Summary
光学的に活性化されたパーフルオロカーボンナノ液滴は、血管系外のイメージングアプリケーションで有望です。この記事では、これらの粒子を合成し、ポリアクリルアミドファントムを架橋し、液滴を音響的に変調して信号を強化する方法を示します。
Abstract
マイクロバブルは、超音波で最も一般的に使用されるイメージング造影剤です。しかしながら、それらのサイズのために、それらは血管区画に限定される。これらのマイクロバブルは、凝縮またはパーフルオロカーボンナノ液滴(PFCnD)として製剤化することができ、それらは浸出するのに十分小さく、次いで標的部位で音響的に誘発される。これらのナノ粒子は、近赤外有機色素またはナノ粒子(例えば、硫化銅ナノ粒子または金ナノ粒子/ナノロッド)などの光学吸収剤を含むことによってさらに強化することができる。光学的にタグ付けされたPFCnDは、光液滴気化(ODV)として知られるプロセスでレーザー照射によって気化することができます。この活性化プロセスにより、画像診断用の最大機械的指数閾値未満では音響的に気化できない高沸点パーフルオロカーボンコアの使用が可能になります。高沸点コアは、気化後に再凝縮する液滴をもたらし、その結果、気化後に一時的にコントラストを生成する「点滅」PFCnDがナノ液滴形態に凝縮します。このプロセスを繰り返してオンデマンドでコントラストを生成できるため、光学変調と音響変調の両方を通じて、バックグラウンドフリーのイメージング、多重化、超解像、コントラスト強調が可能になります。この記事では、プローブ超音波処理を利用して光学的にトリガー可能な脂質シェルPFCnDを合成し、ナノ液滴を特徴付けるためにポリアクリルアミドファントムを作成し、ODV後にPFCnDを音響的に変調してコントラストを改善する方法を示します。
Introduction
マイクロバブルは、軟部組織と比較して生体適合性と優れたエコー源性により、最もユビキタスな超音波造影剤です。これにより、血流、臓器の描写、およびその他のアプリケーションを視覚化するための貴重なツールになります1。ただし、そのサイズ(1〜10μm)は、共振周波数に基づくイメージングには例外的であり、血管系2への適用を制限します。
この制限により、液体パーフルオロカーボンコアの周りに包まれた界面活性剤で構成されるナノエマルジョンであるPFCnDが開発されました。これらのナノ粒子は、200nmという小さなサイズで合成することができ、腫瘍血管系に見られる「漏れやすい」血管系または細孔および開いた開窓を利用するように設計されています。これらの破壊は腫瘍依存性であるが、この透過性は、腫瘍に応じて~200nm〜1.2μmのナノ粒子の溢出を可能にする3,4。それらの初期形態では、これらの粒子は超音波コントラストをほとんどまたはまったく生成しない。音響的または光学的に誘導される気化により、コア相は液体から気体に変化し、直径5,6,7の2.5倍から5倍の増加を誘発し、光音響および超音波コントラストを生成します。音響気化は最も一般的な活性化方法ですが、このアプローチでは、気化のイメージングを制限する音響アーチファクトが作成されます。さらに、ほとんどのパーフルオロカーボンは、8を気化させるために安全閾値を超える機械的指数を有する集束超音波を必要とする。これにより、マイクロバブルをナノ液滴に凝縮することによって合成できる低沸点PFCnDsが開発されました9。しかしながら、これらの液滴はより揮発性であり、自然気化を受けやすい10。
一方、光液滴気化(ODV)は、ナノ粒子11,12,13や色素6,14,15などの光学トリガーの添加を必要とし、ANSI安全限界11内のフルエンスを使用して高沸点のパーフルオロカーボンを気化させることができる。高沸点コアで合成されたPFCnDはより安定であり、気化後に再凝縮するため、バックグラウンドフリーイメージング16、マルチプレックス17、および超解像18が可能になります。これらの技術の主な制限の1つは、高沸点PFCnDが気化後のエコー源性であり、ミリ秒19のスケールの短い時間枠であり、比較的暗いという事実です。この問題は、気化と平均化を繰り返すことで軽減できますが、液滴信号の検出と分離は依然として課題です。
パルス反転からインスピレーションを得て、持続時間およびコントラストは、超音波画像化パルス19の位相を変更することによって増強することができる。希薄化相(nパルス)で超音波イメージングパルスを開始することにより、気化したPFCnDの持続時間とコントラストの両方が増加します。対照的に、超音波イメージングパルスを圧縮位相(pパルス)で開始すると、コントラストが低下し、持続時間が短くなります。この記事では、イメージングで一般的に使用される光学的にトリガー可能なパーフルオロカーボンナノ液滴、ポリアクリルアミドファントムを合成する方法について説明し、音響変調によるコントラストの向上と信号寿命の向上を実証します。
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Protocol
1.パーフルオロカーボンナノ液滴製剤
- 10 mLの丸底フラスコをクロロホルムで洗い流し、10 μLと1 mLの気密ガラスシリンジをクロロホルムで洗い流します。
注意: クロロホルムは揮発性であり、吸入すると有毒になる可能性があります。この溶剤を使ったすべての作業は、ドラフト内で行う必要があります。 - シリンジを使用して、200 μLのDSPE-mPEG2000(25 mg/mL)、6.3 μLの1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC、25 mg/mL)、および1 mLのIR 1048(1 mg/mLのクロロホルム溶液)を丸底フラスコに加えます。ストックの汚染を防ぐために、脂質/染料の間のシリンジをきれいにすることを忘れないでください。
注意: 赤外線染料は光に敏感であり、作業は薄暗い状態で行うか、フラスコをアルミホイルで覆う必要があります。 - ロータリーエバポレーターを利用して溶媒を除去します。衝突を防ぐために、真空がゆっくりと332mbarに調整されていることを確認してください。5分後、圧力を42 mbarに下げて、溶液に入った可能性のある水を取り除きます。
注:脂質ケーキは、パラフィルムで覆われた丸底フラスコに4°Cで一晩保存できます。 - 脂質ケーキをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の1mLに懸濁し、室温で5分間、または脂質ケーキのすべてが懸濁して溶液に溶解するまで超音波処理またはボルテックスする。溶液を均質化するためにさらに2分間超音波処理する。
- 溶液を7 mLのガラスバイアルに移し、バイアルを氷で満たされたガラス皿に入れて溶液を5分間冷ましてから、気密ガラスシリンジを使用して50 μLのペルフルオロヘキサンを加えます。シリンジをバイアルに分注する前に、ペルフルオロヘキサンでシリンジをすすぐことを忘れないでください。
- 脂質と氷浴を含むガラスバイアルをプローブ超音波処理器の筐体に置き、プローブの先端をミニスカスの下に沈めます。超音波処理器プローブの側面がガラスバイアルの唇に触れないようにしてください。
- プローブは、次の設定で混合物を超音波処理します:振幅1、処理時間:20秒、パルスオン:1秒、パルスオフ:5秒。次に、次の設定で超音波処理します:振幅:50、処理時間:5秒、パルスオン:1秒、パルスオフ:10秒。
- ナノ液滴溶液を1.5 mLの遠沈管に移し、300 x g で3分間遠心分離して、大きな液滴(>1 μm)を小さな液滴から分離します。
- ペレットを廃棄し、上清を別の1.5 mL遠沈管に移します。3000 x g で5分間遠心分離して上清を洗浄し、溶液中のすべての液滴をペレット化します。ペレットを上下にピペッティングして1mLのPBSにPFCnDを再懸濁し、バス超音波処理器で1分間超音波処理します。
- 動的光散乱(DLS)を使用して液滴のサイズを測定します。ストックPFCnDを100倍(990μLのPBSに10μLのPFCnDストック)で希釈し、測定前にPFCnDを分散させるために浴超音波処理する。代表的な結果を 図1に示す。
- ナノ粒子追跡分析装置を使用してPFCnDの濃度を決定します( 材料の表を参照)。PFCnDを100〜1000倍希釈して、濃度を正確に測定できるようにします。このプロトコルでは、通常、1010 粒子/mL程度の濃度で液滴を生成します。
- 50 mLの遠心チューブに10 mLの超音波カップリングゲルを調製し、1%(v / v)または100 μLのPFCnDを加えて、~108 粒子/ mLの溶液を作ります。混合する溶液を渦巻きます。混合物を4000 x g で3分間遠心分離して気泡を除去します。
2.ポリアクリルアミドファントム製剤
- 500 mLの真空フラスコに400 mLの脱イオン水を満たして水を脱気し、ゴム製のコルクで密封し、フラスコを真空ラインに接続します。真空ラインを開き、フラスコの底をバス超音波処理器に沈めます。5分間、または気泡の形成が見られなくなるまで超音波処理します。
- 500 mgを5 mLの脱気水に溶解して、10%過硫酸アンモニウム(APS)溶液を調製します。過硫酸アンモニウムが完全に溶解しない場合は、溶液を静かに回転させます。
- 攪拌プレート上に攪拌子を付けた400 mLビーカーに、150 mLの脱気水と50 mLの40%(w / v)アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液を加えて、200 mLの10%アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液を形成します。混合物を200rpmで攪拌して、気泡を導入せずに適切に混合できるようにします。
注意: アクリルアミドは発がん性物質であり、特に粉末状のアクリルアミドを使用する場合は、すべての作業は手袋付きのドラフトフードで行う必要があります。 - 400 mgのシリカを計量し、ステップ2.3の10%アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液に加えて、0.2%(w / v)のシリカとアクリルアミド溶液を形成します。
注意: シリカを吸入すると発がん性物質になる可能性があります。計量を含むすべての作業は、ドラフト内で行う必要があります。 - プラスチック製トランスファーピペットから先端を切り取り、ラボテープで金型に支えて、円筒形の介在物を備えた58 mm x 58 mm x 78 mmの正方形の金型を準備します。 図2を参照してください。
- ビーカーに2 mLの10 % APS溶液を加えて最終濃度を0.1% APSにし、250 μLのテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)をファントム溶液に加えます。溶液を短時間(1分未満)攪拌します。
- 溶液に気泡を入れないように注意しながら、溶液を型にすばやく流し込みます。溶液は10分以内に重合するはずです。ラボスパチュラの平らな端を金型の端に巻き付け、金型を反転させて、ファントムを取り外します。
注意: これらのファントムは複数回再利用できるため、水に浸して4°Cで保管する必要があります。
3. パーフルオロカーボンナノ液滴イメージング
- メーカーの指示に従って、パルスレーザーシステムの電源を入れ、~20分間ウォームアップします。光ファイバーバンドルがレーザー出力に正しく接続され、2本の脚がファイバーバンドルホルダー内に正しく配置されていることを確認します。
- 超音波イメージングシステムの電源を入れ、アレイイメージングトランスデューサ(L11-4v)をシステムに接続し、トランスデューサをホルダー内に固定して、イメージング面をレーザー断面に合わせます。
- レーザーシステムのパルス繰り返し周波数を10Hzに設定し、ファイバーバンドルの端にパワーメーターを配置してエネルギーを測定します。推定フルエンスが70 mJ/cm2になるまでqスイッチ遅延を調整します。
注意: レーザーを発射するときは適切な眼鏡を着用し、レーザーカーテンがスペースを囲む必要があります。 - 1 mLのプラスチックスリップチップシリンジを使用して、ポリアクリルアミドファントムのチャネルの1つを超音波ゲル/ PFCnD混合物で埋め戻します。チャネルの上部を超音波ゲルで自由に覆い、1 mLのプラスチックスリップチップシリンジで気泡を取り除きます。 図3に示すように、ポリアクリルアミドファントムをトランスデューサとファイバーバンドルの下に配置します。
- ソフトウェア20 に基づく複合レーザ超音波および弾性(CLUE)イメージングプラットフォームを使用して、光学活性化と同期したPFCnDを画像化する。イメージング用の Param 構造体の一般的なユーザー定義パラメータを変更します:開始/終了深度を0 / 40mmに、中心周波数を6.9MHzに、探触子名を「L11-4v」に設定します。
- 新しい RunCase を定義し、PFHnDの繰り返し光学活性化/再凝縮およびUSイメージングのためのモジュールシーケンスを設計します。これは、超高速イメージング(mUF)、外部レーザー(mExtLaser)、アイドル(mIdle)などの事前定義されたモジュールをリストすることによって行われます。
- シーケンスセット mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF を2回繰り返して、nパルスとpパルスの両方のイメージングデータを取得します。
注意: 各シーケンスの最初のmExtLaserモジュールは、ExtLaser.Enableを0に設定することにより偽レーザーとして設定され、レーザーアクティベーション後の背景US画像とn/pパルスUS画像の間の時間を最小限に抑えるために「mIdle」が含まれています。
- シーケンスセット mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF を2回繰り返して、nパルスとpパルスの両方のイメージングデータを取得します。
- 現在の実行ケースのモジュールシーケンスに配置された各モジュールのモジュールパラメータを設定します。各モジュール パラメーターには、モジュール シーケンスの順序に対応するインデックスでアクセスします。モジュールは、ユーザーがここで設定したモジュールパラメータを使用して事前定義された操作を実行します。
- 外部レーザーモジュールの ExtLaser.QSdelayを、手順3.3 で調整したレーザーQスイッチ遅延の値をマイクロ秒単位で設定します。このモジュールは、レーザーシステムのフラッシュランプトリガーが出力されるのを待ち、 QSdelayで指定された遅延の後にQスイッチトリガーを生成します。
- 超高速イメージングモジュールでは、 Resource.numFrame を100に設定し、 SeqControl.PRI を200(μs)に設定し、 TW.polarity をPパルスの場合は1、Nパルスの場合は-1に設定します(対応するパルス形状については 図4 を参照してください)。このモジュールは、 TW.polarityで指定されたパルスタイプの超高速0度平面波を送信します。
- Resource.numFrameのフレーム数、SeqControl.PRIのパルス繰り返し間隔に対して38.8mm幅のフルアパーチャイメージングウィンドウを取得し、オフライン処理用のデータを保存します。
- アイドル・モジュールの SeqControl.lastPRI_Module を、レーザー・パルスからQスイッチ遅延を差し引いた時間(100ms)、画像データ・アクイジション時間(20ms)、および信号が伝わる20μsのマージンに設定します。このモジュールは、イメージングデータ取得の終了から次のレーザーパルス励起までの時間ギャップを埋めるために 、システムをSeqControl.lastPRI_Module 時間「動作なし」状態に保ちます。
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Representative Results
PFCnDの製剤化と遠心分離が成功すると、直径200〜300 nmのサイズの液滴が得られるはずです(図1A)。不適切に分離された液滴は、1μm付近に小さなピークを示すことがあります。これらの溶液は、より大きな液滴を分解するためにさらに浴超音波処理することができる。液滴のサイズは、オストワルド熟成21,22として知られるプロセスでの合体および/または拡散により、時間とともに増加します(図1B)。
イメージングパルスを操作することによる液滴の音響変調は、気化したPFCnDのコントラストを改善した。これは、ビーム形成画像の隣接するフレームを差し引いて再構成されたPFCnD画像で実証され、気化したPFCnDから返された信号のみが可視され、静止したバックグラウンド信号が抑制されます。コントラストは、平均バックグラウンド信号に対する円形包接領域の平均信号と平均バックグラウンド信号との差の比によって定量化される。バックグラウンド信号は、介在物と同じ深さと同等の領域にあるバックグラウンドの2つの長方形のROIからの信号によって定義されます。Nパルスの介在物とのコントラストは、Pパルスの約3.2倍(220%改善)です(図5)。
逆イメージングパルスは、PFCnD気化からの信号の寿命も延ばしました。これは、バックグラウンド信号を超える円形の包含領域内のピクセルを閾値化することによって定量化した。閾値を上回った介在物中の画素の割合を高エコー領域(%)と定義した。PFCnDの高エコー発生挙動を経時的に調べるために、高エコー領域をフレームごとに計算し、最初のフレームの高エコー領域で正規化してから、指数関数的減衰モデルに適合させます。この関数は、PFCnD活性化後の高エコー領域が初期領域のわずか10%に減衰するのにかかる時間として定義される特性減衰時間を決定するために使用されました(図6a)。正規化された高エコー領域の特徴的な減衰時間は、Pパルスと比較してNパルスイメージングで最大3.5倍長くなります。各NパルスおよびPパルス撮像の時間における代表的なBモード微分画像フレームを 図6bに示す。
図1:PFCnDのDLSサイズ測定と安定性。 (A)合成後の液滴の3回の測定から平均した液滴のサイズ強度分布(平均PDI:0.132±0.016、平均Z平均:259.3±0.7nm)。(B)合成24時間後の3回の測定で平均した液滴のサイズ強度分布(平均PDI:0.252±0.061、平均Z平均:322.5±4.5nm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ポリアクリルアミドモールドのイメージと概略図 。 (A)ラボテープとプラスチック容器で作られた金型の画像。(b)金型から取り出した後のポリアクリルアミドファントムの測定結果を含む概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:レーザーパルス配信と超音波イメージングの概略図。 (A)アセンブリの構成要素にラベルが付けられ、介在物位置に対するレーザビーム/超音波画像化面の位置合わせが図示される。(B)実際のセットアップを示す画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:シミュレートされた超音波イメージングパルス。 波形は、250MHzでサンプリングされた超音波画像システムソフトウェアによってシミュレートされます。PパルスとNパルスの波形は、同じ中心周波数とパルス幅で生成されますが、位相差は180°です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:コントラスト測定。 NパルスおよびPパルスに対する包含領域の平均コントラスト値、エラーバーは標準偏差(n=3)を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:高エコー領域と代表的な微分Bモード魔術師の特性減衰曲線。 (A)PFCnD活性化によって誘起される正規化された高エコー領域を、同じ断面でのNパルスおよびPパルスイメージングで経時的に。点線は、最初の高エコー領域の10%を示しています。適合プロットが点線と交差する時間は、特性減衰時間を表します。(B)画像は、インクルージョンを中心としたトリミングされたROIウィンドウを、ダイナミックレンジ35のdBスケールでプロットしたものです。上段はPパルスで撮像された再凝縮挙動、下段はNパルスです。黄色の破線は包含領域を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ファントムの総容量(mL) | 50 | 100 | 250 | 500 |
| 純水(ミリリットル) | 37.5 | 74.9 | 187.4 | 375 |
| 40%PA溶液(mL) | 12.5 | 25.1 | 62.6 | 125 |
| シリカ(mg) | 100 | 200 | 500 | 1000 |
| 10%APS溶液(μL) | 500 | 1000 | 2500 | 5000 |
| テメッド (μL) | 62.5 | 125 | 312.5 | 625 |
表1:金型容積に基づくポリアクリルアミドファントム架橋の試薬と量の概要。 この表は、使用される試薬と、いくつかの一般的なモールドボリュームに基づく量の簡潔な値の概要を提供します。
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Discussion
プローブ超音波処理は、PFCnDを作製するための比較的簡単で習得しやすい方法です。注意が必要ないくつかのステップがあります。クロロホルムを取り扱う際には、揮発性であり、標準的な空気置換ピペットから「漏れる」ため、容積式ピペットまたはガラスシリンジを使用することが不可欠です。さらに、正の変位を使用する場合は、クロロホルムがほとんどのプラスチックチップを溶解し、溶液に汚染物質を導入する可能性があるため、適切なチップが使用されていることを確認してください。ペルフルオロヘキサンには、揮発性で水よりも密度が高いため、容積式ピペットまたはガラスシリンジも推奨されます。通常、揮発性と高密度の個々の影響は、空気置換ピペットで事前に湿潤し、スケールを使用してピペットに設定された容量をそれぞれ調整することで低減できます。しかし、両方の特性を持つパーフルオロヘキサンの場合、揮発性により正確な重量測定値を得ることが困難になるため、容積式ピペット/ガラスシリンジが最も実行可能な選択肢になります。
プローブ溶液を超音波処理する前に、超音波処理中にパーフルオロカーボンを沸騰させないように冷却するために、氷浴中で脂質およびパーフルオロカーボン溶液をインキュベートすることが重要です。この工程は、パーフルオロペンタンなどの低沸点パーフルオロカーボンにとって特に重要であろう。さらに、プローブが溶液を超音波処理する際には注意が必要です。超音波処理プローブの先端は水没する必要がありますが、チップを損傷し、バイアルを粉砕し、脂質溶液を氷浴に空にする可能性があるため、ガラスバイアルの底部または側面と接触しないでください。
PFCnD製造プロトコルは、いくつかのマイナーな方法で適合させることができます。ステップ1.3でロータリーエバポレーターが利用できない場合は、溶液を窒素ガスの定常流で乾燥するか、真空チャンバーに一晩入れて脂質ケーキを形成することができます。脂質に関して、この製剤は、DSPE-PEG:DSPCの標準的な1:9の比率と比較して、9:1のDSPE-PEG:DSPC比を利用し、より小さく、よりサイズ安定性のある液滴をもたらすからである23。この製剤は、DSPE-PEGのごく一部(~2mol%)を所望の部分(例えば、ビオチン、チオール、アミンなど)を有する官能化DSPE-PEGで置換することによって、表面結合を可能にするように適合させることができる。
一般に、プローブ超音波処理器は市販されており、比較的使いやすく、他の高沸点パーフルオロカーボンおよび界面活性剤製剤に容易に適合させることができるが、室温で気体であるパーフルオロカーボンコアを有する液滴を有意な変更なしに作製するために使用できない。そのような変更の1つは、プローブ超音波処理を利用してマイクロバブルを作成し、次に圧力を適用し、温度を下げてマイクロバブルを液滴24に凝縮させることである。この方法は音響的に気化可能な液滴を生成する巧妙な方法ですが、凝縮後のODVを確保するのに十分な色素をマイクロバブル内にカプセル化することは困難です。別のアプローチは、色素(例えば、Cy7.5)を脂質に結合させ、ODV可能な低沸点PFCnDs25に凝縮することができるマイクロバブルを形成することである。
プローブ超音波処理はまた、比較的短時間で高濃度のナノ液滴(~1010 液滴/ mL)を生成します。しかしながら、この技術は、浸出するナノ液滴の量を減らすであろう大きなサイズ分布をもたらす。これは、より大きな液滴を除去するために遠心濾過またはシリンジフィルターによって改善することができるが、得られたPFCnDは、マイクロ流体を用いて合成された液滴または押出成形によって濾過された液滴と比較して、より大きな多分散性を示すであろう26。プローブ超音波処理のもう一つの欠点は、超音波処理プローブチップが超音波処理中にキャビテーションから必然的にピットになり、定期的に交換する必要があることです。
液滴を作成するための代替アプローチは、低い多分散指数(PDI)で液滴を特定のサイズに調整するために使用できるマイクロ流体デバイスを利用します。しかしながら、これらの装置は比較的遅い速度(~104-10 6液滴/s)26で液滴を生成し、ステップ乳化27、フローフォーカシング装置28,29におけるチップストリーミング、および千鳥ヘリンボーンマイクロミキサー30によるウーゾ効果の利用などのいくつかの開発があった。 -ナノサイズの液滴の生成は依然として困難です。さらに、この技術は市販されておらず、これらのデバイスの作製には専門的な専門知識が必要です。
市販されている他の方法には、押出および均質化が含まれる。押し出しは、膜を利用して液滴を通過させ、超音波処理と比較して狭いサイズ範囲を有するナノサイズの液滴をもたらす。しかしながらこの方法は製剤に大きく依存しており、液滴26内に色素または治療用貨物を組み込むことは困難である。高圧均質化は、高圧および剪断応力を利用して、スケーラブルな方法で単分散のナノスケールの脂質粒子を生成する市販のホモジナイザーを利用する31,32,33。この方法は、高沸点および低沸点のペルフルオロカーボン32,34を有する液滴を生成するように適合されている。液滴製剤法およびサンプルプロトコルのより実質的なレビューは、以下のレビュー26で見出すことができる。
ファントムは、 in vitroでのナノ液滴の性能を特徴付けるための貴重なツールです。このプロトコルでは、シリカを含むポリアクリルアミドベースのファントムが使用されます。ポリアクリルアミドファントムで最も頻繁な問題は、重合が遅いかまったくないことに関連しています。遅い重合は、問題はそれほど問題ではありませんが、埋め込み散乱の不均一な分布につながる可能性があります。この問題の最も一般的な原因は、架橋を開始するフリーラジカルの生成を減らす過硫酸アンモニウムの古い溶液の使用です。これは、ソリューションを新鮮にするか、1週間以上経過した準備されたソリューションを使用しないことで簡単に対処できます。他の可能性はTEMEDの分解である - これは黄色の沈殿物の形成において明らかであろう。もう1つの一般的な問題は、重合ファントム内の気泡の存在です。水を適切に脱気し、過度の表面攪拌を避けるための注意深い取り扱いにより、この問題を軽減できるはずです。別の戦略は、ステップ2.5の後にソリューション全体を脱ガスすることです。ただし、これはアクリルアミドが存在するため、ドラフト内で実行する必要があります。
これらのファントムは、制限された液滴の挙動をイメージングして個々の液滴の挙動を研究するのにも優れています。これは、ステップ 2.4 でファントムに PFCnD を追加することで実行できます。さらに、架橋は化学反応によるものであるため、ゼラチンのような上限臨界溶液温度に基づく物理的架橋と比較して、比較的少ない熱が発生する。これにより、埋め込まれた液滴が自然気化する確率が低くなります。
ファントムを合成するための様々な方法があるが、ポリアクリルアミドは、低い音響減衰35 および光吸収係数36を有する比較的耐久性があり、非分解性のファントムを生成する。これらの特性は、最終的なポリアクリルアミド溶液の濃度を調整し、シリカ、ガラスビーズ、または二酸化チタンなどの粒子をファントムに含めることによって、ヒト組織の音響的および光学的特性をより厳密に模倣するように調整することができる36。さらに、ファントムの機械的特性は、ポリマー含有量の割合(すなわち、アクリルアミドおよびビス(アクリルアミド)の割合)および架橋剤の割合(すなわち、総ポリマー含有量におけるビス(アクリルアミド)の割合)を変更することによって調整することができる37。代替ファントムとしては、寒天38、ゼラチン39、ポリビニルアルコール(PVA)40などが挙げられるが、これらに限定されない。
活性化PFCnD分布と高エコー原性ダイナミクスのイメージングを成功させるための重要なステップは次のとおりです。1)レーザーシステム(アクティベーションソース)と超音波イメージングシステムを同期させます。2)レーザー断面をターゲットの関心領域と超音波イメージング面の両方に合わせます。3)PFCnDイメージングに適した超音波イメージングパラメータ(フレームレート、パルス波形など)を調整します。
PFCnDの光学活性化は、音響活性化されたものに比べて顕著な利点があり、超音波画像の品質を劇的に低下させる音響干渉を回避しながら、その再凝縮段階を時間内に観察することができます。しかし、レーザーシステムを超音波画像システムと空間的および時間的に統合して位置合わせすることは困難です。3Dプリントされたホルダーを使用することで、再現性があり制御された光の供給が可能になります。金属棒は光の供給を示すために光音響コントラストを生成する必要があるため、金属棒をポリアクリルアミドファントムのインクルージョンに挿入して、光の伝達をトラブルシューティングすることもできます。時間的同期は、以前に開発されたプラットフォーム20を構築することによって達成され、ユーザーフレンドリーなインターフェースを備えたVerasonicsイメージングシステムの完全なプログラマビリティを維持しながら、レーザーシステムとイメージングシステムの両方の同期を可能にします。さらに、このプログラムは、PFCnDが分布している関心領域のトラブルシューティングと特定を支援するために、リアルタイムの従来のBモードイメージングと光音響イメージングを提供します。ただし、この設定には外部ナノ秒パルスレーザーが必要です。現在、私たちの知る限り、PFCnDイメージングを可能にするレーザー超音波イメージングシステムを統合した商用システムがいくつかあります(例えば、ビジュアルソニックス(Vevo LAZR、Vevo LAZR-X、Vevo 3100、Vevo F2)、Endera Nexus 128、およびiTheraMedical(insight 64、inVision 128、inVision 256-TF、およびinVision 512-echo)。
PFCnDの気化-再凝縮挙動の超高速超音波イメージングは、主に低感度に苦しんでいます。画像感度向上のための最も一般的なソリューションにはマルチフレームコンパウンディングが含まれますが、PFCnDイメージングは時間微分プロセスを含むという点でモーションアーチファクトに対して非常に脆弱であるため、これらの手法はフレームレートを低下させるという固有の特性によって制限されます。私たちのプロトコルのパルス極性変調は、気化したPFCnDの音響ダイナミクスを利用して、時間分解能にまったく影響を与えずに、より識別可能で長い画像を取得することにより、PFCnDイメージングにおけるこの問題に効果的に対処します。
ODVは、繰り返しの気化や光音響コントラストなどの独自の機能を備えた液滴を可能にしますが、活性化法は超音波と比較して深さの浸透が制限されています。光の浸透が制限されているため、これは、センチネルリンパ節生検41の代替品などの主に表面的な手順にアプリケーションを制限します。この制限は、カテーテルベースの光送達システムを介して潜在的に回避することができ、組織の深部での活性化を可能にする。コントラストが音響的であるため、ADVに匹敵する深さで気化を画像化することができます。代替の活性化技術は、酸化鉄ナノ粒子などの磁気造影剤が液滴42内に封入される磁気液滴気化であり得る。これにより、任意の深さでの気化が可能になります。
将来的には、PFCnDの高エコー応答を同時に画像化および変調するプロトコルの機能は、PFCnDの監視と操作が必要ないくつかのアプリケーションに使用できます。例えば、検出可能時間を長くすると、平均するフレーム数を増やすことで、超解像イメージングの画質を向上させることができます。さらに、PFCnDのより正確な制御は、BBB開口や薬物送達などのバブル媒介治療薬の効率と安全性を高める可能性があります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究の一部は、BCRF-20-043の助成金の下で乳がん研究財団によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
| L11-4v | Verasonics | - | ultrasound linear array transducer |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
| N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
| Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
| Tempest 30 | New wave research | - | Pulsed laser system |
| Vantage 128 | Verasonics | - | research ultrasound imaging system |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | - | Makes size measurements based on dynamic light scattering |
References
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