Summary
Optisch aktivierte Perfluorcarbon-Nanotröpfchen sind vielversprechend in bildgebenden Anwendungen außerhalb des Gefäßsystems. Dieser Artikel zeigt, wie diese Partikel synthetisiert, Polyacrylamidphantome vernetzt und die Tröpfchen akustisch moduliert werden, um ihr Signal zu verstärken.
Abstract
Mikrobläschen sind das am häufigsten verwendete bildgebende Kontrastmittel im Ultraschall. Aufgrund ihrer Größe sind sie jedoch auf Gefäßkompartimente beschränkt. Diese Mikrobläschen können kondensiert oder als Perfluorkohlenstoff-Nanotröpfchen (PFCnDs) formuliert werden, die klein genug sind, um zu extravasieren und dann akustisch an der Zielstelle ausgelöst zu werden. Diese Nanopartikel können durch die Aufnahme eines optischen Absorbers wie organischer Farbstoff im nahen Infrarot oder Nanopartikel (z. B. Kupfersulfid-Nanopartikel oder Goldnanopartikel / Nanostäbchen) weiter verbessert werden. Optisch markierte PFCnDs können durch Laserbestrahlung in einem Prozess verdampft werden, der als optische Tröpfchenverdampfung (ODV) bekannt ist. Dieser Aktivierungsprozess ermöglicht die Verwendung von Perfluorkohlenstoffkernen mit hohem Siedepunkt, die unter der maximalen mechanischen Indexschwelle für die diagnostische Bildgebung nicht akustisch verdampft werden können. Kerne mit höherem Siedepunkt führen zu Tröpfchen, die nach der Verdampfung wieder kondensieren, was zu "blinkenden" PFCnDs führt, die nach der Verdampfung kurz Kontrast erzeugen, bevor sie wieder in Nanotröpfchenform kondensieren. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um bei Bedarf Kontrast zu erzeugen, was eine hintergrundfreie Bildgebung, Multiplexing, Superauflösung und Kontrastverstärkung durch optische und akustische Modulation ermöglicht. Dieser Artikel zeigt, wie optisch triggerbare PFCnDs mit Lipidhülle unter Verwendung von Sondenbeschallung synthetisiert, Polyacrylamidphantome zur Charakterisierung der Nanotröpfchen erzeugt und die PFCnDs nach ODV akustisch moduliert werden, um den Kontrast zu verbessern.
Introduction
Mikrobläschen sind aufgrund ihrer Biokompatibilität und ausgezeichneten Echogenität im Vergleich zu Weichteilen das am weitesten verbreitete Ultraschallkontrastmittel. Dies macht sie zu wertvollen Werkzeugen zur Visualisierung des Blutflusses, der Organabgrenzung und anderer Anwendungen1. Ihre Größe (1-10 μm), die sie aufgrund ihrer Resonanzfrequenz für die Bildgebung außergewöhnlich macht, beschränkt ihre Anwendungen jedoch auf das Gefäßsystem2.
Diese Einschränkung hat zur Entwicklung von PFCnDs geführt, bei denen es sich um Nanoemulsionen handelt, die aus einem Tensid bestehen, das um einen flüssigen Perfluorkohlenstoffkern herum eingeschlossen ist. Diese Nanopartikel können in Größen von nur 200 nm synthetisiert werden und sind so konzipiert, dass sie "undichte" Gefäße oder Poren und offene Fensteröffnungen in Tumorgefäßen nutzen. Während diese Störungen tumorabhängig sind, ermöglicht diese Permeabilität eine Extravasation von Nanopartikeln von ~200 nm - 1,2 μm je nach Tumor 3,4. In ihrer Ausgangsform erzeugen diese Partikel wenig bis gar keinen Ultraschallkontrast. Nach der Verdampfung - akustisch oder optisch induziert - wechselt die Kernphase von flüssig zu gasförmig, wodurch eine zweieinhalb- bis fünffache Vergrößerung des Durchmessersum 5,6,7 induziert wird und ein photoakustischer und Ultraschallkontrast erzeugt wird. Während die akustische Verdampfung die gebräuchlichste Aktivierungsmethode ist, erzeugt dieser Ansatz akustische Artefakte, die die Abbildung der Verdampfung einschränken. Darüber hinaus benötigen die meisten Perfluorkohlenwasserstoffe fokussierten Ultraschall mit einem mechanischen Index jenseits der Sicherheitsschwelle, um zu verdampfen8. Dies hat zur Entwicklung von PFCnDs mit niedrigerem Siedepunkt geführt, die durch Kondensieren von Mikrobläschen zu Nanotröpfchen synthetisiert werden können9. Diese Tröpfchen sind jedoch flüchtiger und unterliegen einer spontanen Verdampfung10.
Die optische Tröpfchenverdampfung (ODV) hingegen erfordert die Zugabe eines optischen Triggers wie Nanopartikel 11,12,13 oder Farbstoff 6,14,15 und kann Perfluorkohlenwasserstoffe mit höherem Siedepunkt unter Verwendung von Fluenzen innerhalb der ANSI-Sicherheitsgrenze 11 verdampfen. PFCnDs, die mit Kernen mit höherem Siedepunkt synthetisiert werden, sind stabiler und kondensieren nach der Verdampfung wieder, was eine hintergrundfreie Bildgebung16, Multiplexing 17 und eine Superauflösung18 ermöglicht. Eine der Haupteinschränkungen dieser Techniken ist die Tatsache, dass PFCnDs mit hohem Siedepunkt nach der Verdampfung nur für einen kurzen Zeitraum auf der Skala vonMillisekunden 19 echogen sind und relativ schwach sind. Während dieses Problem durch wiederholte Verdampfungen und Mittelwertbildung gemildert werden kann, bleibt die Erkennung und Trennung des Tröpfchensignals eine Herausforderung.
Inspiriert von der Pulsinversion können Dauer und Kontrast durch Modifizierung der Phase des Ultraschallbildpulses19 erhöht werden. Durch den Start des Ultraschall-Bildgebungspulses mit einer Verdünnungsphase (n-Puls) erhöht sich sowohl die Dauer als auch der Kontrast der verdampften PFCnDs. Im Gegensatz dazu führt das Starten des Ultraschallbildpulses mit einer Kompressionsphase (p-Puls) zu einem reduzierten Kontrast und einer kürzeren Dauer. Dieser Artikel beschreibt, wie optisch triggerbare Perfluorcarbon-Nanotröpfchen, Polyacrylamid-Phantome, die üblicherweise in der Bildgebung verwendet werden, synthetisiert werden können, und demonstriert Kontrastverstärkung und verbesserte Signallanglebigkeit durch akustische Modulation.
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Protocol
1. Perfluorkohlenstoff-Nanotröpfchen-Formulierung
- Spülen Sie einen 10-ml-Rundkolben mit Chloroform aus und waschen Sie eine gasdichte 10-μL- und 1-ml-Glasspritze mit Chloroform aus, indem Sie das gesamte Spritzenvolumen wiederholt absaugen und insgesamt dreimal ausstoßen.
ACHTUNG: Chloroform ist flüchtig und kann beim Einatmen giftig sein. Alle Arbeiten mit diesem Lösungsmittel sollten in einem Abzug durchgeführt werden. - Mit den Spritzen werden 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC, 25 mg/ml) und 1 ml IR 1048 (1 mg/ml in Chloroform) in den Rundkolben gegeben. Denken Sie daran, die Spritzen zwischen Lipiden / Farbstoffen zu reinigen, um eine Kontamination des Stoffes zu vermeiden.
HINWEIS: Infrarotfarbstoffe sind lichtempfindlich und die Arbeit sollte unter schlechten Bedingungen durchgeführt werden oder Kolben sollten mit Aluminiumfolie bedeckt sein. - Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer. Stellen Sie sicher, dass das Vakuum langsam auf 332 mbar eingestellt wird, um Stöße zu vermeiden. Reduzieren Sie nach 5 Minuten den Druck auf 42 mbar, um eventuell in die Lösung eingedrungenes Wasser zu entfernen.
HINWEIS: Der Lipidkuchen kann über Nacht in einem runden Bodenkolben gelagert werden, der mit Parafilm bedeckt ist, bei 4 °C. - Suspendieren Sie den Lipidkuchen in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und beschallen oder wirbeln Sie bei Raumtemperatur für 5 min oder bis der gesamte Lipidkuchen suspendiert und in der Lösung gelöst wurde. Beschallen Sie für weitere 2 Minuten, um die Lösung zu homogenisieren.
- Die Lösung wird in eine Durchstechflasche aus 7-ml-Glas gegeben und die Durchstechflasche in eine mit Eis gefüllte Glasschale gegeben, damit die Lösung 5 Minuten lang abkühlen kann, bevor 50 μl Perfluorhexan mit einer gasdichten Glasspritze hinzugefügt werden. Denken Sie daran, die Spritze mit Perfluorhexan auszuspülen, bevor Sie sie in die Durchstechflasche geben.
- Legen Sie die Durchstechflasche aus Glas mit den Lipiden und dem Eisbad in das Sondenbeschallgehäuse und tauchen Sie die Sondenspitze unter den Miniskus. Stellen Sie sicher, dass die Seiten der Ultraschallsonde den Rand der Durchstechflasche aus Glas nicht berühren.
- Sonde beschallen Sie die Mischung mit den folgenden Einstellungen: Amplitude 1, Prozesszeit: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Dann beschallen Sie mit den folgenden Einstellungen: Amplitude: 50, Prozesszeit: 5 s, Pulse-on: 1 s, Pulse-off: 10 s.
- Die Nanotröpfchenlösung wird in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 3 min lang bei 300 x g zentrifugiert, um die größeren Tröpfchen (>1 μm) von kleineren Tröpfchen zu trennen.
- Entsorgen Sie das Pellet und geben Sie den Überstand in ein anderes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie den Überstand durch Zentrifugieren bei 3000 x g für 5 Minuten, um alle Tröpfchen in Lösung zu pelletieren. Resuspendieren Sie die PFCnDs in 1 ml PBS, indem Sie das Pellet auf und ab pipettieren und dann in einem Badesonikator für 1 Minute beschallen.
- Messen Sie die Größe der Tröpfchen mit dynamischer Lichtstreuung (DLS). Verdünnen Sie die PFCnD-Bestände um das 100-fache (10 μL PFCnD-Bestand in 990 μL PBS) und baden Sie Ultraschall, um die PFCnDs vor der Messung zu dispergieren. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.
- Bestimmen Sie die Konzentration der PFCnDs mit dem Nanopartikel-Tracking-Analysator (siehe Materialtabelle). Verdünnen Sie die PFCnDs um das 100- bis 1000-fache, um eine genaue Messung der Konzentration zu gewährleisten. Das Protokoll liefert typischerweise Tröpfchen in einer Konzentration in der Größenordnung von 1010 Partikeln / ml.
- Bereiten Sie 10 ml Ultraschall-Kopplungsgel in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor und fügen Sie 1% (v / v) oder 100 μL PFCnDs hinzu, um eine Lösung von ~ 108 Partikeln / ml herzustellen. Wirbeln Sie die zu mischende Lösung. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 4000 x g für 3 min, um Blasen zu entfernen.
2. Polyacrylamid-Phantompräparation
- Entgasen Sie Wasser, indem Sie einen 500-ml-Isolierkolben mit 400 ml entionisiertem Wasser füllen, mit einem Gummikorken verschließen und den Kolben an die Vakuumleitung anschließen. Öffnen Sie die Vakuumleitung und tauchen Sie den Boden des Kolbens in den Badsonikator. 5 min beschallen oder bis keine Gasblasenbildung sichtbar ist.
- Bereiten Sie 10% ige Ammoniumpersulfat (APS) -Lösung durch Auflösen von 500 mg in 5 ml entgastem Wasser vor. Schwenken Sie die Lösung vorsichtig, wenn sich das Ammoniumpersulfat nicht vollständig auflöst.
- In einem 400-ml-Becherglas mit einem Rührbalken auf einer Rührplatte werden 150 ml entgastes Wasser und 50 ml 40% (w/v) Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung zu 200 mL 10%iger Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung gegeben. Rühren Sie die Mischung bei 200 U/min, um das richtige Mischen ohne Blasen zu ermöglichen.
ACHTUNG: Acrylamid ist ein Karzinogen, und alle Arbeiten sollten in einem Abzug mit Handschuhen durchgeführt werden, insbesondere wenn mit Acrylamid in Pulverform gearbeitet wird. - 400 mg Kieselsäure werden abgewogen und zu der 10%igen Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung aus Schritt 2.3 gegeben, um eine 0,2 %(w/v) Siliciumdioxid- und Acrylamidlösung zu bilden.
VORSICHT: Kieselsäure kann beim Einatmen krebserregend sein. Alle Arbeiten, einschließlich des Wiegens, sollten in einem Abzug durchgeführt werden. - Bereiten Sie eine 58 mm x 58 mm x 78 mm große quadratische Form mit zylindrischem Einschluss vor, indem Sie die Spitzen einer Kunststofftransferpipette abschneiden und mit Laborband in der Form abstützen. Siehe Abbildung 2.
- 2 ml 10%ige APS-Lösung in das Becherglas geben, um eine Endkonzentration von 0,1% APS zu erhalten, und 250 μL Tetramethylethylendiamin (TEMED) in die Phantomlösung geben. Lassen Sie die Lösung kurz umrühren (weniger als eine Minute).
- Gießen Sie die Lösung schnell in die Form und achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Lösung einzuführen. Die Lösung sollte innerhalb von 10 min polymerisieren. Entfernen Sie das Phantom, indem Sie das flache Ende eines Laborspatels um den Rand der Form laufen lassen und die Form umkehren.
HINWEIS: Diese Phantome können mehrfach wiederverwendet werden und sollten in Wasser getaucht und bei 4°C gelagert werden.
3. Perfluorkohlenstoff-Nanotröpfchen-Bildgebung
- Schalten Sie das gepulste Lasersystem ein und erwärmen Sie es für ~20 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass das faseroptische Bündel ordnungsgemäß mit dem Laserausgang verbunden ist und die beiden Beine ordnungsgemäß im Faserbündelhalter platziert sind.
- Schalten Sie das Ultraschallbildgebungssystem ein, schließen Sie den Array-Bildgebungswandler (L11-4v) an das System an und befestigen Sie den Schallkopf in der Halterung, um seine Bildebene mit dem Laserquerschnitt auszurichten.
- Stellen Sie die Pulswiederholfrequenz des Lasersystems auf 10 Hz ein und platzieren Sie ein Powermeter am Ende des Faserbündels, um die Energie zu messen. Stellen Sie die Q-Switch-Verzögerung ein, bis die geschätzte Fluenz 70 mJ/cm2 beträgt.
ACHTUNG: Beim Abfeuern des Lasers muss eine geeignete Brille getragen werden und Laservorhänge müssen den Raum umschließen. - Verfüllung eines der Kanäle im Polyacrylamidphantom mit dem Ultraschallgel/PFCnD-Gemisch mit einer 1-ml-Kunststoff-Sliptip-Spritze. Bedecken Sie die Oberseite des Kanals großzügig mit Ultraschallgel und entfernen Sie alle Blasen mit einer 1-ml-Kunststoffspritze. Platzieren Sie das Polyacrylamidphantom unter dem Wandler und dem Faserbündel, wie in Abbildung 3 dargestellt.
- Verwenden Sie die kombinierte Laserultraschall- und Elastizitätsplattform (CLUE), die auf der Software20 basiert, um PFCnD synchronisiert mit optischer Aktivierung abzubilden. Ändern Sie die allgemeinen benutzerdefinierten Parameter in der Param-Struktur für die Bildgebung: Stellen Sie die Start-/Endtiefe auf 0/40 mm, die Mittenfrequenz auf 6,9 MHz und den Wandlernamen auf "L11-4v" ein.
- Definieren Sie einen neuen RunCase und entwerfen Sie eine Modulsequenz für wiederholte optische Aktivierung/Rekondensation und US-Bildgebung von PFHnDs. Dies geschieht durch die Auflistung vordefinierter Module wie Ultrafast Imaging (mUF), externer Laser (mExtLaser) und Idle (mIdle).
- Wiederholen Sie den Sequenzsatz mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF zweimal, um sowohl n-Puls- als auch p-Puls-Bilddaten zu erfassen.
HINWEIS: Das erste mExtLaser-Modul in jeder Sequenz wird als Scheinlaser eingestellt, indem ExtLaser.Enable auf 0 gesetzt wird, und der 'mIdle' ist enthalten, um die Zeit zwischen US-Hintergrundbildern und den n/p-Puls-US-Bildern nach Laseraktivierung zu minimieren.
- Wiederholen Sie den Sequenzsatz mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF zweimal, um sowohl n-Puls- als auch p-Puls-Bilddaten zu erfassen.
- Legen Sie Modulparameter für jedes Modul fest, das in der Modulsequenz des aktuellen Ausführungsfalls platziert wird. Greifen Sie auf jeden Modulparameter über einen Index zu, der seiner Reihenfolge in der Modulreihenfolge entspricht. Module führen vordefinierte Operationen mit Modulparametern aus, die hier vom Benutzer festgelegt werden.
- Stellen Sie ExtLaser.QSdelay in externen Lasermodulen auf den Wert der in Schritt 3.3 abgestimmten Laser-Q-Switch-Verzögerung in Mikrosekunden ein. Dieses Modul wartet auf den Blitzlampenauslöser des Lasersystems und erzeugt den Q-Switch-Trigger nach der in QSdelay angegebenen Verzögerung.
- Legen Sie im ultraschnellen Bildgebungsmodul Resource.numFrame auf 100, SeqControl.PRI auf 200 (μs) und TW.polarity auf 1 für P-Puls und -1 für N-Puls fest (siehe Abbildung 4 für die entsprechende Pulsform). Dieses Modul sendet ultraschnelle 0-Grad-Planarwellen mit dem in TW.polarity angegebenen Pulstyp.
- Erfassen Sie ein Bildfenster mit voller Blende von 38,8 mm Breite für die Anzahl der Frames in Resource.numFrame, das Pulswiederholungsintervall von SeqControl.PRI und speichern Sie dann Daten für die Offline-Verarbeitung.
- Stellen Sie SeqControl.lastPRI_Module im Leerlaufmodul auf die Zeitspanne zwischen den Laserpulsen (100 ms) ein, subtrahiert durch Q-Switch-Verzögerung, Bilddatenerfassungszeit (20 ms) und einen Spielraum von 20 μs für die Übertragung des Signals. Dieses Modul hält das System für die Zeit im Zustand "Kein Betrieb", SeqControl.lastPRI_Module die Zeitlücke zwischen dem Ende der Bilddatenerfassung und der nächsten Laserpulsanregung zu schließen.
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Representative Results
Eine erfolgreiche Formulierung und zentrifugale Trennung der PFCnDs sollte Tröpfchen mit einem Durchmesser von 200-300 nm ergeben (Abbildung 1A). Unsachgemäß getrennte Tröpfchen können kleine Peaks um 1 μm aufweisen. Diese Lösungen können weiter beschallt werden, um die größeren Tröpfchen aufzubrechen. Die Größe der Tröpfchen nimmt im Laufe der Zeit aufgrund von Koaleszenz und/oder Diffusion in einem Prozess zu, der als Ostwaldreifung bekannt ist21,22 (Abbildung 1B).
Die akustische Modulation der Tröpfchen durch Manipulation des Abbildungsimpulses verbesserte den Kontrast der verdampften PFCnDs. Dies wurde in PFCnD-Bildern demonstriert, die durch Subtraktion benachbarter Frames der strahlgeformten Bilder rekonstruiert wurden, so dass nur das von verdampftem PFCnD zurückgegebene Signal sichtbar ist und das stationäre Hintergrundsignal unterdrückt wird. Der Kontrast wird durch das Verhältnis der Differenz zwischen durchschnittlichen Signalen des kreisförmigen Einschlussbereichs und dem durchschnittlichen Hintergrundsignal zum durchschnittlichen Hintergrundsignal quantifiziert. Das Hintergrundsignal wird durch die Signale von zwei rechteckigen ROIs des Hintergrunds definiert, die sich in der gleichen Tiefe und äquivalenten Fläche wie die Einschlüsse befinden. Der Kontrast zum Einschluss für den N-Puls ist etwa 3,2-mal größer (d.h. 220 % Verbesserung) als der P-Puls (Abbildung 5).
Der inverse Bildgebungsimpuls erhöhte auch die Langlebigkeit des Signals aus der PFCnD-Verdampfung. Dies wurde quantifiziert, indem die Pixel im kreisförmigen Einschlussbereich, der das Hintergrundsignal überschreitet, als Schwellenwert festgelegt wurden. Der Prozentsatz der Pixel in der Blendung, der über dem Schwellenwert lag, wurde als reflexionsarmer Bereich (%) definiert. Um das hyperechogene Verhalten der PFCnDs über die Zeit zu untersuchen, wird die reflexionsarme Fläche für jeden Frame berechnet und durch den reflexionsarmen Bereich des ersten Frames normalisiert und dann an ein exponentielles Zerfallsmodell angepasst. Diese Funktion wurde verwendet, um die charakteristische Zerfallszeit zu bestimmen, definiert als die Zeitspanne, die benötigt wird, bis der hyperechoarme Bereich nach PFCnD-Aktivierung auf nur 10 % der Ausgangsfläche zerfällt (Abbildung 6a). Die charakteristische Abklingzeit des normalisierten hyperechoarmen Bereichs ist in der N-Puls-Bildgebung bis zu 3,5-mal länger als im P-Puls. Repräsentative differentielle B-Mode-Bildbilder in der Zeit für jede N-Puls- und P-Puls-Bildgebung sind in Abbildung 6b dargestellt.
Abbildung 1: DLS-Größenmessungen von PFCnDs und Stabilität. (A) Die Größenintensitätsverteilung von Tröpfchen, gemittelt aus drei Messungen von Tröpfchen nach der Synthese (durchschnittlicher PDI: 0,132± 0,016; durchschnittlicher Z-Durchschnitt: 259,3 ± 0,7 nm). (B) Die Größenintensitätsverteilung von Tröpfchen, gemittelt aus drei Messungen, die 24 Stunden nach der Synthese durchgeführt wurden (durchschnittlicher PDI: 0,252± 0,061; durchschnittlicher Z-Durchschnitt: 322,5 ± 4,5 nm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bild und schematische Darstellung der Polyacrylamidform. (A) Abbildung der Form aus Laborband und Kunststoffbehälter. (B) Schematische Darstellung mit Abmessungen des Polyacrylamidphantoms nach Entnahme aus der Form. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Laserpulsabgabe und der Ultraschallbildgebung. (A) Komponenten der Baugruppe werden beschriftet und die Ausrichtung der Laserstrahl-/Ultraschallbildebene relativ zur Einschlussposition dargestellt. (B) Ein Bild, das das tatsächliche Setup zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Simulierter Ultraschall-Bildgebungspuls. Die Wellenformen werden von einer Ultraschall-Bildgebungssystem-Software simuliert, die von 250 MHz abgetastet wird. Die Wellenform von P-Puls und N-Puls wird mit der gleichen Mittenfrequenz und Pulsbreite erzeugt, hat aber eine Phasendifferenz von 180°. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Kontrastmessung. Mittlerer Kontrastwert der Einschließungsfläche für N-Puls und P-Puls, Fehlerbalken stellen Standardabweichung dar (n=3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Charakteristische Zerfallskurve der reflexionsarmen Fläche und der repräsentativen differentiellen B-Mode-Magier . (A) Normalisierter hyperechoreicher Bereich, induziert durch PFCnD-Aktivierung im Laufe der Zeit für N-Puls- und P-Puls-Bildgebung im gleichen Querschnitt. Die gestrichelte Linie zeigt 10% des anfänglichen reflexionsarmen Bereichs an. Der Zeitpunkt, zu dem sich das angepasste Diagramm mit der gestrichelten Linie schneidet, stellt die charakteristische Abklingzeit dar. (B) Die Bilder zeigen ein beschnittenes ROI-Fenster, zentriert auf der Inklusion, dargestellt auf einer dB-Skala mit einem Dynamikbereich von 35. Die obere Reihe zeigt das vom P-Puls abgebildete Verdichtungsverhalten und die untere Reihe den N-Puls. Die gelb gestrichelte Linie zeigt den Einschlussbereich an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Gesamtvolumen des Phantoms (ml) | 50 | 100 | 250 | 500 |
| DI-Wasser (ml) | 37.5 | 74.9 | 187.4 | 375 |
| 40% PA-Lösung (ml) | 12.5 | 25.1 | 62.6 | 125 |
| Siliciumdioxid (mg) | 100 | 200 | 500 | 1000 |
| 10%ige APS-Lösung (μL) | 500 | 1000 | 2500 | 5000 |
| TEMED (μL) | 62.5 | 125 | 312.5 | 625 |
Tabelle 1: Zusammenfassung der Reagenzien und Mengen für die Polyacrylamid-Phantomvernetzung bezogen auf das Formvolumen. Diese Tabelle enthält eine kurze Wertzusammenfassung der verwendeten Reagenzien und Mengen basierend auf mehreren gängigen Formvolumina.
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Discussion
Die Sondenbeschallung ist eine relativ einfache und leicht zu erlernende Methode zur Herstellung von PFCnDs. Es gibt ein paar Schritte, bei denen Vorsicht geboten ist. Beim Umgang mit Chloroform ist es unerlässlich, dass eine Verdrängerpipette oder Glasspritzen verwendet werden, da diese flüchtig ist und aus Standard-Luftverdrängerpipetten "ausläuft". Wenn Sie eine positive Verschiebung verwenden, stellen Sie außerdem sicher, dass eine geeignete Spitze verwendet wird, da Chloroform die meisten Kunststoffspitzen auflöst, die Verunreinigungen in die Lösung einbringen können. Eine Verdrängerpipette oder Glasspritze wird auch für Perfluorhexan empfohlen, da es sowohl flüchtig als auch dichter als Wasser ist. Typischerweise können die einzelnen Effekte von Flüchtigkeit und hoher Dichte reduziert werden, indem Luftverdrängungspipetten vorbenetzt und das auf der Pipette eingestellte Volumen mit einer Waage eingestellt wird. Aber im Falle von Perfluorhexan, das beide Eigenschaften besitzt, wird die Flüchtigkeit es schwierig machen, genaue Gewichtsmessungen zu erhalten, was eine Verdrängungspipette / Glasspritze zur praktikabelsten Option macht.
Bevor die Lösung beschallt wird, ist es wichtig, die Lipid- und Perfluorkohlenstofflösung in einem Eisbad zu inkubieren, damit sie abkühlen kann, um ein Kochen der Perfluorkohlenwasserstoffe während der Beschallung zu verhindern. Dieser Schritt wird besonders wichtig für niedriger siedende Perfluorkohlenwasserstoffe wie Perfluoropentan sein. Darüber hinaus ist Vorsicht geboten, wenn die Lösung beschallt wird. Die Spitze der Ultraschallsonde sollte untergetaucht werden, aber sie sollte keinen Kontakt mit dem Boden oder den Seiten der Glasdurchstechflasche haben, da sie die Spitze beschädigen und die Durchstechflasche zerbrechen und die Lipidlösung in das Eisbad entleeren könnte.
Das PFCnD-Herstellungsprotokoll kann auf einige geringfügige Weise angepasst werden. Wenn in Schritt 1.3 kein Rotationsverdampfer verfügbar ist, kann die Lösung mit einem stetigen Strom von Stickstoffgas getrocknet oder über Nacht in eine Vakuumkammer gegeben werden, um den Lipidkuchen zu bilden. In Bezug auf die Lipide verwendet diese Formulierung ein 9:1-Verhältnis von DSPE-PEG:DSPC im Vergleich zum Standardverhältnis von 1:9 von DSPE-PEG:DSPC, da dies zu kleineren und stabileren Tröpfchen führt23. Diese Formulierung kann angepasst werden, um eine Oberflächenkonjugation zu ermöglichen, indem eine kleine Fraktion (~ 2 mol %) des DSPE-PEG durch ein funktionalisiertes DSPE-PEG mit dem gewünschten Teil (z. B. Biotin, Thiol, Amin usw.) ersetzt wird.
Im Allgemeinen sind Sondenbeschaller kommerziell erhältlich, relativ einfach zu bedienen und können leicht an andere Perfluorkohlenwasserstoffe und Tensidformulierungen mit höherem Siedepunkt angepasst werden, aber sie können nicht verwendet werden, um Tröpfchen mit Perfluorkohlenstoffkernen herzustellen, die bei Raumtemperatur ohne wesentliche Änderungen gasförmig sind. Eine solche Modifikation besteht darin, Sondenbeschallung zu verwenden, um Mikrobläschen zu erzeugen und dann Druck auszuüben und die Temperatur zu reduzieren, um die Mikrobläschen zu Tröpfchen zu kondensieren24. Während diese Methode eine clevere Möglichkeit ist, akustisch verdampfbare Tröpfchen zu erzeugen, ist es schwierig, genügend Farbstoff in den Mikrobläschen einzukapseln, um ODV nach der Kondensation zu gewährleisten. Ein alternativer Ansatz besteht darin, den Farbstoff (z. B. Cy7,5) an die Lipide zu konjugieren und Mikrobläschen zu bilden, die zu ODV-fähigen PFCnDs25 mit niedrigem Siedepunkt kondensiert werden können.
Die Sondenbeschallung erzeugt auch eine hohe Konzentration von Nanotröpfchen (~ 1010 Tröpfchen / ml) in relativ kurzer Zeit. Diese Technik führt jedoch zu einer großen Größenverteilung, die die Menge an extravasierenden Nanotröpfchen reduziert. Während dies durch Zentrifugalfilterung oder Spritzenfilter verbessert werden kann, um größere Tröpfchen zu entfernen, weisen die resultierenden PFCnDs eine größere Polydispersität im Vergleich zu Tröpfchen auf, die mit Hilfe von Mikrofluidik synthetisiert oder durch Extrusion gefiltertwerden 26. Ein weiterer Nachteil der Sondenbeschallung besteht darin, dass die Spitze der Ultraschallsonde während der Beschallung unweigerlich durch Kavitation entsteint wird und regelmäßig ausgetauscht werden muss.
Ein alternativer Ansatz zur Herstellung von Tröpfchen verwendet mikrofluidische Geräte, mit denen Tröpfchen auf eine bestimmte Größe mit einem niedrigen Polydispersitätsindex (PDI) zugeschnitten werden können. Diese Vorrichtungen erzeugen jedoch Tröpfchen mit einer relativ langsamen Rate (~10 4-106 Tröpfchen/s)26 und, obwohl es mehrere Entwicklungen wie die Stufenemulgierung 27 gegeben hat, fließen Spitzenströme in Strömungsfokussiervorrichtungen28,29 und nutzen den Ouzoeffekt mit einem versetzten Fischgräten-Mikromischer30 - Die Erzeugung von Tröpfchen in Nanogröße bleibt eine Herausforderung. Darüber hinaus ist diese Technik nicht kommerziell erhältlich, und die Herstellung dieser Geräte erfordert spezielles Fachwissen.
Andere kommerziell erhältliche Verfahren umfassen Extrusion und Homogenisierung. Bei der Extrusion werden Membranen verwendet, um Tröpfchen durchzuleiten, was zu Tröpfchen in Nanogröße mit einem engeren Größenbereich im Vergleich zur Beschallung führt. Diese Methode ist jedoch stark formulierungsabhängig und es ist schwierig, Farbstoff oder therapeutische Fracht in das Tröpfcheneinzuarbeiten 26. Bei der Hochdruckhomogenisierung werden kommerziell erhältliche Homogenisatoren verwendet, die hohe Druck- und Scherspannungen nutzen, um monodisperse, nanoskalige Lipidpartikel auf skalierbare Weise zu erzeugen31,32,33. Dieses Verfahren wurde angepasst, um Tröpfchen mit perfluorierten Kohlenwasserstoffen32,34 mit hohem und niedrigem Siedepunkt zu erzeugen. Eine ausführlichere Übersicht über Tröpfchenformulierungsmethoden und Probenprotokolle finden Sie im folgenden Review26.
Phantome sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leistung von Nanotröpfchen in vitro zu charakterisieren. In diesem Protokoll werden Polyacrylamid-basierte Phantome mit Kieselsäure verwendet. Die häufigsten Probleme mit Polyacrylamidphantomen hängen mit langsamer oder keiner Polymerisation zusammen. Eine langsame Polymerisation ist zwar weniger problematisch, kann aber zu einer heterogenen Verteilung der eingebetteten Streuung führen. Der häufigste Schuldige für dieses Problem ist die Verwendung alter Lösungen von Ammoniumpersulfat, die die Produktion von freien Radikalen reduzieren, die die Vernetzung initiieren. Dies kann leicht behoben werden, indem die Lösung frisch gemacht wird oder keine vorbereiteten Lösungen verwendet werden, die älter als eine Woche sind. Eine weitere Möglichkeit ist der Abbau von TEMED - dies wird sich in der Bildung eines gelben Niederschlags zeigen. Ein weiteres häufiges Problem ist das Vorhandensein von Luftblasen im polymerisierten Phantom. Eine ordnungsgemäße Entgasung des Wassers und eine sorgfältige Handhabung, um eine übermäßige Oberflächenbewegung zu vermeiden, sollten dieses Problem mildern. Eine alternative Strategie wäre, die gesamte Lösung nach Schritt 2.5 zu entgasen. Dies sollte jedoch aufgrund des Vorhandenseins von Acrylamid in einem Abzug durchgeführt werden.
Diese Phantome eignen sich auch hervorragend für die Abbildung des Verhaltens von eingeschränkten Tröpfchen, um das individuelle Tröpfchenverhalten zu untersuchen. Dies kann durch Hinzufügen von PFCnDs in den Phantom in Schritt 2.4 erfolgen. Da die Vernetzung auf eine chemische Reaktion zurückzuführen ist, wird im Vergleich zu einer physikalischen Vernetzung auf der Grundlage einer oberen kritischen Lösungstemperatur wie Gelatine relativ wenig Wärme erzeugt. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer spontanen Verdampfung der eingebetteten Tröpfchen.
Während es eine Vielzahl von Methoden zur Synthese von Phantomen gibt, erzeugt Polyacrylamid ein relativ haltbares und nicht abbaubares Phantom, das eine geringe akustische Dämpfung35 und einen optischen Absorptionskoeffizienten36 aufweist. Diese Eigenschaften können so eingestellt werden, dass sie die akustischen und optischen Eigenschaften von menschlichem Gewebe besser nachahmen, indem die Konzentration der endgültigen Polyacrylamidlösung eingestellt wird und Partikel wie Siliziumdioxid, Glasperlen oder Titandioxid36 in das Phantom eingeschlossen werden. Darüber hinaus können die mechanischen Eigenschaften der Phantome eingestellt werden, indem der Prozentsatz des Polymergehalts (d. h. Prozentsatz von Acrylamid und Bis(acrylamid)) und des Prozentsatzes des Vernetzers (d. h. der Anteil von Bis(acrylamid) am Gesamtpolymergehalt) geändert wird37. Alternative Phantome umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Agar38, Gelatine39, Polyvinylalkohol (PVA) 40 usw.
Die kritischen Schritte für eine erfolgreiche Bildgebung der aktivierten PFCnD-Verteilung und hyperechogenen Dynamik sind wie folgt. 1) Synchronisieren Sie das Lasersystem (Aktivierungsquelle) und das Ultraschallbildgebungssystem. 2) Richten Sie den Laserquerschnitt sowohl auf die gewünschte Zielregion als auch auf die Ultraschallbildebene aus. 3) Passen Sie die Ultraschallbildgebungsparameter für die PFCnD-Bildgebung an (z. B. Bildrate, Pulswellenform usw.).
Die optische Aktivierung von PFCnD hat gegenüber akustisch aktivierten den spürbaren Vorteil, dass sie akustischen Störungen ausweichen kann, die die Qualität des Ultraschallbildes drastisch verschlechtern, während die Rekondensationsphase rechtzeitig beobachtet wird. Es ist jedoch eine Herausforderung, das Lasersystem räumlich und zeitlich mit dem Ultraschallbildgebungssystem zu integrieren und auszurichten. Die Verwendung eines 3D-gedruckten Halters ermöglicht eine wiederholbare und kontrollierte Lichtabgabe. Die Lichtabgabe kann auch durch Einführen eines Metallstabs in den Einschluss in das Polyacrylamidphantom behoben werden, da der Metallstab einen photoakustischen Kontrast erzeugen sollte, um die Lichtabgabe anzuzeigen. Die zeitliche Synchronisation wurde durch den Aufbau einer zuvor entwickelten Plattform20 erreicht, die sowohl die Synchronisation des Laser- als auch des Bildgebungssystems ermöglicht und gleichzeitig die volle Programmierbarkeit des Verasonics-Bildgebungssystems mit einer benutzerfreundlichen Oberfläche beibehält. Darüber hinaus bietet das Programm konventionelle B-Mode-Bildgebung und photoakustische Bildgebung in Echtzeit, um bei der Fehlersuche und Lokalisierung der Region von Interesse zu helfen, in der PFCnDs verteilt sind. Dieser Aufbau erfordert jedoch einen externen gepulsten Nanosekundenlaser. Derzeit gibt es unseres Wissens einige kommerzielle Systeme, die über integrierte Laser-Ultraschall-Bildgebungssysteme verfügen, die PFCnD-Bildgebung ermöglichen können, z. B. Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 und iTheraMedical (insight 64, inVision 128, inVision 256-TF und inVision 512-echo).
Die ultraschnelle Ultraschallbildgebung des Verdampfungs-Rekondensationsverhaltens von PFCnD leidet hauptsächlich unter geringer Empfindlichkeit. Während die gebräuchlichsten Lösungen zur Verbesserung der Bildempfindlichkeit Multi-Frame-Compounding umfassen, sind diese Techniken durch ihre inhärente Eigenschaft der Verschlechterung der Bildrate begrenzt, da die PFCnD-Bildgebung sehr anfällig für Bewegungsartefakte ist, da sie einen zeitdifferentiellen Prozess beinhaltet. Die Pulspolaritätsmodulation in unserem Protokoll löst dieses Problem in der PFCnD-Bildgebung effektiv, indem sie die akustische Dynamik von verdampften PFCnDs nutzt, um ein unterscheidbareres und längeres Bild zu erhalten, ohne die zeitliche Auflösung überhaupt zu beeinflussen.
Während ODV Tröpfchen mit einzigartigen Fähigkeiten wie wiederholter Verdampfung und photoakustischem Kontrast ermöglicht, hat die Aktivierungsmethode im Vergleich zu Ultraschall eine begrenzte Tiefenpenetration. Da die Lichtdurchdringung begrenzt ist, beschränkt sich die Anwendung auf hauptsächlich oberflächliche Verfahren wie einen Ersatz für die Sentinel-Lymphknotenbiopsie41. Diese Einschränkung kann möglicherweise durch katheterbasierte Lichtabgabesysteme umgangen werden, was eine Aktivierung tief im Gewebe ermöglicht. Da der Kontrast akustisch ist, kann die Verdampfung in einer Tiefe abgebildet werden, die mit ADV vergleichbar ist. Eine alternative Aktivierungstechnik kann die magnetische Tröpfchenverdampfung sein, bei der magnetische Kontrastmittel wie Eisenoxid-Nanopartikel innerhalb des Tröpfchens42 eingekapselt sind. Dies ermöglicht die Verdampfung in jeder Tiefe.
In Zukunft kann die Fähigkeit unseres Protokolls, die hyperechogene Reaktion von PFCnD gleichzeitig abzubilden und zu modulieren, für verschiedene Anwendungen verwendet werden, bei denen eine Überwachung und Manipulation von PFCnD erforderlich ist. Zum Beispiel kann eine längere Erkennungszeit die Bildqualität von hochauflösenden Bildern verbessern, indem eine größere Anzahl von Bildern zum Durchschnitt hinzugefügt wird. Darüber hinaus hat eine präzisere Kontrolle von PFCnD das Potenzial, die Effizienz und Sicherheit von blasenvermittelten Therapeutika wie BBB-Öffnung und Medikamentenabgabe zu erhöhen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde teilweise von der Breast Cancer Research Foundation im Rahmen des Zuschusses BCRF-20-043 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
| L11-4v | Verasonics | - | ultrasound linear array transducer |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
| N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
| Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
| Tempest 30 | New wave research | - | Pulsed laser system |
| Vantage 128 | Verasonics | - | research ultrasound imaging system |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | - | Makes size measurements based on dynamic light scattering |
References
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