Summary
광학적으로 활성화 된 퍼플 루오로 카본 나노 방울은 혈관 시스템 외부의 이미징 응용 분야에서 가능성을 보여줍니다. 이 기사에서는 이러한 입자를 합성하고, 폴리아크릴아미드 팬텀을 가교결합하고, 액적을 음향적으로 변조하여 신호를 향상시키는 방법을 보여줍니다.
Abstract
마이크로 버블은 초음파에서 가장 일반적으로 사용되는 영상 조영제입니다. 그러나 크기 때문에 혈관 구획으로 제한됩니다. 이러한 마이크로버블은 혈관을 유출할 수 있을 만큼 충분히 작은 과불화탄소 나노방울(PFCnD)로 응축되거나 공식화될 수 있으며 표적 부위에서 음향적으로 촉발될 수 있습니다. 이들 나노입자는 근적외선 유기 염료 또는 나노입자(예를 들어, 황화구리 나노입자 또는 금 나노입자/나노로드)와 같은 광흡수제를 포함함으로써 더욱 향상될 수 있다. 광학적으로 태그가 지정된 PFCnD는 광학 액적 기화(ODV)로 알려진 공정에서 레이저 조사를 통해 기화될 수 있습니다. 이 활성화 과정은 진단 이미징을 위한 최대 기계적 지수 임계값 미만에서 음향적으로 기화될 수 없는 고비점 퍼플루오로카본 코어의 사용을 가능하게 합니다. 끓는점 코어가 높을수록 기화 후 재응축되는 액적이 생성되어 기화 후 나노액적 형태로 다시 응축되기 전에 잠시 대비를 생성하는 "깜박임" PFCnD가 생성됩니다. 이 프로세스를 반복하여 필요에 따라 대비를 생성할 수 있으므로 광학 및 음향 변조를 통해 배경 없는 이미징, 멀티플렉싱, 초고해상도 및 대비 향상이 가능합니다. 이 기사에서는 프로브 초음파 처리를 사용하여 광학적으로 트리거 가능한 지질 쉘 PFCnD를 합성하고, 나노 방울을 특성화하기 위해 폴리 아크릴아미드 팬텀을 만들고, ODV 후 PFCnD를 음향 조절하여 대비를 개선하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
Microbubbles는 연조직에 비해 생체 적합성과 우수한 에코 발생성으로 인해 가장 유비쿼터스 초음파 조영제입니다. 이것은 혈류, 장기 묘사 및기타 응용 프로그램을 시각화하는 데 유용한 도구가 됩니다1. 그러나 공진 주파수를 기반으로 한 이미징에 탁월한 크기 (1-10 μm)는 적용을 혈관 구조2로 제한합니다.
이러한 한계로 인해 액체 퍼플루오로카본 코어 주위에 둘러싸인 계면활성제로 구성된 나노 에멀젼인 PFCnD가 개발되었습니다. 이 나노 입자는 200nm만큼 작은 크기로 합성 될 수 있으며 종양 혈관계에서 발견되는 "누출 된"혈관 구조 또는 기공 및 열린 fenestrations를 활용하도록 설계되었습니다. 이러한 파괴는 종양 의존적이지만,이 투과성은 종양에 따라 ~ 200 nm - 1.2 μm의 나노 입자의 혈관 외 유출을 허용합니다 3,4. 초기 형태에서 이러한 입자는 초음파 대비를 거의 또는 전혀 생성하지 않습니다. 음향 또는 광학적으로 유도 된 기화시 코어 상이 액체에서 기체로 바뀌어 직경 5,6,7이 2 배 반에서5 배 증가하고 광 음향 및 초음파 대비가 생성됩니다. 음향 기화가 가장 일반적인 활성화 방법이지만 이 접근 방식은 기화의 이미징을 제한하는 음향 아티팩트를 생성합니다. 또한 대부분의 퍼플루오로카본은 기화하기 위해 안전 임계값을 초과하는 기계적 지수를 가진 집중 초음파가필요합니다8. 이로 인해 저비점 PFCnD가 개발되었으며, 이는 마이크로 버블을 나노 방울9로 응축하여 합성 할 수 있습니다. 그러나, 이들 액적은 더 휘발성이고 자발적인 기화(10)를 받는다.
반면에 광학 액적 기화 (ODV)는 나노 입자 11,12,13 또는 염료 6,14,15와 같은 광학 트리거를 추가해야하며 ANSI 안전 한계 (11) 내의 플루언스를 사용하여 더 높은 끓는점 퍼플 루오로 카본을 기화 할 수 있습니다. 더 높은 끓는점 코어로 합성된 PFCnD는 더 안정적이고 기화 후 재응축되어 배경 없는 이미징16, 멀티플렉싱(17) 및 초고해상도(18)가 가능합니다. 이러한 기술의 주요 한계 중 하나는 높은 끓는점 PFCnD가 기화 후 밀리 초19의 규모로 짧은 시간 동안 만 에코 생성되고 상대적으로 희미하다는 사실입니다. 이 문제는 반복적인 기화 및 평균화를 통해 완화할 수 있지만 액적 신호의 검출 및 분리는 여전히 과제로 남아 있습니다.
펄스 반전으로부터 영감을 얻어서, 지속 시간 및 대비는 초음파 이미징 펄스(19)의 위상을 수정함으로써 향상될 수 있다. 희박한 단계 (n- 펄스)로 초음파 이미징 펄스를 시작하면 기화 된 PFCnD의 지속 시간과 대비가 모두 증가합니다. 대조적으로, 압축 위상 (p- 펄스)으로 초음파 영상 펄스를 시작하면 대비가 감소하고 지속 시간이 단축됩니다. 이 기사에서는 광학적으로 트리거 가능한 퍼플루오로카본 나노방울, 이미징에 일반적으로 사용되는 폴리아크릴아미드 팬텀을 합성하고 음향 변조를 통해 대비 향상 및 향상된 신호 수명을 입증하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
1. 퍼플루오로카본 나노방울 제형
- 10mL 둥근바닥 플라스크를 클로로포름으로 헹구고 10μL 및 1mL 밀폐 유리 주사기를 클로로포름으로 씻어내고 전체 주사기 부피를 반복적으로 흡인하여 총 3회 배출합니다.
주의 : 클로로포름은 휘발성이며 흡입하면 유독 할 수 있습니다. 이 용매를 사용한 모든 작업은 흄 후드에서 수행해야합니다. - 주사기를 사용하여 200μL의 DSPE-mPEG2000(25mg/mL), 6.3μL의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC, 25mg/mL) 및 1mL의 IR 1048(클로로포름에서 1mg/mL)을 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다. 스톡의 오염을 방지하기 위해 지질/염료 사이의 주사기를 청소하는 것을 잊지 마십시오.
알림: 적외선 염료는 빛에 민감하며 작업은 어두운 조건에서 수행하거나 플라스크를 알루미늄 호일로 덮어야합니다. - 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거합니다. 범핑을 방지하기 위해 진공을 332mbar로 천천히 조정하십시오. 5분 후 압력을 42mbar로 낮추어 용액에 들어갔을 수 있는 물을 제거합니다.
참고: 지질 케이크는 4°C에서 파라필름으로 덮인 둥근 바닥 플라스크에 밤새 보관할 수 있습니다. - 지질 케이크를 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 현탁시키고 실온에서 5분 동안 또는 모든 지질 케이크가 현탁되고 용액에 용해될 때까지 초음파 처리 또는 와동합니다. 용액을 균질화하기 위해 추가 2분 동안 초음파 처리하십시오.
- 용액을 7mL 유리 바이알에 옮기고 바이알을 얼음으로 채워진 유리 접시에 넣어 용액을 5분 동안 식힌 후 기밀 유리 주사기를 사용하여 50μL의 퍼플루오로헥산을 추가합니다. 주사기를 바이알에 분주하기 전에 퍼플루오로헥산으로 헹구는 것을 잊지 마십시오.
- 지질과 얼음 배스가 들어있는 유리 바이알을 프로브 초음파 처리기 인클로저에 넣고 프로브 팁을 미니 커스 아래에 담그십시오. 초음파 처리기 프로브의 측면이 유리 바이알의 입술에 닿지 않는지 확인하십시오.
- 프로브는 다음 설정으로 혼합물을 초음파 처리합니다 : 진폭 1, 공정 시간 : 20 초, 펄스 온 : 1 초, 펄스 오프 : 5 초. 그런 다음 다음 설정에서 초음파 처리: 진폭: 50, 프로세스 시간: 5초, 펄스 켜짐: 1초, 펄스 오프: 10초.
- 나노 액적 용액을 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 작은 액적에서 큰 액적(>1μm)을 분리합니다.
- 펠릿을 버리고 상청액을 다른 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 세척하고 용액의 모든 액적을 펠릿화합니다. 펠릿을 위아래로 피펫팅하여 PBS 1mL에 PFCnD를 재현탁한 다음 목욕 초음파 처리기에서 1분 동안 초음파 처리합니다.
- 동적 광산란(DLS)을 사용하여 액적의 크기를 측정합니다. 스톡 PFCnD를 100배(PBS 990μL에 PFCnD 스톡 10μL)로 희석하고 측정하기 전에 PFCnD를 분산시키기 위해 배스 초음파 처리합니다. 대표적인 결과를 도 1에 나타내었다.
- 나노 입자 추적 분석기를 사용하여 PFCnD의 농도를 결정합니다 ( 재료 표 참조). 농도의 정확한 측정을 보장하기 위해 PFCnD를 100-1000배 희석합니다. 프로토콜은 일반적으로 1010 입자 / mL 정도의 농도로 액적을 생성합니다.
- 50mL 원심 분리 튜브에 10mL의 초음파 커플 링 젤을 준비하고 1 % (v / v) 또는 100μL의 PFCnD를 추가하여 ~ 108 입자 / mL의 용액을 만듭니다. 혼합 할 용액을 소용돌이. 혼합물을 4000 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 기포를 제거합니다.
2. 폴리아크릴아미드 팬텀 준비
- 500mL 진공 플라스크에 400mL의 탈이온수를 채워 물을 탈가스시키고, 고무 코르크로 밀봉하고, 플라스크를 진공 라인에 연결한다. 진공 라인을 열고 플라스크의 바닥을 욕조 초음파 처리기에 담그십시오. 5 분 동안 또는 가스 거품 형성이 보이지 않을 때까지 초음파 처리하십시오.
- 탈기 된 물 500mL에 500mg을 용해시켜 10 % 과황산 암모늄 (APS) 용액을 준비합니다. 과황산 암모늄이 완전히 녹지 않으면 용액을 부드럽게 소용돌이 치십시오.
- 교반 플레이트에 교반 막대가 있는 400mL 비커에 탈기수 150mL와 40%(w/v) 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액 50mL를 추가하여 10% 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액 200mL를 형성합니다. 기포를 도입하지 않고 적절한 혼합을 허용하도록 혼합물을 200rpm으로 저어줍니다.
주의 : 아크릴 아마이드는 발암 물질이며, 특히 분말 형태의 아크릴 아마이드로 작업하는 경우 모든 작업은 장갑이 달린 흄 후드에서 수행해야합니다. - 실리카 400mg을 칭량하여 2.3단계의 10% 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액에 첨가하여 0.2%(w/v)의 실리카 및 아크릴아미드 용액을 형성합니다.
주의 : 흡입시 실리카는 발암 물질이 될 수 있습니다. 계량을 포함한 모든 작업은 흄 후드에서 수행해야 합니다. - 플라스틱 이송 피펫에서 팁을 잘라 실험실 테이프로 금형에 지지하여 원통형 포함물이 있는 58mm x 58mm x 78mm 정사각형 금형을 준비합니다. 그림 2를 참조합니다.
- 비커에 10% APS 용액 2mL를 추가하여 최종 농도 0.1% APS가 되도록 하고 팬텀 용액에 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 250μL를 추가합니다. 용액을 짧게 저어줍니다(1분 미만).
- 용액에 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 용액을 몰드에 빠르게 붓습니다. 용액은 10 분 이내에 중합되어야합니다. 실험실 주걱의 평평한 끝을 금형 가장자리에 돌리고 금형을 뒤집어 팬텀을 제거합니다.
알림: 이 팬텀은 여러 번 재사용할 수 있으므로 물에 담그고 4°C에서 보관해야 합니다.
3. 퍼플루오로카본 나노방울 이미징
- 제조업체 지침에 따라 펄스 레이저 시스템을 켜고 ~20분 동안 예열합니다. 광섬유 번들이 레이저 출력에 제대로 연결되어 있고 두 다리가 광섬유 번들 홀더 내에 올바르게 배치되었는지 확인하십시오.
- 초음파 이미징 시스템을 켜고 어레이 이미징 변환기(L11-4v)를 시스템에 연결하고 홀더 내부에 변환기를 고정하여 이미징 평면을 레이저 단면에 맞춥니다.
- 레이저 시스템의 펄스 반복 주파수를 10Hz로 설정하고 광섬유 다발 끝에 파워미터를 배치하여 에너지를 측정합니다. 추정된 플루언스가 70mJ/cm2가 될 때까지 q-스위치 지연을 조정합니다.
주의 : 레이저를 발사 할 때는 적절한 안경을 착용해야하며 레이저 커튼은 공간을 둘러 쌉니다. - 1mL 플라스틱 슬립 팁 주사기를 사용하여 폴리아크릴아미드 팬텀의 채널 중 하나를 초음파 젤/PFCnD 혼합물로 채우십시오. 채널 상단을 초음파 젤로 자유롭게 덮고 1mL 플라스틱 슬립 팁 주사기로 기포를 제거합니다. 그림 3과 같이 폴리아크릴아미드 팬텀을 변환기와 섬유 다발 아래에 놓습니다.
- 소프트웨어(20 )에 기초한 결합된 레이저 초음파 및 탄성(CLUE) 이미징 플랫폼을 사용하여 광학 활성화와 동기화된 PFCnD를 이미징한다. 이미징을 위한 Param 구조에서 일반 사용자 정의 매개변수를 변경합니다: 시작/끝 깊이를 0/40mm로, 중심 주파수를 6.9MHz로, 변환기 이름을 'L11-4v'로 설정합니다.
- 새로운 RunCase 를 정의하고 반복적인 광학 활성화/재축합 및 PFHnD의 US 이미징을 위한 모듈 시퀀스를 설계합니다. 이는 초고속 이미징(mUF), 외부 레이저(mExtLaser) 및 유휴(mIdle)와 같은 사전 정의된 모듈을 나열하여 수행됩니다.
- 시퀀스 세트 mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF 를 두 번 반복하여 n-펄스 및 p-펄스 이미징 데이터를 모두 획득합니다.
참고: 각 시퀀스의 첫 번째 mExtLaser 모듈은 ExtLaser.Enable 을 0으로 설정하여 가짜 레이저로 설정되고 레이저 활성화 후 배경 미국 이미지와 n/p 펄스 미국 이미지 사이의 시간을 최소화하기 위해 'mIdle'이 포함됩니다.
- 시퀀스 세트 mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF 를 두 번 반복하여 n-펄스 및 p-펄스 이미징 데이터를 모두 획득합니다.
- 현재 실행 사례의 모듈 시퀀스에 배치된 각 모듈에 대한 모듈 매개 변수를 설정합니다. 모듈 시퀀스의 순서에 해당하는 인덱스로 각 모듈 매개 변수에 액세스합니다. 모듈은 사용자가 여기에 설정 한 모듈 매개 변수로 미리 정의 된 작업을 실행합니다.
- 외부 레이저 모듈의 ExtLaser.QSdelay 를 3.3단계에서 조정한 레이저 Q-스위치 지연 값(마이크로초)으로 설정합니다. 이 모듈은 레이저 시스템의 플래시 램프 트리거가 꺼질 때까지 기다렸다가 QSdelay에 지정된 지연 후에 Q-스위치 트리거를 생성합니다.
- 초고속 이미징 모듈에서 Resource.numFrame 을 100으로 설정하고, SeqControl.PRI 를 200(μs)으로 설정하고, TW.극성 을 P 펄스의 경우 1로, N 펄스의 경우 -1로 설정합니다(해당 펄스 모양은 그림 4 참조). 이 모듈은 TW.polarity에 지정된 펄스 유형으로 초고속 0도 평면파를 전송합니다.
- SeqControl.PRI의 펄스 반복 간격인 Resource.numFrame에서 프레임 수에 대해 38.8mm 너비의 전체 조리개 이미징 창을 획득한 다음 오프라인 처리를 위해 데이터를 저장합니다.
- 유휴 모듈의 SeqControl.lastPRI_Module 레이저 펄스 사이의 시간 길이(100ms)에서 Q-스위치 지연, 이미징 데이터 수집 시간(20ms) 및 신호가 이동하는 20μs 여유를 뺀 값으로 설정합니다. 이 모듈은 이미징 데이터 수집 종료와 다음 레이저 펄스 여기 사이의 시간 간격을 채우기 위해 SeqControl.lastPRI_Module 시간 동안 시스템을 '작동 없음' 상태로 유지합니다.
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Representative Results
PFCnD의 성공적인 포뮬레이션 및 원심 분리는 직경 200-300nm 크기의 액적을 생성해야 합니다(그림 1A). 부적절하게 분리된 액적은 약 1μm의 작은 피크를 보일 수 있습니다. 이러한 용액은 더 큰 물방울을 분해하기 위해 더 많은 욕조를 초음파 처리 할 수 있습니다. 액적의 크기는 Ostwald 숙성21,22로 알려진 과정에서 유착 및/또는 확산으로 인해 시간이 지남에 따라 증가합니다(그림 1B).
이미징 펄스를 조작하여 액적의 음향 변조는 기화된 PFCnD의 대비를 개선했습니다. 이것은 빔 포밍 이미지의 인접한 프레임을 빼서 재구성 된 PFCnD 이미지에서 입증되었으므로 기화 된 PFCnD에서 반환 된 신호 만 보이고 고정 된 배경 신호는 억제됩니다. 콘트라스트는 평균 배경 신호에 대한 원형 포함 영역의 평균 신호와 평균 배경 신호 사이의 차이의 비율에 의해 정량화된다. 배경 신호는 개재물과 동일한 깊이 및 등가 영역에 있는 배경의 두 직사각형 ROI로부터의 신호에 의해 정의됩니다. N-펄스에 대한 포함으로부터의 대비는 P-펄스보다 약 3.2배 더 큽니다(즉, 220% 개선).
반전 이미징 펄스는 또한 PFCnD 기화로 인한 신호의 수명을 증가 시켰습니다. 이것은 배경 신호를 초과하는 원형 포함 영역의 픽셀을 임계 값으로 정량화했습니다. 임계 값을 초과하는 포함의 픽셀 비율은 고 에코 영역 (%)으로 정의되었습니다. 시간 경과에 따른 PFCnD의 초에코 생성 거동을 조사하기 위해 각 프레임에 대해 고에코 영역을 계산하고 첫 번째 프레임의 고에코 영역으로 정규화한 다음 지수 감쇠 모델에 피팅합니다. 이 기능은 PFCnD 활성화 후 고에코 영역이 초기 영역의 10%로 감쇠하는 데 걸리는 시간 범위로 정의되는 특성 감쇠 시간을 결정하는 데 사용되었습니다(그림 6a). 정규화 된 고 에코 영역의 특징적인 감쇠 시간은 P- 펄스에 비해 N- 펄스 이미징에서 최대 3.5 배 더 길다. 각 N-펄스 및 P-펄스 이미징에 대한 대표적인 B-모드 차동 영상 프레임이 도 6b에 도시되어 있다.
그림 1: PFCnD의 DLS 크기 측정 및 안정성. (A) 합성 후 액적의 세 가지 측정에서 평균한 액적의 크기 강도 분포(평균 PDI: 0.132± 0.016; 평균 Z-평균: 259.3 ± 0.7nm). (B) 합성 후 24 시간 동안 취해진 3 회 측정으로부터 평균화 된 액적의 크기 강도 분포 (평균 PDI : 0.252± 0.061; 평균 Z- 평균 : 322.5 ± 4.5 nm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 폴리아크릴아미드 몰드의 이미지 및 개략도 . (A) 실험실 테이프와 플라스틱 용기로 만든 금형의 이미지. (B) 몰드로부터 제거한 후의 폴리아크릴아미드 팬텀의 측정값을 사용한 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 레이저 펄스 전달 및 초음파 영상의 개략 도. (A) 어셈블리의 구성 요소가 라벨링되고 포함 위치에 대한 레이저 빔/초음파 이미징 평면 정렬이 예시됩니다. (B) 실제 설정을 보여주는 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 시뮬레이션된 초음파 영상 펄스. 파형은 250MHz로 샘플링된 초음파 이미징 시스템 소프트웨어로 시뮬레이션됩니다. P-펄스와 N-펄스의 파형은 동일한 중심 주파수와 펄스 폭으로 생성되지만 위상차는 180°입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대비 측정. N-펄스 및 P-펄스에 대한 포함 영역의 평균 대비 값, 오차 막대는 표준 편차(n=3)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 고에코 영역과 대표적인 차동 B-모드 마법사의 특징적인 감쇠 곡선. (A) 동일한 단면에서 N- 펄스 및 P- 펄스 이미징에 대해 시간이 지남에 따라 PFCnD 활성화에 의해 유도 된 정규화 된 고 에코 영역. 점선은 초기 고 에코 영역의 10 %를 나타냅니다. 적합도가 점선과 교차하는 시간은 특성 감쇠 시간을 나타냅니다. (B) 이미지는 포함을 중심으로 잘린 ROI 창을 보여 주며 동적 범위가 35 인 dB 스케일로 표시됩니다. 위쪽 행은 P-펄스에 의해 이미지화된 응축 동작을 보여주고 아래쪽 행은 N-펄스를 보여줍니다. 노란색 점선은 포함 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 팬텀의 총 부피 (mL) | 50 | 100 | 250 | 500 |
| 디 워터 (mL) | 37.5 | 74.9 | 187.4 | 375 |
| 40 % PA 용액 (mL) | 12.5 | 25.1 | 62.6 | 125 |
| 실리카 (밀리그램) | 100 | 200 | 500 | 1000 |
| 10 % APS 용액 (μL) | 500 | 1000 | 2500 | 5000 |
| 테메드 (μL) | 62.5 | 125 | 312.5 | 625 |
표 1: 주형 부피를 기준으로 한 폴리아크릴아미드 팬텀 가교결합을 위한 시약 및 양 요약. 이 표는 사용된 시약과 몇 가지 일반적인 금형 부피를 기반으로 한 양에 대한 간결한 값 요약을 제공합니다.
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Discussion
프로브 초음파 처리는 PFCnD를 제조하는 비교적 간단하고 배우기 쉬운 방법입니다. 주의를 기울여야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 클로로포름을 취급할 때는 휘발성이고 표준 공기 변위 피펫에서 "누출"되므로 용적형 피펫 또는 유리 주사기를 사용해야 합니다. 또한 정변위를 사용하는 경우 클로로포름이 대부분의 플라스틱 팁을 용해시켜 용액에 오염 물질을 유입시킬 수 있으므로 적절한 팁을 사용해야 합니다. 용적형 피펫 또는 유리 주사기는 퍼플루오로헥산에도 권장되는데, 이는 퍼플루오로헥산이 물보다 휘발성이고 밀도가 높기 때문입니다. 일반적으로 휘발성 및 고밀도의 개별 효과는 공기 변위 피펫에서 사전 습윤하고 스케일을 사용하여 피펫에 설정된 부피를 조정함으로써 각각 줄일 수 있습니다. 그러나 두 가지 특성을 모두 가진 퍼플루오로헥산의 경우 휘발성으로 인해 정확한 중량 측정을 얻기 어려워 용적식 피펫/유리 주사기가 가장 실행 가능한 옵션입니다.
프로브 용액을 초음파 처리하기 전에 지질과 퍼플루오로카본 용액을 얼음 욕조에서 배양하여 초음파 처리 중에 퍼플루오로카본이 끓는 것을 방지하기 위해 냉각시키는 것이 중요합니다. 이 단계는 퍼플루오로펜탄과 같은 저비등 퍼플루오로카본에 특히 중요합니다. 또한 프로브가 용액을 초음파 처리 할 때주의를 기울여야합니다. 초음파 처리 프로브 팁은 물에 잠겨 있어야하지만 팁을 손상시키고 바이알을 산산조각내어 지질 용액을 얼음 욕조로 비울 수 있으므로 유리 바이알의 바닥이나 측면과 접촉해서는 안됩니다.
PFCnD 제조 프로토콜은 몇 가지 사소한 방법으로 조정할 수 있습니다. 단계 1.3에서 회전 증발기를 사용할 수 없는 경우, 용액을 질소 가스의 꾸준한 스트림으로 건조시키거나 진공 챔버에 밤새 두어 지질 케이크를 형성할 수 있습니다. 지질과 관련하여, 이 제형은 DSPE-PEG:DSPC의 표준 1:9 비율과 비교하여 DSPE-PEG:DSPC의 9:1 비율을 이용하는데, 이는 더 작고 더 큰 크기의 안정한 액적(23)을 초래하기 때문이다. 이 제형은 DSPE-PEG의 작은 분획(~2mol%)을 기능화된 DSPE-PEG를 원하는 부분(예를 들어, 비오틴, 티올, 아민 등)으로 대체함으로써 표면 접합을 허용하도록 적응될 수 있다.
일반적으로 프로브 초음파 처리기는 상업적으로 이용 가능하며 비교적 사용하기 쉽고 다른 높은 끓는점 퍼플루오로카본 및 계면활성제 제형에 쉽게 적용할 수 있지만 실온에서 기체인 퍼플루오로카본 코어가 있는 물방울을 만드는 데 사용할 수 없습니다. 그러한 수정 중 하나는 프로브 초음파 처리를 사용하여 마이크로 버블을 생성 한 다음 압력을 가하고 온도를 낮추어 마이크로 버블을 물방울(24)로 응축시키는 것입니다. 이 방법은 음향적으로 기화 가능한 액적을 생성하는 영리한 방법이지만 응축 후 ODV를 보장하기 위해 마이크로버블 내에 충분한 염료를 캡슐화하는 것은 어렵습니다. 대안적인 접근법은 염료 (예를 들어, Cy7.5)를 지질에 접합시키고, ODV 가능한 저비점 PFCnDs25로 응축될 수 있는 마이크로버블을 형성하는 것이다.
프로브 초음파 처리는 또한 비교적 짧은 기간에 고농도의 나노 방울 (~ 1010 방울 / mL)을 생성합니다. 그러나 이 기술은 혈관을 유출할 나노 방울의 양을 줄이는 큰 크기 분포를 초래합니다. 더 큰 액적을 제거하기 위해 원심 여과 또는 주사기 필터를 통해 이를 개선할 수 있는 반면, 생성된 PFCnD는 미세유체공학을 사용하여 합성되거나 압출(26)을 통해 여과된 액적에 비해 더 큰 다분산성을 나타낼 것이다. 프로브 초음파 처리의 또 다른 단점은 초음파 처리 프로브 팁이 필연적으로 초음파 처리 중에 캐비테이션에서 움푹 들어가고 주기적으로 교체해야한다는 것입니다.
액적을 생성하는 또 다른 접근법은 낮은 다분산 지수(PDI)로 액적을 특정 크기로 조정하는 데 사용할 수 있는 미세유체 장치를 활용합니다. 그러나 이러한 장치는 비교적 느린 속도(~104-10 6 방울/초)26로 액적을 생성하며, 단계 유화(27), 유동 초점 장치(28,29)에서 팁 스트리밍, 엇갈린 헤링본 마이크로믹서(30)와 함께 우조 효과 활용과 같은 몇 가지 개발이 있었지만 - 나노 크기의 물방울을 생성하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 또한이 기술은 상업적으로 이용 가능하지 않으며 이러한 장치의 제조에는 전문 지식이 필요합니다.
상업적으로 입수가능한 다른 방법은 압출 및 균질화를 포함한다. 압출은 멤브레인을 사용하여 물방울을 통과시켜 초음파 처리에 비해 좁은 크기 범위의 나노 크기의 물방울을 생성합니다. 그러나 이 방법은 제형에 크게 의존적이고, 액적(26) 내에 염료 또는 치료용 화물을 혼입시키는 것이 어렵다. 고압 균질화는 고압 및 전단 응력을 이용하여 확장 가능한 방식으로 단분산, 나노 스케일 지질 입자를 생성하는 상업적으로 이용 가능한 균질화를 사용합니다31,32,33. 이 방법은 비점이 높고 낮은 과불화탄소(32,34)를 갖는 액적을 생성하도록 조정되었다. 액적 제형 방법 및 샘플 프로토콜에 대한 보다 실질적인 검토는 다음의 문헌고찰26에서 찾을 수 있다.
팬텀은 시험관 내에서 나노 방울의 성능을 특성화하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜에서는 실리카가있는 폴리 아크릴 아미드 기반 팬텀이 사용됩니다. 폴리아크릴아미드 팬텀의 가장 빈번한 문제는 중합이 느리거나 없는 것과 관련이 있습니다. 느린 중합은 덜 문제가 되지만 매립된 산란의 이질적인 분포로 이어질 수 있습니다. 이 문제의 가장 흔한 원인은 가교를 시작하는 자유 라디칼의 생성을 감소시키는 과황산 암모늄의 오래된 용액을 사용하는 것입니다. 이 문제는 솔루션을 신선하게 만들거나 1주일 이상 된 준비된 솔루션을 사용하지 않음으로써 쉽게 해결할 수 있습니다. 또 다른 가능성은 TEMED의 분해입니다 - 이것은 황색 침전물의 형성에서 분명해질 것입니다. 또 다른 일반적인 문제는 중합된 팬텀에 기포가 존재한다는 것입니다. 과도한 표면 교반을 피하기 위해 물을 적절하게 탈기하고 조심스럽게 취급하면 이 문제가 완화됩니다. 다른 전략은 2.5 단계 후에 전체 솔루션을 탈기하는 것입니다. 그러나 이것은 아크릴 아미드의 존재로 인해 흄 후드에서 수행되어야합니다.
이 팬텀은 개별 액적 행동을 연구하기 위해 제한된 비말의 거동을 이미징하는 데에도 탁월합니다. 이 작업은 2.4단계에서 팬텀에 PFCnD를 추가하여 수행할 수 있습니다. 또한, 가교는 화학 반응에 의한 것이기 때문에, 젤라틴과 같은 상위 임계 용액 온도를 기반으로 하는 물리적 가교에 비해 상대적으로 적은 열이 생성된다. 이것은 내장 된 물방울의 자발적인 기화 가능성을 줄입니다.
팬텀을 합성하기 위한 다양한 방법이 있는 반면, 폴리아크릴아미드는 낮은 음향 감쇠(35 ) 및 광학 흡수 계수(36)를 갖는 비교적 내구성 있고 분해되지 않는 팬텀을 생성한다. 이러한 특성은 최종 폴리아크릴아미드 용액의 농도를 조정하고 실리카, 유리 비드 또는 이산화티탄(36)과 같은 팬텀 내의 입자의 포함을 통해 인간 조직의 음향 및 광학적 특성을 보다 밀접하게 모방하도록 조정될 수 있다. 또한 팬텀의 기계적 특성은 폴리머 함량의 백분율(즉, 아크릴아미드 및 비스(아크릴아미드)의 백분율) 및 가교제의 백분율(즉, 총 폴리머 함량에서 비스(아크릴아미드)의 백분율)37을 수정하여 조정할 수 있습니다. 대체 팬텀에는 한천38, 젤라틴39, 폴리비닐 알코올(PVA)40 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않습니다.
활성화된 PFCnD 분포 및 초형성 역학의 성공적인 이미징을 위한 중요한 단계는 다음과 같습니다. 1) 레이저 시스템 (활성화 소스)과 초음파 이미징 시스템을 동기화합니다. 2) 레이저 단면을 대상 관심 영역 및 초음파 이미징 평면에 맞춥니다. 3) PFCnD 영상에 적합한 초음파 영상 파라미터(예: 프레임 속도, 펄스 파형 등)를 조정합니다.
PFCnD의 광학 활성화는 시간에 따른 재응축 단계를 관찰하면서 초음파 이미지의 품질을 크게 저하시키는 음향 간섭을 피할 수 있다는 점에서 음향 활성화 된 것에 비해 눈에 띄는 이점이 있습니다. 그러나 레이저 시스템을 공간적으로나 시간적으로 초음파 이미징 시스템과 통합하고 정렬하는 것은 어렵습니다. 3D 프린팅 홀더를 사용하면 반복 가능하고 제어된 광 전달이 가능합니다. 금속 막대는 광 전달을 나타내기 위해 광음향 대비를 생성해야 하므로 폴리아크릴아미드 팬텀에 포함된 금속 막대를 삽입하여 광 전달을 해결할 수도 있습니다. 시간적 동기화는 이전에 개발된 플랫폼(20)을 구축함으로써 달성되었으며, 이는 사용자 친화적인 인터페이스로 Verasonics 이미징 시스템의 완전한 프로그래밍 가능성을 유지하면서 레이저 및 이미징 시스템의 동기화를 모두 허용합니다. 또한 이 프로그램은 실시간 기존 B 모드 이미징 및 광음향 이미징을 제공하여 문제 해결을 지원하고 PFCnD가 배포되는 관심 영역을 찾는 데 도움을 줍니다. 그러나 이 설정에는 외부 나노초 펄스 레이저가 필요합니다. 현재, 우리가 아는 한, PFCnD 이미징을 허용할 수 있는 레이저-초음파 이미징 시스템을 통합한 몇 가지 상용 시스템이 있습니다(예: Visualsonics(Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 및 iTheraMedical(인사이트 64, inVision 128, inVision 256-TF 및 inVision 512-echo).
PFCnD의 기화-재응축 거동의 초고속 초음파 영상은 주로 낮은 감도로 고통받습니다. 이미지 감도 향상을 위한 가장 일반적인 솔루션에는 다중 프레임 컴파운딩이 포함되지만, PFCnD 이미징은 시차 프로세스를 포함한다는 점에서 모션 아티팩트에 매우 취약하기 때문에 이러한 기술은 프레임 속도를 저하시키는 고유한 특성에 의해 제한됩니다. 당사 프로토콜의 펄스 극성 변조는 기화된 PFCnD의 음향 역학을 활용하여 시간 해상도에 전혀 영향을 미치지 않으면서 보다 구별되고 연장된 이미지를 제공함으로써 PFCnD 이미징에서 이 문제를 효과적으로 해결합니다.
ODV는 반복 기화 및 광 음향 대비와 같은 고유 한 기능을 가진 물방울을 허용하지만 활성화 방법은 초음파에 비해 깊이 침투가 제한적입니다. 광 투과가 제한됨에 따라, 이것은 주로 감시 림프절 생검41의 대체와 같은 피상적 절차로 적용을 제한한다. 이 제한은 잠재적으로 카테터 기반 광 전달 시스템을 통해 우회되어 조직 깊숙한 곳에서 활성화될 수 있습니다. 콘트라스트가 음향적이기 때문에 기화는 ADV에 필적하는 깊이에서 이미징 될 수 있습니다. 대안적인 활성화 기술은 자기 액적 기화일 수 있으며, 여기서 산화철 나노입자와 같은 자기 조영제가 액적(42) 내에 캡슐화된다. 이것은 어떤 깊이에서도 기화를 허용합니다.
미래에는 PFCnD의 초형성 반응을 동시에 이미지화하고 조절하는 당사 프로토콜의 기능을 PFCnD의 모니터링 및 조작이 필요한 여러 애플리케이션에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 더 긴 검출 가능 시간은 평균에 더 많은 수의 프레임을 제공함으로써 초고해상도 이미징의 이미지 품질을 향상시킬 수 있습니다. 또한, PFCnD의 보다 정밀한 제어는 BBB 개방 및 약물 전달과 같은 기포 매개 치료제의 효율성과 안전성을 높일 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 BCRF-20-043 보조금으로 유방암 연구 재단에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
| L11-4v | Verasonics | - | ultrasound linear array transducer |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
| N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
| Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
| Tempest 30 | New wave research | - | Pulsed laser system |
| Vantage 128 | Verasonics | - | research ultrasound imaging system |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | - | Makes size measurements based on dynamic light scattering |
References
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