Summary
Zebrafish blastoderm explants genereras genom att isolera embryonala celler från endogena signalcentra inom det tidiga embryot, vilket producerar relativt naiva cellkluster som lätt manipuleras och odlas ex vivo. Den här artikeln innehåller instruktioner för att göra sådana explanter och demonstrerar deras användbarhet genom att förhöra roller för Nodal-signalering under gastrulation.
Abstract
På grund av deras optiska klarhet och snabba utveckling är zebrafiskembryon ett utmärkt system för att undersöka cellbeteenden och utvecklingsprocesser. På grund av komplexiteten och redundansen av embryonala signaler kan det dock vara utmanande att urskilja den fullständiga rollen för en enda signal under tidig embryogenes. Genom att explantera djurregionen i zebrafisk blastoderm genereras relativt naiva kluster av embryonala celler som lätt kan odlas och manipuleras ex vivo. Genom att införa en gen av intresse genom RNA-injektion före explantation kan man bedöma effekten av denna molekyl på genuttryck, cellbeteenden och andra utvecklingsprocesser i relativ isolering. Dessutom kan celler från embryon av olika genotyper eller tillstånd kombineras i en enda chimerisk explant för att undersöka cell-/vävnadsinteraktioner och vävnadsspecifika genfunktioner. Denna artikel innehåller instruktioner för att generera zebrafisk blastoderm explants och visar att en enda signalmolekyl - en Nodal ligand - är tillräcklig för att inducera bakterie lager bildning och förlängning morphogenesis i annars naiva embryonala vävnader. På grund av deras förmåga att rekapitulera embryonala cellbeteenden, morfonagradienter och genuttrycksmönster i ett förenklat ex vivo-system, förväntas dessa explanter vara till stor nytta för många zebrafiskforskare.
Introduction
Ett ständigt mål för utvecklingsbiologiområdet är att avslöja komplexiteten i att utveckla embryon för att förstå ursprunget till djurform och funktion. Även tidiga embryon innehåller ett komplext medley av signalmolekyler, cell- och vävnadsinteraktioner och mekaniska krafter, alla föremål för strikt rumslig och tidsmässig reglering. Därför är det ofta utmanande att fastställa den exakta rollen för en viss signal i en utvecklingsprocess av intresse. Genom att avlägsna embryonala vävnader från sin endogena miljö skapar embryoexplantation en förenklad plattform där man kan urskilja utvecklingsrollerna för enskilda vävnader och molekyler i relativ isolering. Explantationstekniker är kanske mest kända i Xenopus laevis, där de har använts för att studera vävnadsinduktion, cellsignalering, cell vidhäftning och morfogenes, bland andra processer1,2,3,4. Så kallade djurkapslar explanter, där djurregionen av blastula stadium Xenopus embryon isoleras före induktiva interaktioner5,6,7, är en utbredd och kraftfull explantteknik. Unmanipulated djurkapslar är dömda att bli ectoderm7,8. Fortfarande är de kompetenta att svara på flera induktiva faktorer, så att de kan bilda vävnader av alla tre bakterieskikten och genomgå vävnadsanpassade morfogenetiska rörelser9,10,11. Begränsade genetiska verktyg och suboptimell lämplighet för levande avbildning förhindrar dock användningen av Xenopus djurmössa explanter för många utvecklingsbiologer. Genom att explantera blastodermceller från zebrafiskembryon kan forskare kombinera nyttan av djurmössans analys med den optiska klarheten, överflöd av genetiska verktyg och andra experimentella fördelar med zebrafiskmodellsystemet.
Hittills har forskare använt sig av två smaker av zebrafiskexplanter: så kallade pescoider och blastoderm explanter. I pescoidmodellen är hela blastoderm, inklusive marginalzonen, isolerad från äggulan och får utveckla ex vivo utan extraembryonic yolk syncytial layer (YSL)12,13. På detta sätt har pescoider en anmärkningsvärd likhet med Fundulus explanter som genererades för årtionden sedan av Jane Oppenheimer och J.P. Trinkaus14,15. Dessa explanter sammanfattar många aspekter av embryonal mönstra och morfogenes12,13. Men eftersom dessa isolat innehåller endogena signalcentra (den embryonala marginalen) förenklas de inte med avseende på deras molekylära miljö. Alternativt kan forskare generera relativt naiva zebrafisk blastoderm explanter genom att utesluta marginalzonen16,17,18,19,20,21. Unmanipulated zebrafish blastoderm explants uttrycker höga nivåer av benmorfogenetiskt protein (BMP) morfogener19 och ger upphov till icke-neural ektoderm och omslutande lager (EVL) när odlade ex vivo18. De sammanfattar dock många aspekter av axiell mönstraring och morfogenes som svar på exogena signalgradienter19,20,21, liknande Xenopus djurkapslar. Av denna anledning är blastoderm explants en fördelaktig modell för att studera rollen av en given morfogen (eller morfogener) i pelarskiktets specifikation, morfogenetiska cellrörelser och signalgradienter inom en förenklad signalmiljö. Dessutom kan blastodermer från embryon av olika genotyper eller tillstånd kombineras i en enda chimerisk explant19,21 för att undersöka cell/ vävnad autonomi och induktiva interaktioner.
Zebrafish blastoderm explants kan användas för att undersöka embryonala signalers roll (till exempel Nodal) i morfogenes och vävnadsspecifikation under gastrulation. Genom att injicera syntetiskt ndr2 RNA (kodning av en Nodal ligand) i encellsstadiet aktiveras Nodal-signalering i hela embryots blastoderm. Explanter från dessa embryon genererar Nodal-signalgradienter, bildar alla tre bakterielagren och genomgår konvergens- och förlängningsrörelser (C&E) som ses i intakta embryon20. Dessutom används chimeric explants för att illustrera förmågan hos mesoderm vävnader att inducera neuroectoderm från oinsprutade (naiva) blastoderm. Detta protokoll ger instruktioner för att skapa zebrafish blastoderm explants och visar deras nytta i att definiera rollen av Nodal signalering i vävnad induktion och morfogenes.
Protocol
1 Förbered reagenser och förnödenheter
- Reagensberedning
- Förbered 500 ml 3x Danieaus lösning (lösning 1, tabell 1).
- Förbered 1 L äggvatten (lösning 2, tabell 1).
- Förbered en 1,2% lösning av agaros i äggvatten. Smält agarosen helt i mikrovågsugnen och svalna sedan till 55 °C i ett vattenbad.
- Förbered 4 ml explantmedium (lösning 3, tabell 1,modifierat något från19,21) per försökstillstånd.
OBS: Kom ihåg att ta hänsyn till minst en brunn av explanter från ej injicerade (eller kontrollinsprutade) embryon vid beräkning av önskad volym.- Sanera arbetsytan med 70% etanol.
- Ta bort cellodlingsmediet från 4 °C och spraya/torka med 70% etanol.
- Gör explantmediet och placera i inkubatorn 28,5 °C för att värma medan embryona injiceras.
OBS: Inkludera alltid åldersmatchade, intakta syskonembryon för iscensättningsändamål. Dechorionate dessa embryon och odla dem på agarosbelagda plattor i 0,3x Danieaus lösning (Lösning 4, tabell 1).
- Ta bort pronas alikvoter (1 ml vid 20 mg/ml) från -20 °C och låt tina på is. Tina en 1 mL alikvot för var tredje experimentella tillstånd.
- Förbered agaroseplattor
- Gör injektionsplattorna.
- Fyll en 100 mm x 15 mm petriskål i plast halvvägs med smält agaros i äggvatten.
- Placera försiktigt formsprutformen ovanpå den smälta agarosen i 45° vinkel och sänk den gradvis i agaroset, så att inga bubblor fastnar under. Låt det svalna helt.
- Ta bort formen. Använd plattan omedelbart eller spara till senare genom att tillsätta 2 ml äggvatten, slå in plattan och lagra den vid 4 °C. Värm plattan i 15-30 min i inkubatorn 28,5 °C före injektion.
- Gör explant skärplattor.
- Tillsätt 3 ml smält 1,2% agaros i äggvatten till en 60 mm x 15 mm Petri-skål, vilket säkerställer att hela botten av brunnen är belagd. Låt det svalna helt.
- Täck odlingsplattor med agaros.
- För varje experimentellt tillstånd, dispensera 1 ml smält 1,2% agaros i äggvatten i en brunn på en 6-brunnsplatta, vilket säkerställer att hela botten av brunnen är belagd. Låt det svalna helt.
- För att göra chimeriska explanter, skapa en explant skärform med små brunnar genom att lägga till tolv 1 mm glaspärlor till smält agaros i en 60 mm x 15 mm Petri-skål. Ta bort pärlorna med tång när agarosen svalnar helt.
- Gör injektionsplattorna.
2 Injicera embryon med RNA
- Använd handskar, ta bort en alikvot syntetisk ndr2 mRNA från lagring vid -80 °C och placera den omedelbart på is.
- Förbered injektionsnålen.
- Fyll en dragen kapillärnål i glas med RNA. Placera den fyllda nålen i en mikromanipulatör och bryt nålens spets med tång.
- Kalibrera injektionsvolymen med hjälp av en stegmikrometer med en droppe mineralolja, justera injektionstiden och trycket på den pneumatiska injektorn för att uppnå en bolus av önskad storlek. En bolus med en diameter på 120 μm har en volym på 1 nL.
OBS: Den önskade volymen av bolus beror på koncentrationen av RNA och önskad dos per embryo. Om RNA till exempel alikvoteras vid 10 ng/μL, injicera 1 nL för att uppnå en slutlig mängd på 10 pg.- Håll RNA-nålspetsen nedsänkt i oljan tills den är klar att injiceras.
- Ladda embryona och injicera.
- Dra avdelarna i avelstankar, låt fisken leka i 10-15 min och samla embryona med en tesil.
- Ladda embryona i injektionsplattan med en Pasteur-pipett och pipettpump och använd sedan ett handskfinger för att trycka in äggen i tråget försiktigt.
- Injicera 10 pg ndr2 RNA i äggulan av encelliga embryon tills önskat antal embryon har nåtts eller tills embryon börjar dela sig.
OBS: Injicera inte efter encellssteget för att säkerställa jämn fördelning av RNA i hela embryot. - Tvätta embryona ur injektionsplattan i en märkt 100 mm x 15 mm Petriskål med en mild ström av äggvatten från en klämflaska.
OBS: Håll alltid en grupp åldersmatchade, oin injicerade syskon som kontroller. - Placera embryona i inkubatorn på 28,5 °C tills de når 128-cellsstadiet. Ta bort obefruktade ägg och döda embryon från skålen.
3 Dechorionate embryona
- När embryona har nått 128-cellsstadiet, placera dem i märkta petriskålar och dekantera så mycket äggvatten som möjligt från dem.
- Märk glaskristalliseringsfat med labbtejp (motsvarande små maträttsnamn) och fyll 2/3 av vägen med äggvatten. Placera dessa rätter bredvid dissekeringsmikroskopet för snabb tillgänglighet.
- Tillsätt 1 ml pronasebuljong (20 mg/ml, upptinad på is) till 15 ml 3x Danieaus lösning i ett koniskt rör på 50 ml.
OBS: Detta belopp är tillräckligt för upp till tre experimentella tillstånd. Öka volymen pronase och 3x Danieaus lösning för ytterligare explant villkor.
VARNING: Pronase är irriterande; använd därför handskar vid hantering. - Tillsätt minst 5 ml pronaslösning till varje petriskål i glas som innehåller embryon.
- Agitera glasfaten i en cirkulär rörelse och övervaka utvecklingen av dechorionation konsekvent under ett dissekerande mikroskop.
- När chorions börjar rynka och 1-2 embryon är ur sina chorions, doppa försiktigt glaset Petri skål som innehåller pronase och embryona i motsvarande glas kristallisering skål som innehåller äggvatten.
- Tvätta de dekonrionerade embryona.
- Tvätta embryona tre gånger med äggvatten genom att försiktigt tillsätta och sedan dekantera äggvatten från skålen.
- Den tredje och sista tvätten är med 0,3x Danieaus lösning.
OBS: Om embryona fortfarande har chorions efter tvätt, rör försiktigt embryona tills chorionsna tas bort eller låt dem sitta i tvätten (äggvatten eller 0,3x Danieaus lösning) i en minut eller två och försiktigt agitera med cirkulära rörelser.
- Täck dekonrionerade embryon med petriskållock och återför dem till inkubatorn (28,5 °C) tills de når 256-cellsstadiet.
4 Klipp explanter
- Fyll den agarosbelagda 60 mm x 15 mm Petri-skålen med 3x Danieaus lösning.
- När embryona är i 256-cellsstadiet, överför dem till den agarosebelagda plattan som innehåller 3x Danieaus lösning och rada upp dem längs mitten av skålen.
- Skär ut explanterna med tång(figur 1).
- Använd ett par tångar, som hålls stängda, för att stabilisera embryot och använda det andra för att skära igenom blastodermen på ungefär hälften av dess höjd (från marginal till djurstång) (figur 1A).
- För att skära, pressa försiktigt blastodermcellerna med ett par tång. Ta sedan de stabiliserande tångarna och kör dem längs de andra tångarna för att skära ungefär halvvägs över blastoderm (figur 1B).
- Rotera embryot, placera tångarna i det befintliga snittet och skär sedan den återstående blastoderm ortogonen till det första snittet (figur 1C).
- Håll explanter i 3x Danieaus lösning i minst 5 min för att läka, överför dem sedan till brunnen på en 6-välplatta belagd med agaros och fylld med 4 ml explantmedia.
OBS: Skär explanter från oinsprutade (eller kontrollinsprutade) syskon som negativa kontroller. Om explanter utförs korrekt, kommer dessa explanter varken att förlänga eller uttrycka markörer för endoderm, mesoderm eller neuroectoderm. - Placera explantodlingsplattorna i inkubatorn 28,5 °C tills önskad tidspunkt/stadium (bestämd från intakta syskon) har uppnåtts.
OBS: Vid behandling av explanter med en förening, såsom en liten molekylhämmare, kan önskad koncentration tillsättas direkt till explantmediet i brunnarna vid önskade tidpunkter. Kom ihåg att inkludera mängden agaros vid beräkning av koncentrationer. (Exempel: 1 ml agaros + 4 ml explantmedium = 5 ml total volym per brunn).
5 Förbered chimeriska explanter
- I stället för en vanlig agarosbelagd tallrik skär chimeriska explanter i en maträtt med agaros gjuten i tolv små, grunda brunnar med 1 mm glaspärlor (avsnitt 1.2.4). Fyll denna platta med 3x Danieaus lösning.
OBS: Chimeriska explanter genereras från blastodermceller från två embryon av olika genotyper eller tillstånd. Se till att dessa förhållanden kan särskiljas från varandra genom uttryck av transgena eller injicerade fluorescerande markörer.- Förbered genom att tillsätta tolv embryon av en genotyp/tillstånd på vänster sida av plattan och tolv embryon av den andra genotypen/tillståndet på höger sida av plattan.
- Flytta ett embryo av varje tillstånd till mitten av plattan, nära en av de 12 brunnarna.
- Skär med tång från varje embryo enligt beskrivningen för explanter med ett embryo (steg 4.3).
- Tryck snabbt ihop de skurna kanterna på de två explanterna i den grunda brunnen med hjälp av tång så att de två halvorna kan läka ihop till en enda explant.
- Fortsätt med de återstående elva brunnarna i plattan. När explanter har läkt, överför dem till brunnen på en 6-brunnsplatta belagd med agaros och fylld med 4 ml explantmedia. Upprepa tills önskat antal explanter har uppnåtts.
6 Kultur och/eller avbilda de fasta explanterna
- Odla explanter i inkubatorn 28,5 °C tills intakta syskonembryon når önskat stadium.
- Levande explanter kan monteras för kontinuerlig tidsfördröjning, avbildas regelbundet under hela kulturperioden eller avbildas live vid den experimentella slutpunkten.
- Fixa explanterna om så önskas. När explanterna når önskad endpoint, notera stadiet av intakta embryo syskon och placera explanterna i en glas scintillation injektionsflaska med 1 ml 4% paraformaldehyd i PBS. Fixera över natten på en shaker vid 4 °C.
VARNING: Paraformaldehyd är giftigt. Använd handskar vid hantering av denna kemikalie och kassera den via metoder som godkänts av varje institution.- Skölj explanterna sex gånger, 15 min vardera med PBS + 0,1% Tween-20 och dehydrera gradvis till metanol. Förvara explanter vid -20 °C för senare analys av hela berget in situ hybridisering, immunofluorescent färgning, etc.
Representative Results
Nodal ligands driver bakterieskiktsbildning och C&E av zebrafisk blastoderm explants
Kontrollexplanter som skurits från oinsprutade embryon av vildtyp (WT) eller embryon som injicerats med 50 pg mRNA-kodning av grönt fluorescerande protein (GFP) förblev rundade under hela kulturperioden(figur 2A-C) och underlät att uttrycka markörer för mesoderm, endoder eller neuroectoderm(figur 3C)20. Tillsammans indikerar dessa en frånvaro av morfogenes och könscellsbildning som kännetecknar ryggradsdjur gastrulation. Explanter som skurits från embryon injicerade med 10 pg ndr2 mRNA blev dock mycket långsträckta efter 8-9 h i kultur (figur 2D). Levande tidsfördröjning av dessa explanter genom differentiell störande kontrastmikroskopi (DIC) visade att förlängningen insjuknar vid eller cirka 8 h efter befruktning (hpf) (figur 2F), samma tid som C&E morphogenesis börjar i intakta zebrafiskembryon22. Explanter som skurits från MZoep-/- embryon, som saknar den väsentliga tdgf1 Nodal co-receptor23, misslyckades med att förlänga som svar på ndr2 injektion (figur 2E), visar att Nodal verksamhet är avgörande för denna ex vivo morfogenes. Dessutom visade helmonterad in situ-hybridisering ytterligare att ndr2-expressing explants uttrycker markörer för neuroectoderm (sox2) och flera mesoderm-undertyper (tbxta, noto, tbx16) (figur 2G), samt endoderm och den embryonala organisatören20.
Nodal signalering krävs inte för neuroectoderm induktion av mesoderm
Nodal signaleringsaktivitet är nödvändig för induktion av endoderm och mest mesoderm men är dispenserbar för neuroectoderm specifikation inom zebrafisk gastrulae23,24. Medan oinsprutade zebrafisk blastoderm explants inte differentierade i neuroectoderm (figur 3C18), explanter från embryon injiceras med 10 pg ndr2 uppvisade robust uttryck av neuroectoderm markör sox2 i distinkta ränder längs explantens långa axel (figur 2G), vilket indikerar att Nodal aktivitet krävs för neuroectoderm bildandet ex vivo. Det har länge varit känt att mesodermala vävnader kan inducera neural vävnad25,26,27,28,29, inklusive i zebrafisk blastoderm explants17. Det är dock oklart om neuroectoderm bildandet i detta explant system kräver Nodal signalering direkt eller om exogena Nodal ligands inducera mesoderm som sedan inducerar neurala vävnader i andra hand.
Chimeriska explanter som innehåller prospektiv mesoderm och neuroectoderm portioner från två olika embryon genererades för att testa om Nodal signalering krävs vävnad-autonomt för neuroectoderm specifikation ex vivo. Mesodermdelen av varje explant skars från ett annars WT-embryo som uttrycker en mesodermspecifik transgen GFP-reporter, Tg[lhx1a:eGFP]30, injicerad med en hög dos (100 pg) ndr2 (figur 3A). Den förmodade neuroectoderm delen av varje explant skurits från antingen en kontroll WT embryo eller Nodal signalerar bristfällig MZoep-/- embryo injiceras endast med mRNA kodning fluorescerande kärnämne H2B-RFP (figur 3A). Varje chimeric explant genererades genom att kombinera en blastoderm från var och en av dessa två villkor, som analyserats för uttryck av vävnad-specifika markörer genom hela montering in situ hybridisering vid 12 hpf.
Majoriteten av explanter med ett embryo från embryon som injicerats med 100 pg ndr2 uttryckte lite eller ingen sox2, och uttryckte markörer för mesoderm, inklusive mbitta och lhx1a:gfp reporter-i hela explanten (figur 3B,G). Oinsprutad WT blastoderm (av den typ som består av den prospektiva neuroectoderm delen av chimeric explants) uttryckte varken mesoderm markörer eller sox2 när de odlas som en enda explant, vilket indikerar en brist på neuroectoderm och mesoderm specifikation(figur 3C,H). Explanter med ett embryo från MZoep-/- embryon saknade på samma sätt uttryck för både neuroectoderm och mesoderm markörer, även när de injiceras med ndr2 (figur 3D). Men när oinsprutade WT blastoderms kombinerades med mesoderm inducerad av höga doser av Nodal ligands, dessa chimeric explants uttryckte både mesoderm markörer och sox2 robust(figur 3E, I). Dessa resultat visar att, som tidigare observerats17,26,27,29, mesoderm kan inducera neuralt öde i celler som annars skulle bli icke-neurala ektoderm. För att testa om Nodal-signalering krävs direkt inom den prospektiva neuroectoderm delen av dessa explanter för deras neurala induktion, skapades chimeric explants från WT blastoderms injiceras med 100 pg ndr2 och blastoderms från MZoep-/- embryon (figur 3J). Trots deras oförmåga att ta emot Nodal-signaler från den närliggande mesodermala delen, uttryckte dessa explanter sox2 i liknande grad som WT-kontroll chimeras (figur 3F). Detta resultat visar att överensstämmelse med intakta embryon där neurala vävnader specificeras i avsaknad av Nodal aktivitet, Nodal signalering krävs inte vävnad-autonomt för neuroectoderm induktion ex vivo.
Figur 1: Förfarande för explantering av zebrafisk blastoderm (steg 4.3). (A) Håll tången i den icke-dominerande handen (orange) stängd mot äggulan för att stabilisera embryot medan du klämmer blastodermen vid ungefär 1/2 av dess höjd med tången i den dominerande handen (blå). (B) Kör de orange tångarna längs kanten av de blå tångarna som greppar embryot för att skära genom blastodermen så att det första snittet når ungefär halvvägs över blastodermen. (C) Rotera embryot 90°, placera sedan de blå tångarna inuti (men ortogonala till) det ursprungliga snittet och nyp för att skära av den återstående blastodermen. (D) Låt explanterade blastodermceller läka i 3x Danieaus lösning i cirka 5 min innan de överförs till explantmedia. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2 (ändrad från20):Nodalligander främjar C&E-morfogenes och bildning av könsceller i zebrafisk blastoderm explanter. (A) Diagram över injektion och explantation av zebrafiskembryon. (B-E) Representativa ljusfältsbilder av levande blastoderm explanter av de angivna förhållandena/genotyperna vid motsvarande 2-4 somitstadiet. N = antal explanter från två till fyra oberoende försök. F)DIC-serien för tidsfördröjning av en representativ explant från ett WT-embryo injicerat med 10 pg ndr2 RNA. g) Representativa bilder av hela berget in situ hybridisering för transkriptioner anges i explanter från WT embryon injiceras med 10 pg ndr2 RNA. Skalstänger är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 (Ändrad från31):Chimeriska explanter visar att specifikationen av neuroectoderm inte kräver vävnadsotonoma Nodal-signalering ex vivo. (A) Diagram över förfarandet för att generera chimeriska zebrafiskexplanter. (B-F) Helmonterad in situ-hybridisering för mesodermmarkören tbxta (överst) och neuroectodermmarkör sox2 (botten) i explanter från WT-embryon injicerade med 100 pg ndr2 RNA (B), ointillverkade WT-kontroller (C), MZoep-/- injicerademed 10 pg ndr2 (D), och chimeriska explanter som innehåller neuroectoderm portioner från WT (E) ) embryon i motsvarande 2-4 somitstadiet. Fraktioner anger antalet explanter med fenotypen som visas över det totala antalet undersökta explanter. (G-J) Representativa bilder av levande Tg[lhx1a:gfp] explanter från ett enda embryo (G-H) eller i kombination med H2B-uttryck blastodermer (I-J, magenta) av de förhållanden som anges i motsvarigheten till 2-4 somite-scenen. N = antal explanter från tre oberoende försök. Skalstänger är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning 1 | Lösning 2 | Lösning 3 | Lösning 4 | |
| Lösning | 3x Danieaus | Äggvatten | Explant Media | 0.3x Danieaus |
| Ingredienser | 174 mM NaCl | 60 μg/ml havssalter | DMEM/F12 + 2,5 mM L-glutamin och 15 mM HEPES | 17,4 mM NaCl |
| 2.1 mM KCl | 1 L destillerat vatten | 3% total volym av nyfödda kalvserum eller fetalt bovinserum | 0.21 mM KCl | |
| 1,2 mM MgSO4. 7H2O | 1:200 Penicillin (50 enheter/ml)-Streptomycin (50 μg/ml) | 0,12 mM MgSO4•7H2O | ||
| 1,8 mM Ca(NO3)2 •4H2O | 0,18 mM Ca(NO3)2 •4H2O | |||
| 15 mM HEPES | Exempel: | 1,5 m M HEPES | ||
| Destillerat vatten | 4 ml/tillstånd x 9 Villkor = 36 ml | Destillerat vatten | ||
| 1,08 ml nyfött kalvserum (NCS, alikvoterat i -20 °C (3%) | ||||
| 0,18 ml 200x pen-strep (PS, alikvoterad i -20 °C) (1:200) | ||||
| 35 ml DMEM/F12 |
Tabell 1.
Discussion
Denna artikel har beskrivit hur man genererar zebrafish blastoderm explants och diskuterat två praktiska tillämpningar av dessa explants i att ta itu med rollen av Nodal morphogen signalering i gastrulation. Denna metod för skärning och odling av explanter ger en tom skiffer av naiva celler som kan manipuleras med hjälp av RNA-injektioner och behandling med små molekylföreningar för att undersöka en molekylär väg av intresse.
Kritiska steg
Det finns fyra steg i detta protokoll som är särskilt avgörande för dess framgång. Den första är att injicera embryona med lämplig mängd Nodal. Detta protokoll rekommenderar 10 pg ndr2 RNA, och även om en rad doser främjar förlängning, för mycket eller för lite Nodal kommer att förhindra optimal explant förlängning20. Det andra steget är att dechorionera embryona. Om embryona förblir pronase för länge, kommer äggulorna att brista, och embryona kommer inte att vara livskraftiga att skära. Om de inte är i pronase tillräckligt länge, kommer chorionsna inte att lossas genom tvätt och kommer istället att kräva tidskrävande manuell dechorionation. Det tredje kritiska steget är att skära explanterna. Skärning i 3x Danieaus lösning rekommenderas, eftersom den lägre salthalten i 0,3x Danieaus lösning eller äggvatten inte främjar läkning och överlevnad av explanter.
Dessutom måste explanterna skäras på ungefär hälften av blastodermens höjd för att säkerställa cellernas naivitet. Om de skärs för nära äggulan kommer de att innehålla signaler från marginalen (inklusive endogen Nodal) som främjar vävnadsspecifikation och morfogenes. Det fjärde och sista kritiska steget är i läkning av chimeriska explanter. Två explanter smälter inte ihop för att bilda chimeras om inte deras skurna kanter försiktigt pressas ihop omedelbart efter att de har skurits.
Ändringar och felsökning
De kritiska stegen som beskrivs ovan ger möjligheter till felsökning. Några vanliga frågor och föreslagna lösningar presenteras nedan.
Om explanter inte sträcker sig i närvaro av Nodal-signalering finns det några möjliga lösningar. (A) Injicera embryon i encellsstadiet för att säkerställa att RNA är jämnt fördelat över hela embryot. (B) Undvik att injicera för mycket nodala RNA genom att se till att den injicerade volymen är korrekt med hjälp av en mikrometer för att mäta injektionsbolus. (C) Undvik att injicera för lite nodd-RNA genom att mäta dess koncentration för att säkerställa att det inte har försämrats. (D) Håll några åldersmatchade intakta syskon för att härleda motsvarande steg av explanterna. Explanter uppnår maximal förlängning när intakta syskon når 2-5 somite-stadiet. Om explanterna samlas in för tidigt, kommer den optimala förlängningen inte att uppnås.
Om äggulorna spricker efter dechorionation, och embryona inte är livskraftiga att skära, ta bort embryona från pronaselösning när chorions börjar crinkle och 1-2 embryon kasta sin chorion. Skölj sedan omedelbart i äggvatten.
Om explanterna verkar bubblande runt kanterna finns det några lösningar. A) Kapa explanter endast inom en viss tidsram för utvecklingen. Även om explanter som skärs i något skede från 128- till 1000-cellsstadier kan överleva och sträcka sig i kultur, tenderar de som skärs vid 256- till 512-cellsstadier att vara de mest robusta. (B) Se till att explanter skärs i 3x Danieaus lösning för att säkerställa korrekt läkning. C) Skär explanterna rent men försiktigt. Undvik att sträcka eller dra isär cellerna under skärprocessen.
Om de oinsprutade kontrollexplanterna sträcker sig, var det troligt att explanter ska skära för nära äggulan. För att explanter ska vara naiva, se till att snitten görs halvvägs mellan äggulan och toppen av blastoderm.
Om de chimeriska explanterna inte smälter, beror det sannolikt på att tendensen hos explanter i 3x Danieaus lösning när den skärs är att runda upp och läka över skärkanten. För att säkerställa att de två blastodermsna läker till varandra snarare än sig själva, tryck ihop dem omedelbart efter skärning. Använd tång för att applicera mjukt tryck på de nyanslutna blastodermsna i agarosbrunn för att uppmuntra dem att läka tillsammans.
Begränsningar
Medan dessa explanter är ett värdefullt verktyg för att studera rollen av en given morfon (eller en annan molekyl av intresse) i relativ isolering, måste observationer som görs i någon ex vivo-modell tolkas med försiktighet. Explanter uppvisar C&E-morfogenes som är mycket lik den som observerats i vivo20, men de sammanfattar inte alla aspekter av gastrulation, till exempel epibolyrörelser. De saknar också många andra regulatoriska faktorer och signalmolekyler som finns i ett intakt embryo. Även om detta är en betydande experimentell fördel med explanter, kan det också leda till slutsatser som inte håller in vivo. Till exempel, eftersom explanter som inte får exogena Nodal ligands misslyckas med att uttrycka neuroectoderm markörer, man kan dra slutsatsen från explanter ensam att Nodal signalering krävs för neuroectoderm specifikation. Neuroectoderm bildas dock inom intakta embryon som saknar alla Nodal-signalering23,24, vilket visar den vitala rollen för andra signalmolekyler i neuralspecifikation32. Explanter kan berätta för oss vad en morfogener kan i en isolerad miljö. Alla sådana fynd bör dock bekräftas i/jämföras med intakta embryon för att resultaten ska tolkas grundligt. Med andra ord kan explanter inte ersätta ett embryo som utvecklas. Istället är de ett kompletterande verktyg för att identifiera en morfins roll och relation till omgivningen. Med dessa begränsningar i åtanke är zebrafisk blastoderm explanter ett värdefullt verktyg för många forskningsfrågor.
Betydelse för befintliga metoder
Med förnyat intresse för syntetisk embryologi används regelbundet flera ex vivo- och in vitro-metoder för att modellera aspekter av embryonal utveckling. Till exempel kan 2- och 3-dimensionella gastruloider bestående av mus eller mänskliga embryonala / inducerade pluripotenta stamceller koaxeras, genom tillämpning av exogena signalmolekyler, för att rekapitulera några av de mönstrar och/eller morfogenetiska händelserna av gastrulation, segmentering och neurulation33,34,35,36,37 . Även om dessa metoder är kraftfulla kräver de mödosamma och långvariga odlingsmetoder för att både kontinuerligt upprätthålla pluripotenta stamceller och för att odla gastruloider, vilket tar många dagar att nå gastrulationsstadier. Däremot kräver zebrafiskexplanter inget underhåll av stamcellskulturer, eftersom embryon helt enkelt samlas in efter behov. De är relativt enkla att generera och nå gastrulationsstadier inom några timmar, samma som zebrafiskembryon. Detta belyser en annan fördel med zebrafiskexplanter, deras intakta utvecklingsklocka. Eftersom utvecklingsåldern för embryonala och inducerade pluripotenta stamceller kan vara varierande och mycket omdiskuterade, är embryonala explanter kanske bättre lämpade att undersöka tidsmässig reglering av utvecklingen. Slutligen, medan pescoid zebrafish explants (som innehåller den embryonala marginalen) på samma sätt sträcker sig i kultur12,13, gör de det som svar på endogena signalcentra. Istället gör de explanter som beskrivs här det möjligt för forskare att undersöka molekyler av intresse med relativt liten interferens från sådana embryonala signaler.
Potentiella framtida tillämpningar
Här användes explanter för att visa att Nodal signalering är nödvändig och tillräcklig för C&E morfogenes. Ändå förväntas det att de kan och kommer att användas för att urskilja rollen av många olika molekyler i många andra utvecklingsprocesser, till exempel reglering av genuttryck, signalgradienter och ytterligare morfogenetiska program. Dessutom, eftersom dessa explanter är livskraftiga till minst 24 hpf19, kan det förväntas att deras användbarhet kommer att sträcka sig bortom gastrulation till processer som segmentering och organogenes, alla processer där forskare önskar en utvecklingslös tom skiffer.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NICHD R00HD091386 till MLKW och av NIEHS T32ES027801 till AAE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
| 6-well plates | Fisher | FB012927 | |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
| Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
| DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
| Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
| Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
| Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
| HEPES | VWR | JT4018-1 | |
| Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| KCl | VWR | BDH9258-500G | |
| Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
| MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
| Mineral oil | VWR | MK635704 | |
| NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
| Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
| Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
| Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
| Tween-20 | VWR | 200002-836 |
References
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71 (5), 731-739 (1992).
- Sudarwati, S., Nieuwkoop, P. D. Mesoderm formation in the anuranXenopus laevis (Daudin). Wilhelm Roux Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (3), 189-204 (1971).
- Gurdon, J. B., Fairman, S., Mohun, T. J., Brennan, S. Activation of muscle-specific actin genes in Xenopus development by an induction between animal and vegetal cells of a blastula. Cell. 41 (3), 913-922 (1985).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ariizumi, T., et al. Isolation and differentiation of Xenopus animal cap cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1 Unit 1D.5 (2009).
- Asashima, M., Grunz, H. Effects of inducers on inner and outer gastrula ectoderm layers of Xenopus laevis. Differentiation. 23 (3), 206-212 (1983).
- Jones, E. A., Woodland, H. R. Development of the ectoderm in Xenopus: tissue specification and the role of cell association and division. Cell. 44 (2), 345-355 (1986).
- Keller, R. E. Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis. I. Prospective areas and morphogenetic movements of the superficial layer. Developmental Biology. 42 (2), 222-241 (1975).
- Sokol, S., Wong, G. G., Melton, D. A. A mouse macrophage factor induces head structures and organizes a body axis in Xenopus. Science. 249 (4968), 561-564 (1990).
- Thomsen, G., et al. Activins are expressed early in Xenopus embryogenesis and can induce axial mesoderm and anterior structures. Cell. 63 (3), 485-493 (1990).
- Howard, J. E., Smith, J. C. Analysis of gastrulation: different types of gastrulation movement are induced by different mesoderm-inducing factors in Xenopus laevis. Mechanisms of Development. 43 (1), 37-48 (1993).
- Fulton, T., et al. Axis specification in Zebrafish is robust to cell mixing and reveals a regulation of pattern formation by morphogenesis. Current Biology. 30 (15), 3063-3064 (2020).
- Schauer, A., Pinheiro, D., Hauschild, R., Heisenberg, C. -P. Zebrafish embryonic explants undergo genetically encoded self-assembly. eLife. , 55190 (2020).
- Oppenheimer, J. M. The development of isolated blastoderms of Fundulus heteroclitus. The Journal of Experimental Zoology. 72 (2), 247-269 (1936).
- Trinkaus, J. P., Drake, J. W. Exogenous control of morphogenesis in isolated Fundulus blastoderms by nutrient chemical factors. The Journal of Experimental Zoology. 132 (2), 311-347 (1956).
- Grinblat, Y., Lane, M. E., Sagerström, C., Sive, H. Analysis of zebrafish development using explant culture assays. Methods in Cell Biology. 59, 127-156 (1999).
- Sagerström, C. G., Grinblat, Y., Sive, H. Anteroposterior patterning in the zebrafish, Danio rerio: an explant assay reveals inductive and suppressive cell interactions. Development. 122 (6), 1873-1883 (1996).
- Sagerström, C. G., Gammill, L. S., Veale, R., Sive, H. Specification of the enveloping layer and lack of autoneuralization in zebrafish embryonic explants. Devolopmental Dynamics. 232 (1), 85-97 (2005).
- Xu, P. F., Houssin, N., Ferri-Lagneau, K. F., Thisse, B., Thisse, C. Construction of a vertebrate embryo from two opposing morphogen gradients. Science. 344 (6179), 87-89 (2014).
- Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. Nodal and planar cell polarity signaling cooperate to regulate zebrafish convergence and extension gastrulation movements. eLife. 9, (2020).
- de Olivera-Melo, M., Xu, P. F., Houssin, N., Thisse, B., Thisse, C. Generation of ectopic morphogen gradients in the Zebrafish blastula. Methods in Molecular Biology. 1863, 125-141 (2018).
- Sepich, D. S., Calmelet, C., Kiskowski, M., Solnica-Krezel, L. Initiation of convergence and extension movements of lateral mesoderm during zebrafish gastrulation. Devolopmental Dynamics. 234 (2), 279-292 (2005).
- Gritsman, K., et al. The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodal signaling. Cell. 97 (1), 121-132 (1999).
- Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
- Spemann, H., Manngold, H. Uber inducktion von embryoalanlangen durch implantation artfremder organisatoren. Archiv für mikroskopische Anatomie und Entwicklungsmechanik. 100, 599-638 (1924).
- Mangold, O. Über die Induktionsfähigkeit der verschiedenen Bezirke der Neurula von Urodelen. Naturwissenschaften. 21 (43), 761-766 (1933).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Agathon, A., Thisse, C., Thisse, B. The molecular nature of the zebrafish tail organizer. Nature. 424 (6947), 448-452 (2003).
- Tacke, L., Grunz, H. Close juxtaposition between inducing chordamesoderm and reacting neuroectoderm is a prerequisite for neural induction in Xenopus laevis. Cell Death and Differentiation. 24 (1), 33-43 (1988).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. The International Journal of Developmental Biology. 54 (4), 731-736 (2010).
- Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. A mesoderm-independent role for Nodal signaling in convergence & extension gastrulation movements. BioRxiv. , (2019).
- Londin, E. R., Niemiec, J., Sirotkin, H. I. Chordin, FGF signaling, and mesodermal factors cooperate in zebrafish neural induction. Developmental Biology. 279 (1), 1-19 (2005).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Veenvliet, J. V., et al. Mouse embryonic stem cells self-organize into trunk-like structures with neural tube and somites. Science. 370 (6522), (2020).
- Beccari, L., et al. Multi-axial self-organization properties of mouse embryonic stem cells into gastruloids. Nature. 562 (7726), 272-276 (2018).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582 (7812), 410-415 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomics reveal somitogenesis in gastruloids. Nature. 582 (7812), 405-409 (2020).
