Summary
Optisch geactiveerde perfluorkoolstof nanodruppeltjes zijn veelbelovend in beeldvormingstoepassingen buiten het vasculaire systeem. Dit artikel zal demonstreren hoe deze deeltjes te synthetiseren, polyacrylamidefantooms te crosslinken en de druppels akoestisch te moduleren om hun signaal te verbeteren.
Abstract
Microbubbels zijn het meest gebruikte beeldcontrastmiddel in echografie. Vanwege hun grootte zijn ze echter beperkt tot vasculaire compartimenten. Deze microbubbels kunnen worden gecondenseerd of geformuleerd als perfluorkoolstof nanoddruppeltjes (PFCnD's) die klein genoeg zijn om te extravaseren en vervolgens akoestisch worden geactiveerd op de doellocatie. Deze nanodeeltjes kunnen verder worden verbeterd door een optische absorber op te nemen, zoals nabij-infrarode organische kleurstof of nanodeeltjes (bijv. Kopersulfide nanodeeltjes of gouden nanodeeltjes / nanostaafjes). Optisch gelabelde PFCnD's kunnen worden verdampt door laserbestraling in een proces dat bekend staat als optische druppelverdamping (ODV). Dit activeringsproces maakt het gebruik van perfluorkoolstofkernen met een hoog kookpunt mogelijk, die niet akoestisch kunnen worden verdampt onder de maximale mechanische indexdrempel voor diagnostische beeldvorming. Hogere kookpuntkernen resulteren in druppels die na verdamping opnieuw worden samengesteld, wat resulteert in "knipperende" PFCnD's die kort contrast produceren na verdamping voordat ze terug condenseren in nanodruppelvorm. Dit proces kan worden herhaald om contrast op aanvraag te produceren, waardoor de achtergrondvrije beeldvorming, multiplexing, superresolutie en contrastverbetering mogelijk is door zowel optische als akoestische modulatie. Dit artikel zal demonstreren hoe optisch-triggerbare, lipide shell PFCnD's kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van sonde-sonicatie, polyacrylamidefantooms kunnen worden gemaakt om de nanodruppels te karakteriseren en de PFCnD's akoestisch te moduleren na ODV om het contrast te verbeteren.
Introduction
Microbubbels zijn het meest alomtegenwoordige ultrasone contrastmiddel vanwege hun biocompatibiliteit en uitstekende echogeniciteit in vergelijking met zachte weefsels. Dit maakt ze waardevolle hulpmiddelen voor het visualiseren van de bloedstroom, orgaanafbakening en andere toepassingen1. Hun grootte (1-10 μm), waardoor ze uitzonderlijk zijn voor beeldvorming op basis van hun resonantiefrequentie, beperkt hun toepassingen echter tot de vasculatuur2.
Deze beperking heeft geleid tot de ontwikkeling van PFCnD's, dat zijn nano-emulsies die bestaan uit een oppervlakteactieve stof die is omhuld rond een vloeibare perfluorkoolstofkern. Deze nanodeeltjes kunnen worden gesynthetiseerd in groottes zo klein als 200 nm en zijn ontworpen om te profiteren van "lekkende" vasculatuur of poriën en open fenestraties in tumorvasculatuur. Hoewel deze verstoringen tumorafhankelijk zijn, zorgt deze permeabiliteit voor extravasatie van nanodeeltjes van ~ 200 nm - 1,2 μm, afhankelijk van de tumor 3,4. In hun oorspronkelijke vorm produceren deze deeltjes weinig tot geen ultrasoon contrast. Bij verdamping - akoestisch of optisch geïnduceerd - verandert de kernfase van vloeistof in gas, waardoor een tweeënhalf tot vijfvoudige toename van de diameter 5,6,7 wordt geïnduceerd en fotoakoestisch en echoscopisch contrast wordt gegenereerd. Hoewel akoestische verdamping de meest voorkomende activeringsmethode is, creëert deze aanpak akoestische artefacten die de beeldvorming van de verdamping beperken. Bovendien vereisen de meeste perfluorkoolwaterstoffen gerichte echografie met een mechanische index boven de veiligheidsdrempel om te verdampen8. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van PFCnD's met een lager kookpunt, die kunnen worden gesynthetiseerd door microbubbels te condenseren tot nanodruppels9. Deze druppels zijn echter vluchtiger en onderhevig aan spontane verdamping10.
Optische druppelverdamping (ODV) vereist daarentegen de toevoeging van een optische trigger zoals nanodeeltjes11,12,13 of kleurstof 6,14,15 en kan hogere kookpuntperfluorkoolwaterstoffen verdampen met behulp van fluences binnen de ANSI-veiligheidslimiet11. PFCnD's gesynthetiseerd met hogere kookpuntkernen zijn stabieler en zullen na verdamping opnieuw worden samengesteld, waardoor achtergrondvrije beeldvorming16, multiplexing17 en superresolutie18 mogelijk zijn. Een van de belangrijkste beperkingen van deze technieken is het feit dat PFCnD's met een hoog kookpunt echogeen zijn na verdamping gedurende slechts een kort tijdsbestek, op de schaal van milliseconden19, en relatief zwak zijn. Hoewel dit probleem kan worden verzacht door herhaalde verdampingen en gemiddelden, blijft detectie en scheiding van druppelsignaal een uitdaging.
Geïnspireerd door pulsinversie kunnen de duur en het contrast worden verbeterd door de fase van de ultrasone beeldvormingspulste wijzigen 19. Door de ultrasone beeldvormingspuls te starten met een zeldzaamheidsfase (n-puls), neemt zowel de duur als het contrast van de verdampte PFCnD's toe. Daarentegen resulteert het starten van de ultrasone beeldvormingspuls met een compressiefase (p-puls) in een verminderd contrast en een kortere duur. Dit artikel zal beschrijven hoe optisch triggerbare perfluorkoolstof nanodruppels, polyacrylamidefantooms die vaak worden gebruikt bij beeldvorming kunnen worden gesynthetiseerd en contrastverbetering en verbeterde levensduur van het signaal kunnen worden aangetoond door akoestische modulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Perfluorkoolstof nanodruppel formulering
- Spoel een kolf met ronde bodem van 10 ml uit met chloroform en spoel een gasdichte glazen spuit van 10 μL en 1 ml met chloroform uit door herhaaldelijk het volledige spuitvolume aan te zuigen en in totaal drie keer te verdrijven.
LET OP: Chloroform is vluchtig en kan giftig zijn bij inademing. Alle werkzaamheden met dit oplosmiddel moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. - Voeg met behulp van de spuiten 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC, 25 mg/ml) en 1 ml IR 1048 (1 mg/ml in chloroform) toe aan de kolf met ronde bodem. Vergeet niet om de spuiten tussen lipiden / kleurstof schoon te maken om besmetting van de voorraad te voorkomen.
OPMERKING: Infraroodkleurstoffen zijn lichtgevoelig en het werk moet worden gedaan in schemerige omstandigheden of kolven moeten worden bedekt met aluminiumfolie. - Verwijder het oplosmiddel met behulp van een roterende verdamper. Zorg ervoor dat het vacuüm langzaam wordt ingesteld op 332 mbar om stoten te voorkomen. Verlaag na 5 minuten de druk tot 42 mbar om eventueel in de oplossing terecht te komen.
OPMERKING: De lipidenkoek kan 's nachts worden bewaard in een ronde bodemkolf bedekt met parafilm bij 4 °C. - Suspensie de lipidenkoek in 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en soniceer of vortex bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten of totdat alle lipidenkoek is gesuspendeerd en opgelost in de oplossing. Soniceer nog eens 2 minuten om de oplossing te homogeniseren.
- Breng de oplossing over in een glazen injectieflacon van 7 ml en plaats de injectieflacon in een glazen schaal gevuld met ijs om de oplossing gedurende 5 minuten te laten afkoelen voordat u 50 μL perfluorohexaan toevoegt met behulp van een gasdichte glazen spuit. Vergeet niet de spuit met perfluorohexaan uit te spoelen voordat u deze in de injectieflacon doseert.
- Plaats de glazen injectieflacon met de lipiden en het ijsbad in de sonde sonicatorbehuizing en dompel de sondepunt onder de miniscus. Zorg ervoor dat de zijkanten van de sonicatorsonde de lip van de glazen injectieflacon niet raken.
- Sonde soniceer het mengsel met de volgende instellingen: Amplitude 1, Procestijd: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Soniceer vervolgens op de volgende instellingen: Amplitude: 50, Procestijd: 5 s, Pulse-on: 1 s, Pulse-off: 10 s.
- Breng de nanodruppeloplossing over naar een centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 x g om de grotere druppels (>1 μm) van kleinere druppels te scheiden.
- Gooi de pellet weg en breng het supernatant over naar een andere centrifugebuis van 1,5 ml. Was het supernatant door gedurende 5 minuten op 3000 x g te centrifugeren om alle druppels in oplossing te pelleteren. Resuspendeer de PFCnD's in 1 ml PBS door de pellet op en neer te pipetteren en vervolgens gedurende 1 minuut in een badsoonapparaat te soniceren.
- Meet de grootte van de druppels met behulp van dynamic light scattering (DLS). Verdun de voorraad PFCnD's met een factor 100 (10 μL PFCnD-voorraad in 990 μL PBS) en badsoonapparaat om de PFCnD's vóór de meting te dispergeren. De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 1.
- Bepaal de concentratie van de PFCnD's met behulp van de nanodeeltjes tracking analyzer (zie Materiaaltabel). Verdun de PFCnD's met een factor 100-1000 om een nauwkeurige meting van de concentratie te garanderen. Het protocol levert meestal druppels op in een concentratie in de orde van grootte van10 10 deeltjes / ml.
- Bereid 10 ml ultrasone koppelingsgel in een centrifugebuis van 50 ml en voeg 1% (v / v) of 100 μL PFCnD's toe om een oplossing van ~ 108 deeltjes / ml te maken. Vortex de oplossing om te mengen. Centrifugeer het mengsel op 4000 x g gedurende 3 minuten om belletjes te verwijderen.
2. Polyacrylamide fantoompreparaat
- Ontgas water door een vacuümkolf van 500 ml te vullen met 400 ml gedeïoniseerd water, sluit af met een rubberen kurk en sluit de kolf aan op de vacuümleiding. Open de vacuümleiding en dompel de bodem van de kolf onder in de badsonicator. Soniceer gedurende 5 minuten of totdat er geen gasbelvorming zichtbaar is.
- Bereid 10% ammoniumpersulfaat (APS) oplossing door 500 mg op te lossen in 5 ml ontgast water. Draai de oplossing voorzichtig rond als het ammoniumpersulfaat niet volledig oplost.
- Voeg in een bekerglas van 400 ml met een roerstaaf op een roerplaat 150 ml ontgast water en 50 ml acrylamide-bisacrylamide-oplossing toe om 200 ml acrylamide-bisacrylamide-oplossing te vormen. Roer het mengsel op 200 tpm om de juiste menging mogelijk te maken zonder bubbels te introduceren.
LET OP: Acrylamide is een carcinogeen en al het werk moet worden gedaan in een zuurkast met handschoenen, vooral als u werkt met acrylamide in poedervorm. - Weeg 400 mg silica af en voeg dit toe aan de 10% acrylamide-bisacrylamide-oplossing uit stap 2.3 om een 0,2 % (g/v) silica- en acrylamideoplossing te vormen.
LET OP: Silica bij inademing kan een carcinogeen zijn. Alle werkzaamheden, inclusief wegen, moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. - Bereid een vierkante mal van 58 mm x 58 mm x 78 mm voor met een cilindrische opname door de uiteinden van een plastic transferpipet af te snijden en deze in de mal te ondersteunen met laboratoriumtape. Zie figuur 2.
- Voeg 2 ml 10% APS-oplossing toe aan het bekerglas om een eindconcentratie van 0,1% APS te maken en voeg 250 μL tetramethyleendiamine (TEMED) toe aan de fantoomoplossing. Laat de oplossing kort roeren (minder dan een minuut).
- Giet de oplossing snel in de mal, terwijl u voorzichtig bent om geen luchtbellen in de oplossing te introduceren. De oplossing moet binnen 10 minuten polymeriseren. Verwijder het fantoom door het platte uiteinde van een laboratoriumspatel rond de rand van de mal te laten lopen en de mal om te keren.
OPMERKING: Deze fantomen kunnen meerdere keren worden hergebruikt en moeten worden ondergedompeld in water en worden opgeslagen bij 4 °C.
3. Perfluorkoolstof nanodruppel beeldvorming
- Schakel het gepulseerde lasersysteem in en warm het op gedurende ~ 20 minuten volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de glasvezelbundel correct is aangesloten op de laseruitgang en dat de twee poten correct in de vezelbundelhouder zijn geplaatst.
- Schakel het ultrasone beeldvormingssysteem in, sluit de array imaging transducer (L11-4v) aan op het systeem en bevestig de transducer in de houder om het beeldvlak uit te lijnen met de laserdoorsnede.
- Stel de pulsherhalingsfrequentie van het lasersysteem in op 10Hz en plaats een powermeter aan het einde van de vezelbundel om energie te meten. Stem de q-switchvertraging af tot de geschatte fluentie 70 mJ/cm2 is.
LET OP: Geschikte brillen moeten worden gedragen bij het afvuren van de laser en lasergordijnen moeten de ruimte omsluiten. - Vul een van de kanalen in het polyacrylamidefantoom met het ultrasone gel/PFCnD-mengsel met behulp van een 1 ml plastic sliptipspuit. Bedek de bovenkant van het kanaal royaal met ultrasone gel en verwijder eventuele bubbels met een 1 ml plastic sliptipspuit. Plaats het polyacrylamidefantoom onder de transducer en vezelbundel zoals weergegeven in figuur 3.
- Gebruik het gecombineerde laserechografie- en elasticiteitsbeeldvormingsplatform (CLUE) op basis van de software20 om PFCnD gesynchroniseerd met optische activering in beeld te brengen. Wijzig de algemene door de gebruiker gedefinieerde parameters in de Param-structuur voor beeldvorming: stel de begin- / einddiepte in op 0/40 mm, de middenfrequentie op 6,9 MHz en de naam van de transducer op 'L11-4v'.
- Definieer een nieuwe RunCase en ontwerp een modulesequentie voor herhaalde optische activering/recondensatie en Amerikaanse beeldvorming van PFHnD's. Dit wordt gedaan door vooraf gedefinieerde modules op te sommen, zoals ultrasnelle beeldvorming (mUF), externe laser (mExtLaser) en idle (mIdle).
- Herhaal de sequentieset mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF tweemaal om zowel n-pulse- als p-pulse-beeldvormingsgegevens te verkrijgen.
OPMERKING: De eerste mExtLaser-module in elke reeks wordt ingesteld als een schijnlaser door ExtLaser.Enable in te stellen op 0 en de 'mIdle' is inbegrepen om de tijd tussen Amerikaanse achtergrondafbeeldingen en de n / p-pulse Amerikaanse afbeeldingen na laseractivering te minimaliseren.
- Herhaal de sequentieset mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF tweemaal om zowel n-pulse- als p-pulse-beeldvormingsgegevens te verkrijgen.
- Stel moduleparameters in voor elke module die in de modulevolgorde van de huidige runcase is geplaatst. Open elke moduleparameter door index die overeenkomt met de volgorde in modulevolgorde. Modules voeren vooraf gedefinieerde bewerkingen uit met moduleparameters die hier door de gebruiker zijn ingesteld.
- Stel ExtLaser.QSdelay in externe lasermodules in op de waarde van de Q-switchvertraging van de laser die is afgestemd in stap 3.3, in microseconden. Deze module wacht tot de flitslamp van het lasersysteem is geactiveerd en genereert een Q-switch-trigger na de vertraging die is opgegeven in QSdelay.
- Stel in de ultrasnelle beeldvormingsmodule Resource.numFrame in op 100, stel SeqControl.PRI in op 200 (μs) en stel TW.polariteit in op 1 voor P-puls en -1 voor N-puls (zie figuur 4 voor de overeenkomstige pulsvorm). Deze module zendt ultrasnelle 0-graden vlakke golf met pulstype gespecificeerd in TW.polariteit.
- Verkrijg een beeldvenster met volledige opening van 38,8 mm breed voor het aantal frames in Resource.numFrame, pulsherhalingsinterval van SeqControl.PRI en sla vervolgens gegevens op voor offline verwerking.
- Stel SeqControl.lastPRI_Module in de inactieve module in op de tijdsduur tussen laserpulsen (100 ms) afgetrokken door Q-switchvertraging, beeldgegevensverzamelingstijd (20 ms) en een marge van 20 μs voor het signaal om te reizen. Deze module houdt het systeem onder de status 'geen werking' voor de tijd in SeqControl.lastPRI_Module om het tijdsverschil tussen het einde van de imaging data-acquisitie en de volgende laserpuls excitatie te vullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle formulering en centrifugale scheiding van de PFCnD's moeten druppels opleveren met een diameter van ongeveer 200-300 nm (figuur 1A). Onjuist gescheiden druppeltjes kunnen kleine pieken vertonen rond 1 μm. Deze oplossingen kunnen verder worden gesoniseerd om de grotere druppels te breken. De grootte van de druppels zal in de loop van de tijd toenemen als gevolg van coalescentie en/of diffusie in een proces dat bekend staat als Ostwald-rijping21,22 (figuur 1B).
Akoestische modulatie van de druppels door het manipuleren van de beeldpuls verbeterde het contrast van de verdampte PFCnD's. Dit werd gedemonstreerd in PFCnD-beelden gereconstrueerd door aangrenzende frames van de beamformed beelden af te trekken, zodat alleen het signaal dat wordt geretourneerd door verdampte PFCnD zichtbaar is en stationair achtergrondsignaal wordt onderdrukt. Contrast wordt gekwantificeerd door de verhouding van het verschil tussen gemiddelde signalen van het circulaire inclusiegebied en het gemiddelde achtergrondsignaal ten opzichte van het gemiddelde achtergrondsignaal. Het achtergrondsignaal wordt gedefinieerd door de signalen van twee rechthoekige ROIs van de achtergrond die zich op dezelfde diepte en hetzelfde gebied bevinden als de insluitsels. Het contrast met de inclusie voor de N-puls is ongeveer 3,2 keer groter (d.w.z. 220 % verbetering) dan de P-puls (figuur 5).
De omgekeerde beeldvormingspuls verhoogde ook de levensduur van het signaal van PFCnD-verdamping. Dit werd gekwantificeerd door de pixels te drempelen in het cirkelvormige inclusiegebied dat het achtergrondsignaal overschrijdt. Het percentage pixels in de inclusie dat boven de drempel lag, werd gedefinieerd als het hyperechoïsche gebied (%). Om het hyperechogene gedrag van de PFCnD's in de loop van de tijd te onderzoeken, wordt het hyperechoïsche gebied berekend voor elk frame en genormaliseerd door het hyperechoïsche gebied van het eerste frame en vervolgens gemonteerd op een exponentieel vervalmodel. Deze functie werd gebruikt om de karakteristieke vervaltijd te bepalen, gedefinieerd als de tijdspanne die nodig is om het hyperechoïsche gebied na PFCnD-activering te laten vervallen tot slechts 10 % van het oorspronkelijke gebied (figuur 6a). De karakteristieke vervaltijd van genormaliseerd hyperechoïsch gebied is tot 3,5 keer langer in N-pulsbeeldvorming in vergelijking met P-puls. Representatieve B-modus differentiële beeldframes in de tijd voor elke N-puls- en P-pulsbeeldvorming zijn weergegeven in figuur 6b.
Figuur 1: DLS-maatmetingen van PFCnD's en stabiliteit. (A) De grootte-intensiteitsverdeling van druppels gemiddeld uit drie metingen van druppels na synthese (gemiddelde PDI: 0,132± 0,016; gemiddeld Z-gemiddelde: 259,3 ± 0,7 nm). (B) De grootte-intensiteitsverdeling van druppels gemiddeld uit drie metingen die 24 uur na synthese zijn uitgevoerd (gemiddelde PDI: 0,252± 0,061; gemiddeld Z-gemiddelde: 322,5 ± 4,5 nm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbeelding en schematische weergave van polyacrylamidemal. (A) Afbeelding van de mal gemaakt van laboratoriumtape en de plastic container. (B) Schematisch met metingen van het polyacrylamidefantoom na verwijdering uit de mal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een schema van de laserpulsafgifte en ultrasone beeldvorming. (A) Componenten van de assemblage worden gelabeld en de uitlijning van het laserstraal / ultrasone beeldvormingsvlak ten opzichte van de inclusiepositie wordt geïllustreerd. (B) Een afbeelding met de werkelijke instellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gesimuleerde ultrasone beeldvormingspuls. De golfvormen worden gesimuleerd door ultrasone beeldvormingssysteemsoftware, bemonsterd door 250 MHz. De golfvorm van P-puls en N-puls worden gegenereerd met dezelfde middenfrequentie en pulsbreedte, maar hebben 180° faseverschil. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Contrastmeting. Gemiddelde contrastwaarde van het inclusiegebied voor N-puls en P-puls, foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Karakteristieke vervalcurve van hyperechoïsch gebied en representatieve differentiële B-modus magiërs. (A) Genormaliseerd hyperechoïsch gebied geïnduceerd door PFCnD-activering in de loop van de tijd voor N-puls- en P-pulsbeeldvorming bij dezelfde doorsnede. De stippellijn geeft 10% van het oorspronkelijke hyperechoïsche gebied aan. Het tijdstip waarop het passende perceel de stippellijn kruist, vertegenwoordigt de karakteristieke vervaltijd. (B) Afbeeldingen tonen een bijgesneden ROI-venster gecentreerd op de inclusie, uitgezet op een dB-schaal met een dynamisch bereik van 35. De bovenste rij toont het recondenserende gedrag dat door de P-puls wordt afgebeeld en de onderste rij toont de N-puls. De geelgekleurde stippellijn geeft het inclusiegebied aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Totaal volume phantom (ml) | 50 | 100 | 250 | 500 |
| DI water (ml) | 37.5 | 74.9 | 187.4 | 375 |
| 40% PA-oplossing (ml) | 12.5 | 25.1 | 62.6 | 125 |
| Siliciumdioxide (mg) | 100 | 200 | 500 | 1000 |
| 10% APS-oplossing (μL) | 500 | 1000 | 2500 | 5000 |
| TEMED (μL) | 62.5 | 125 | 312.5 | 625 |
Tabel 1: Samenvatting van de reagentia en hoeveelheden voor polyacrylamide phantom crosslinking op basis van het matrijsvolume. Deze tabel geeft een beknopte waardesamenvatting van de gebruikte reagentia en hoeveelheden op basis van verschillende gangbare schimmelvolumes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sonde-sonicatie is een relatief eenvoudige en gemakkelijk te leren methode om PFCnD's te fabriceren. Er zijn een paar stappen waar voorzichtigheid geboden is. Bij het hanteren van chloroform is het noodzakelijk dat een pipet met positieve verplaatsing of glazen spuiten wordt gebruikt, omdat deze vluchtig is en zal "lekken" uit standaard luchtverplaatsingspipetten. Bovendien, als u een positieve verplaatsing gebruikt, zorg er dan voor dat een geschikte tip wordt gebruikt, omdat chloroform de meeste plastic tips oplost, die verontreinigingen in de oplossing kunnen introduceren. Een pipet met positieve verplaatsing of glazen spuit wordt ook aanbevolen voor perfluorohexaan, omdat het zowel vluchtig als dichter is dan water. Doorgaans kunnen de individuele effecten van vluchtigheid en hoge dichtheid worden verminderd door voorbevochtiging in luchtverplaatsingspipets en een schaal te gebruiken om het volume op de pipet aan te passen. Maar in het geval van perfluorohexaan dat beide eigenschappen bezit, zal de vluchtigheid het moeilijk maken om nauwkeurige gewichtsmetingen te verkrijgen, waardoor een pipet / glazen spuit met positieve verplaatsing de meest haalbare optie is.
Voordat de oplossing wordt gesoniseerd, is het belangrijk om de lipide- en perfluorkoolstofoplossing in een ijsbad te incuberen om deze te laten afkoelen om te voorkomen dat de perfluorkoolstof tijdens ultrasoonapparaat kookt. Deze stap zal vooral belangrijk zijn voor een lager kokend perfluorkoolwaterstof zoals perfluoropentaan. Bovendien moet voorzichtigheid worden betracht bij het sondesoniseren van de oplossing. De tip van de ultrasoonapparaatsonde moet worden ondergedompeld, maar mag geen contact maken met de bodem of zijkanten van de glazen injectieflacon, omdat deze de punt kan beschadigen en de injectieflacon kan verbrijzelen, waardoor de lipideoplossing in het ijsbad wordt geleegd.
Het PFCnD-fabricageprotocol kan op een paar kleine manieren worden aangepast. Als een roterende verdamper niet beschikbaar is in stap 1.3, kan de oplossing worden gedroogd met een constante stroom stikstofgas of 's nachts in een vacuümkamer worden geplaatst om de lipidenkoek te vormen. Met betrekking tot de lipiden maakt deze formulering gebruik van een 9: 1-verhouding van DSPE-PEG: DSPC in vergelijking met de standaard 1: 9-verhouding van DSPE-PEG: DSPC, omdat dit resulteert in kleinere en meer grote stabiele druppels23. Deze formulering kan worden aangepast om oppervlakteconjugatie mogelijk te maken door een kleine fractie (~ 2 mol %) van de DSPE-PEG te vervangen door een gefunctionaliseerde DSPE-PEG door het gewenste deel (bijv. Biotine, thiol, amine, enz.).
Over het algemeen zijn sonde-sonicators in de handel verkrijgbaar, relatief eenvoudig te gebruiken en kunnen ze gemakkelijk worden aangepast aan andere hogere kookpuntperfluorkoolwaterstoffen en oppervlakteactieve formuleringen, maar het kan niet worden gebruikt om druppels te maken met perfluorkoolwaterstofkernen die gasvormig zijn bij kamertemperatuur zonder significante wijzigingen. Een dergelijke wijziging is het gebruik van sonde-sonicatie om microbubbels te maken en vervolgens druk uit te oefenen en de temperatuur te verlagen om de microbubbels in druppels te condenseren24. Hoewel deze methode een slimme manier is om akoestisch verdampbare druppels te genereren, is het moeilijk om voldoende kleurstof in de microbubbels in te kapselen om ODV na condensatie te garanderen. Een alternatieve benadering is om de kleurstof (bijv. Cy7.5) te conjugeren aan de lipiden en microbubbels te vormen die kunnen worden gecondenseerd tot ODV-geschikte PFCnD's met laag kookpunt25.
Sonde-sonicatie produceert ook een hoge concentratie nanodruppels (~10 10 druppels / ml) in een relatief korte tijd. Deze techniek resulteert echter in een grote distributie die de hoeveelheid nanodruppels die zullen extravaseren zal verminderen. Hoewel dit kan worden verbeterd door centrifugale filtering of spuitfilters om grotere druppels te verwijderen, zullen de resulterende PFCnD's een grotere polydispersiteit vertonen in vergelijking met druppels die worden gesynthetiseerd met behulp van microfluïdica of gefilterd door extrusie26. Een ander nadeel van sonde-sonicatie is dat de tip van de sonicatiesonde onvermijdelijk ontpit raakt door cavitatie tijdens sonicatie en periodiek moet worden vervangen.
Een alternatieve benadering voor het maken van druppels maakt gebruik van microfluïdische apparaten die kunnen worden gebruikt om druppels aan te passen aan een specifieke grootte met een lage polydispersiteitsindex (PDI). Deze apparaten produceren echter druppels met een relatief langzame snelheid (~ 104-10 6 druppels / s)26 en, hoewel er verschillende ontwikkelingen zijn geweest, zoals stapemulgering27, tipstreaming in stroomfocusapparaten28,29 en het gebruik van het ouzo-effect met een verspringende visgraatmicromixer30 - het genereren van nanosized druppels blijft nog steeds een uitdaging. Bovendien is deze techniek niet in de handel verkrijgbaar en vereist de fabricage van deze apparaten gespecialiseerde expertise.
Andere methoden die in de handel verkrijgbaar zijn, zijn extrusie en homogenisatie. Extrusie maakt gebruik van membranen om druppels door te laten, wat resulteert in druppels van nanoformaat met een smaller groottebereik in vergelijking met ultrasoonapparaat. Deze methode is echter sterk afhankelijk van de formulering en is een uitdaging om kleurstof of therapeutische lading in de druppelop te nemen 26. Hogedrukhomogenisatie maakt gebruik van in de handel verkrijgbare homogenisatoren die hoge druk en schuifspanning gebruiken om monodisperse lipidedeeltjes op nanoschaal op een schaalbare manier te genereren 31,32,33. Deze methode is aangepast om druppeltjes te creëren met een hoog en laag kookpunt perfluorkoolwaterstoffen 32,34. Een meer substantiële beoordeling van druppelformuleringsmethoden en monsterprotocollen is te vinden in de volgende review26.
Phantoms zijn een waardevol hulpmiddel om de prestaties van nanodruppels in vitro te karakteriseren. In dit protocol worden fantomen op basis van polyacrylamide met silica gebruikt. De meest voorkomende problemen met polyacrylamidefantooms zijn gerelateerd aan langzame of geen polymerisatie. Langzame polymerisatie, hoewel minder problematisch, kan leiden tot heterogene verdeling van ingebedde verstrooiing. De meest voorkomende boosdoener voor dit probleem is het gebruik van oude oplossingen van ammoniumpersulfaat die de productie van vrije radicalen verminderen die de crosslinking initiëren. Dit kan eenvoudig worden aangepakt door de oplossing vers te maken of geen bereide oplossingen te gebruiken die ouder zijn dan een week. Een andere mogelijkheid is de degradatie van TEMED - dit zal duidelijk zijn in de vorming van een geel neerslag. Een ander veel voorkomend probleem is de aanwezigheid van luchtbellen in het gepolymeriseerde fantoom. Een goede ontgassing van het water en zorgvuldige behandeling om overmatige oppervlakte-agitatie te voorkomen, zouden dit probleem moeten verminderen. Een alternatieve strategie zou zijn om de hele oplossing na stap 2.5 te ontgassen. Dit moet echter worden uitgevoerd in een zuurkast vanwege de aanwezigheid van acrylamide.
Deze fantomen zijn ook uitstekend geschikt voor het in beeld brengen van het gedrag van beperkte druppels om individueel druppelgedrag te bestuderen; dit kan worden gedaan door PFCnD's toe te voegen aan het fantoom in stap 2.4. Bovendien, omdat de crosslinking te wijten is aan een chemische reactie, wordt er relatief weinig warmte geproduceerd in vergelijking met een fysieke crosslinking op basis van een bovenste kritische oplossingstemperatuur zoals gelatine. Dit vermindert de kans op spontane verdamping van de ingebedde druppels.
Hoewel er verschillende methoden zijn voor het synthetiseren van fantomen, produceert polyacrylamide een relatief duurzaam en niet-afbreekbaar fantoom met een lage akoestische demping35 en optische absorptiecoëfficiënt36. Deze eigenschappen kunnen worden afgestemd om de akoestische en optische eigenschappen van menselijk weefsel beter na te bootsen door de concentratie van de uiteindelijke polyacrylamide-oplossing aan te passen en door deeltjes in het fantoom op te nemen, zoals silica, glasparels of titaandioxide36. Bovendien kunnen de mechanische eigenschappen van de fantomen worden aangepast door het percentage polymeergehalte (d.w.z. percentage acrylamide en bis (acrylamide)) en het percentage crosslinker (d.w.z. het percentage bis(acrylamide) in het totale polymeergehalte) te wijzigen37. Alternatieve fantomen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, agar38, gelatine39, polyvinylalcohol (PVA)40, enz.
De kritieke stappen voor een succesvolle beeldvorming van geactiveerde PFCnD-distributie en hyperechogene dynamiek zijn als volgt. 1) Synchroniseer het lasersysteem (activeringsbron) en het ultrasone beeldvormingssysteem. 2) Lijn de laserdoorsnede uit, zowel met het doelgebied van belang als met het ultrasone beeldvormingsvlak. 3) Pas ultrasone beeldvormingsparameters aan die eigen zijn aan PFCnD-beeldvorming (d.w.z. framerate, pulsgolfvorm, enz.).
De optische activering van PFCnD heeft een merkbaar voordeel ten opzichte van akoestisch geactiveerde, dat het de akoestische interferentie kan ontwijken die de kwaliteit van het ultrasone beeld drastisch vermindert terwijl de recondenserende fase in de tijd wordt waargenomen. Het is echter een uitdaging om het lasersysteem zowel ruimtelijk als temporeel te integreren en uit te lijnen met het ultrasone beeldvormingssysteem. Het gebruik van een 3D-geprinte houder zorgt voor herhaalbare en gecontroleerde lichtafgifte. De lichtafgifte kan ook worden opgelost door een metalen staaf in de opname in het polyacrylamidefantoom te steken, omdat de metalen staaf fotoakoestisch contrast moet produceren om lichtafgifte aan te geven. Temporele synchronisatie werd bereikt door voort te bouwen op een eerder ontwikkeld platform20, dat zowel synchronisatie van het lasing- als beeldvormingssysteem mogelijk maakt, terwijl de volledige programmeerbaarheid van Verasonics imaging-systeem met een gebruiksvriendelijke interface behouden blijft. Bovendien biedt het programma real-time conventionele B-mode beeldvorming en fotoakoestische beeldvorming om te helpen bij het oplossen van problemen en het lokaliseren van de regio van belang waar PFCnD's worden gedistribueerd. Deze opstelling vereist echter een externe nanoseconde gepulseerde laser. Momenteel zijn er, voor zover wij weten, een paar commerciële systemen met geïntegreerde laser-echografiesystemen die PFCnD-beeldvorming mogelijk maken, bijvoorbeeld Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 en iTheraMedical (inzicht 64, inVision 128, inVision 256-TF en inVision 512-echo).
De ultrasnelle echografie van het verdampings-recondenserende gedrag van PFCnD lijdt voornamelijk aan een lage gevoeligheid. Hoewel de meest voorkomende oplossingen voor het verbeteren van de beeldgevoeligheid multi-frame compounding omvatten, worden die technieken beperkt door hun inherente kenmerk van het degraderen van de framerate, omdat de PFCnD-beeldvorming zeer kwetsbaar is voor bewegingsartefacten omdat het tijdsverschilproces omvat. De pulspolariteitsmodulatie in ons protocol pakt dit probleem effectief aan bij PFCnD-beeldvorming door gebruik te maken van de akoestische dynamiek van verdampte PFCnD's om een meer discrimineerbaar en langdurig beeld te hebben zonder de temporele resolutie te beïnvloeden.
Hoewel ODV druppels mogelijk maakt met unieke mogelijkheden zoals herhaalde verdamping en fotoakoestisch contrast, heeft de activeringsmethode een beperkte dieptepenetratie in vergelijking met echografie. Omdat de lichtpenetratie beperkt is, beperkt dit de toepassingen tot voornamelijk oppervlakkige procedures zoals een vervanging voor schildwachtklierbiopsie41. Deze beperking kan mogelijk worden omzeild door op katheters gebaseerde lichtafgiftesystemen, waardoor activering diep in het weefsel mogelijk is. Omdat het contrast akoestisch is, kan verdamping worden weergegeven op een diepte die vergelijkbaar is met ADV. Een alternatieve activeringstechniek kan magnetische druppelverdamping zijn, waarbij magnetische contrastmiddelen zoals ijzeroxide nanodeeltjes worden ingekapseld in de druppel42. Dit zorgt voor de verdamping op elke diepte.
In de toekomst kan de mogelijkheid van ons protocol om de hyperechogene respons van PFCnD tegelijkertijd in beeld te brengen en te moduleren, worden gebruikt voor verschillende toepassingen waar monitoring en manipulatie van PFCnD vereist zijn. Een langere detecteerbare tijd kan bijvoorbeeld de beeldkwaliteit van beeldvorming met superresolutie verbeteren door een groter aantal frames tot gemiddeld te maken. Bovendien heeft een nauwkeurigere controle van PFCnD het potentieel om de efficiëntie en veiligheid van bubbelgemedieerde therapieën zoals BBB-opening en medicijnafgifte te verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Breast Cancer Research Foundation onder subsidie BCRF-20-043.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
| L11-4v | Verasonics | - | ultrasound linear array transducer |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
| N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
| Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
| Tempest 30 | New wave research | - | Pulsed laser system |
| Vantage 128 | Verasonics | - | research ultrasound imaging system |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | - | Makes size measurements based on dynamic light scattering |
References
- Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
- Lee, H., et al. Microbubbles used for contrast enhanced ultrasound and theragnosis: a review of principles to applications. Biomedical Engineering Letters. 7 (2), 59-69 (2017).
- Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (8), 4607-4612 (1998).
- Ishida, O., Maruyama, K., Sasaki, K., Iwatsuru, M. Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice. International Journal of Pharmaceutics. 190 (1), 49-56 (1999).
- Wong, Z. Z., Kripfgans, O. D., Qamar, A., Fowlkes, J. B., Bull, J. L. Bubble evolution in acoustic droplet vaporization at physiological temperature via ultra-high speed imaging. Soft Matter. 7 (8), 4009 (2011).
- Yu, J., Chen, X., Villanueva, F. S., Kim, K. Vaporization and recondensation dynamics of indocyanine green-loaded perfluoropentane droplets irradiated by a short pulse laser. Applied Physics Letters. 109 (24), 243701 (2016).
- Kripfgans, O. D., Fowlkes, J. B., Miller, D. L., Eldevik, O. P., Carson, P. L. Acoustic droplet vaporization for therapeutic and diagnostic applications. Ultrasound in Medicine & Biology. 26 (7), 1177-1189 (2000).
- Aliabouzar, M., Kumar, K. N., Sarkar, K. Acoustic vaporization threshold of lipid-coated perfluoropentane droplets. The Journal of the Acoustical Society of America. 143 (4), 2001-2012 (2018).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered nanodroplet vaporization for contrast-enhanced imaging. Nature Communications. 3 (1), 618 (2012).
- Strohm, E., Rui, M., Gorelikov, I., Matsuura, N., Kolios, M. Vaporization of perfluorocarbon droplets using optical irradiation. Biomedical Optics Express. 2 (6), 1432 (2011).
- Wei, C., et al. Laser-induced cavitation in nanoemulsion with gold nanospheres for blood clot disruption: in vitro results. Optics Letters. 39 (9), 2599 (2014).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: Dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2014).
- Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 3671 (2014).
- Hannah, A. S., Luke, G. P., Emelianov, S. Y. Blinking phase-change nanocapsules enable background-free ultrasound imaging. Theranostics. 6 (11), 1866-1876 (2016).
- Santiesteban, D. Y., Hallam, K. A., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Color-coded perfluorocarbon nanodroplets for multiplexed ultrasound and photoacoustic imaging. Nano Research. 12 (4), 741-747 (2019).
- Luke, G. P., Hannah, A. S., Emelianov, S. Y. Super-resolution ultrasound imaging in vivo with transient laser-activated nanodroplets. Nano Letters. 16 (4), 2556-2559 (2016).
- Zhu, Y. I., Yoon, H., Zhao, A. X., Emelianov, S. Y. Leveraging the imaging transmit pulse to manipulate phase-change nanodroplets for contrast-enhanced ultrasound. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (4), 692-700 (2019).
- Yoon, H., Zhu, Y. I., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Design and demonstration of a configurable imaging platform for combined laser, ultrasound, and elasticity imaging. IEEE Transactions on Medical Imaging. 38 (7), 1622-1632 (2019).
- Taylor, P.
- Freire, M. G., Dias, A. M. A., Coelho, M. A. Z., Coutinho, J. A. P., Marrucho, I. M. Aging mechanisms of perfluorocarbon emulsions using image analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 224-232 (2005).
- Yarmoska, S. K., Yoon, H., Emelianov, S. Y. Lipid shell composition plays a critical role in the stable size reduction of perfluorocarbon nanodroplets. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (6), 1489-1499 (2019).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- Lin, S., et al. Optically and acoustically triggerable sub-micron phase-change contrast agents for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. Photoacoustics. 6, 26-36 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Shui, L., vanden Berg, A., Eijkel, J. C. T. Scalable attoliter monodisperse droplet formation using multiphase nano-microfluidics. Microfluidics and Nanofluidics. 11 (1), 87-92 (2011).
- Jeong, W. -C., et al. Controlled generation of submicron emulsion droplets via highly stable tip-streaming mode in microfluidic devices. Lab on a Chip. 12 (8), 1446 (2012).
- Xu, X., et al. Microfluidic production of nanoscale perfluorocarbon droplets as liquid contrast agents for ultrasound imaging. Lab on a Chip. 17 (20), 3504-3513 (2017).
- Song, R., Peng, C., Xu, X., Zou, R., Yao, S. Facile fabrication of uniform nanoscale perfluorocarbon droplets as ultrasound contrast agents. Microfluidics and Nanofluidics. 23 (1), 12 (2019).
- Liedtke, S., Wissing, S., Müller, R. H., Mäder, K. Influence of high-pressure homogenisation equipment on nanodispersions characteristics. International Journal of Pharmaceutics. 196 (2), 183-185 (2000).
- Reznik, N., Williams, R., Burns, P. N. Investigation of vaporized submicron perfluorocarbon droplets as an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1271-1279 (2011).
- Grapentin, C., Barnert, S., Schubert, R. Monitoring the stability of perfluorocarbon nanoemulsions by cryo-TEM image analysis and dynamic light scattering. Plos One. 10 (6), 0130674 (2015).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Zell, K., Sperl, J. I., Vogel, M. W., Niessner, R., Haisch, C. Acoustical properties of selected tissue phantom materials for ultrasound imaging. Physics in Medicine and Biology. 52 (20), 475-484 (2007).
- Hariri, A., et al. Polyacrylamide hydrogel phantoms for performance evaluation of multispectral photoacoustic imaging systems. Photoacoustics. 22, 100245 (2021).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the range of polyacrylamide gel stiffness for mechanobiology applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Rajagopal, S., Sadhoo, N., Zeqiri, B. Reference characterisation of sound speed and attenuation of the iec agar-based tissue-mimicking material up to a frequency of 60 MHz. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (1), 317-333 (2015).
- Madsen, E. L., Zagzebski, J. A., Banjavie, R. A., Jutila, R. E. Tissue mimicking materials for ultrasound phantoms. Medical Physics. 5 (5), 391-394 (1978).
- Kharine, A., et al. Poly(vinyl alcohol) gels for use as tissue phantoms in photoacoustic mammography. Physics in Medicine and Biology. 48 (3), 357-370 (2003).
- Kim, H., Chang, J. H. Multimodal photoacoustic imaging as a tool for sentinel lymph node identification and biopsy guidance. Biomedical Engineering Letters. 8 (2), 183-191 (2018).
- Zhou, Y., et al. Magnetic nanoparticle-promoted droplet vaporization for in vivo stimuli-responsive cancer theranostics. NPG Asia Materials. 8 (9), 313 (2016).
