (2005).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Veenvliet, J. V., et al. Mouse embryonic stem cells self-organize into trunk-like structures with neural tube and somites. Science. 370 (6522), (2020).
- Beccari, L., et al. Multi-axial self-organization properties of mouse embryonic stem cells into gastruloids. Nature. 562 (7726), 272-276 (2018).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582 (7812), 410-415 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomics reveal somitogenesis in gastruloids. Nature. 582 (7812), 405-409 (2020).
