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Bioengineering

Formulazione e modulazione acustica di nanogoccioline di perfluorocarburi vaporizzate otticamente

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62814
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

Le nanogoccioline di perfluorocarburo attivate otticamente mostrano risultati promettenti nelle applicazioni di imaging al di fuori del sistema vascolare. Questo articolo dimostrerà come sintetizzare queste particelle, reticolare i fantasmi di poliacrilammide e modulare acusticamente le goccioline per migliorare il loro segnale.

Abstract

Le microbolle sono l'agente di contrasto di imaging più comunemente usato negli ultrasuoni. Tuttavia, a causa delle loro dimensioni, sono limitati ai compartimenti vascolari. Queste microbolle possono essere condensate o formulate come nanogoccioline di perfluorocarburi (PFCnD) che sono abbastanza piccole da stravasare e quindi essere attivate acusticamente nel sito bersaglio. Queste nanoparticelle possono essere ulteriormente migliorate includendo un assorbitore ottico come colorante organico nel vicino infrarosso o nanoparticelle (ad esempio, nanoparticelle di solfuro di rame o nanoparticelle d'oro / nanobarre). I PFCnD etichettati otticamente possono essere vaporizzati attraverso l'irradiazione laser in un processo noto come vaporizzazione ottica delle gocce (ODV). Questo processo di attivazione consente l'uso di nuclei di perfluorocarburi ad alto punto di ebollizione, che non possono essere vaporizzati acusticamente al di sotto della soglia massima dell'indice meccanico per la diagnostica per immagini. I nuclei con un punto di ebollizione più alto producono goccioline che si ricondensano dopo la vaporizzazione, con conseguente PFCnD "lampeggiante" che producono brevemente contrasto dopo la vaporizzazione prima di condensarsi di nuovo in forma di nanogocce. Questo processo può essere ripetuto per produrre contrasto su richiesta, consentendo l'imaging senza sfondo, il multiplexing, la super-risoluzione e il miglioramento del contrasto attraverso la modulazione ottica e acustica. Questo articolo dimostrerà come sintetizzare PFCnD a guscio lipidico attivabili otticamente utilizzando la sonicazione della sonda, creare fantocci in poliacrilammide per caratterizzare le nanogoccioline e modulare acusticamente i PFCnD dopo ODV per migliorare il contrasto.

Introduction

Le microbolle sono l'agente di contrasto ad ultrasuoni più diffuso grazie alla loro biocompatibilità e all'eccellente ecogenicità rispetto ai tessuti molli. Questo li rende strumenti preziosi per visualizzare il flusso sanguigno, la delineazione degli organi e altre applicazioni1. Tuttavia, le loro dimensioni (1-10 μm), che li rendono eccezionali per l'imaging in base alla loro frequenza di risonanza, limitano le loro applicazioni al sistema vascolare2.

Questa limitazione ha portato allo sviluppo di PFCnD, che sono nano-emulsioni composte da un tensioattivo racchiuso attorno a un nucleo di perfluorocarburi liquido. Queste nanoparticelle possono essere sintetizzate a dimensioni fino a 200 nm e sono progettate per sfruttare la vascolarizzazione o i pori "permeabili" e le fenestrature aperte presenti nel sistema montante tumorale. Mentre queste interruzioni sono dipendenti dal tumore, questa permeabilità consente lo stravaso di nanoparticelle da ~ 200 nm - 1,2 μm a seconda del tumore 3,4. Nella loro forma iniziale, queste particelle producono poco o nessun contrasto ad ultrasuoni. Dopo la vaporizzazione - indotta acusticamente o otticamente - la fase centrale cambia da liquido a gas, inducendo un aumento da due e mezzo a cinque volte del diametro 5,6,7 e generando contrasto fotoacustico e ultrasonico. Mentre la vaporizzazione acustica è il metodo di attivazione più comune, questo approccio crea artefatti acustici che limitano l'imaging della vaporizzazione. Inoltre, la maggior parte dei perfluorocarburi richiede ultrasuoni focalizzati con un indice meccanico oltre la soglia di sicurezza per vaporizzare8. Ciò ha portato allo sviluppo di PFCnD con punto di ebollizione inferiore, che possono essere sintetizzati condensando microbolle in nanogoccioline9. Tuttavia, queste goccioline sono più volatili e soggette a vaporizzazione spontanea10.

La vaporizzazione ottica delle gocce (ODV), d'altra parte, richiede l'aggiunta di un trigger ottico come le nanoparticelle 11,12,13 o il colorante 6,14,15 e può vaporizzare perfluorocarburi con punto di ebollizione più alto utilizzando fluenze entro il limite di sicurezza ANSI 11. I PFCnD sintetizzati con nuclei con punto di ebollizione più alto sono più stabili e si ricondensano dopo la vaporizzazione, consentendo l'imaging senza sfondo16, il multiplexing 17 e la super-risoluzione18. Uno dei principali limiti di queste tecniche è il fatto che i PFCnD ad alto punto di ebollizione sono ecogenici dopo la vaporizzazione solo per un breve periodo di tempo, sulla scala dei millisecondi19, e sono relativamente deboli. Mentre questo problema può essere mitigato attraverso vaporizzazioni ripetute e la media, il rilevamento e la separazione del segnale delle goccioline rimane una sfida.

Prendendo ispirazione dall'inversione del polso, la durata e il contrasto possono essere migliorati modificando la fase dell'impulso di imaging ad ultrasuoni19. Avviando l'impulso di imaging ad ultrasuoni con una fase di rarefazione (n-impulso), aumenta sia la durata che il contrasto dei PFCnD vaporizzati. Al contrario, l'avvio dell'impulso di imaging a ultrasuoni con una fase di compressione (p-pulse), si traduce in un contrasto ridotto e in una durata più breve. Questo articolo descriverà come sintetizzare nanogoccioline di perfluorocarburi attivabili otticamente, fantocci di poliacrilammide comunemente usati nell'imaging e dimostrare il miglioramento del contrasto e una migliore longevità del segnale attraverso la modulazione acustica.

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Protocol

1. Formulazione di nanogoccioline di perfluorocarburo

  1. Risciacquare un matraccio a fondo tondo da 10 mL con cloroformio e lavare una siringa di vetro a tenuta di gas da 10 μL e 1 mL con cloroformio aspirando ripetutamente l'intero volume della siringa ed espellendolo per un totale di tre volte.
    ATTENZIONE: Il cloroformio è volatile e può essere tossico se inalato. Tutti i lavori con questo solvente devono essere eseguiti in una cappa aspirante.
  2. Utilizzando le siringhe, aggiungere 200 μL di DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL di 1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, 25 mg/ml) e 1 mL di IR 1048 (1 mg/ml in cloroformio) nel matraccio a fondo rotondo. Ricordarsi di pulire le siringhe tra lipidi/colorante per evitare la contaminazione del materiale.
    NOTA: i coloranti a infrarossi sono sensibili alla luce e il lavoro deve essere svolto in condizioni di scarsa luminosità o i palloni devono essere coperti con un foglio di alluminio.
  3. Rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante. Assicurarsi che il vuoto sia regolato lentamente a 332 mbar per evitare urti. Dopo 5 minuti, ridurre la pressione a 42 mbar per rimuovere l'acqua eventualmente entrata nella soluzione.
    NOTA: Il panello lipidico può essere conservato per una notte in un matraccio a fondo rotondo coperto di parafilm a 4 °C.
  4. Sospendere la torta lipidica in 1 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e sonicare o vortice a temperatura ambiente per 5 minuti o fino a quando tutta la torta lipidica è stata sospesa e sciolta nella soluzione. Sonicare per altri 2 minuti per omogeneizzare la soluzione.
  5. Trasferire la soluzione in un flaconcino di vetro da 7 mL e porre il flaconcino in un piatto di vetro riempito di ghiaccio per consentire alla soluzione di raffreddarsi per 5 minuti prima di aggiungere 50 μL di perfluoroesano utilizzando una siringa di vetro a tenuta di gas. Ricordarsi di sciacquare la siringa con perfluoroesano prima di erogarla nel flaconcino.
  6. Posizionare il flaconcino di vetro contenente i lipidi e il bagno di ghiaccio nell'involucro del sonicatore della sonda e immergere la punta della sonda sotto il miniscus. Assicurarsi che i lati della sonda sonicatore non tocchino il labbro del flaconcino di vetro.
  7. Sonda sonicare la miscela con le seguenti impostazioni: Ampiezza 1, Tempo di processo: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Quindi sonicare con le seguenti impostazioni: Ampiezza: 50, Tempo di processo: 5 s, Pulse-on: 1 s, Pulse-off: 10 s.
  8. Trasferire la soluzione di nanogoccia in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 300 x g per 3 minuti per separare le goccioline più grandi (>1 μm) dalle goccioline più piccole.
  9. Scartare il pellet e trasferire il surnatante in un'altra provetta da centrifuga da 1,5 ml. Lavare il surnatante centrifugando a 3000 x g per 5 minuti per pellettare tutte le goccioline in soluzione. Risospendere i PFCnD in 1 mL di PBS pipettando il pellet su e giù e quindi sonicare in un sonicatore da bagno per 1 minuto.
  10. Misurare la dimensione delle goccioline utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS). Diluire i PFCnD stock di 100 volte (10 μL di stock di PFCnD in 990 μL di PBS) e sonicare il bagno per disperdere i PFCnD prima della misurazione. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 1.
  11. Determinare la concentrazione dei PFCnD utilizzando l'analizzatore di tracciamento delle nanoparticelle (vedere Tabella dei materiali). Diluire i PFCnD di 100-1000 volte per garantire una misurazione accurata della concentrazione. Il protocollo produce tipicamente goccioline ad una concentrazione dell'ordine di 1010 particelle / ml.
  12. Preparare 10 ml di gel di accoppiamento ad ultrasuoni in una provetta da centrifuga da 50 mL e aggiungere l'1% (v/v) o 100 μL di PFCnD per ottenere una soluzione di ~108 particelle/ml. Vortex la soluzione da miscelare. Centrifugare la miscela a 4000 x g per 3 minuti per rimuovere le bolle.

2. Preparazione fantasma di poliacrilammide

  1. Degasare l'acqua riempiendo un matraccio sottovuoto da 500 ml con 400 ml di acqua deionizzata, sigillare con un tappo di gomma e collegare il pallone alla linea del vuoto. Aprire la linea del vuoto e immergere il fondo del pallone nel sonicatore da bagno. Sonicare per 5 minuti o fino a quando non è visibile la formazione di bolle di gas.
  2. Preparare una soluzione di persolfato di ammonio (APS) al 10% sciogliendo 500 mg in 5 ml di acqua degassata. Ruotare delicatamente la soluzione se il persolfato di ammonio non si dissolve completamente.
  3. In un becher da 400 mL con una barra di agitazione su una piastra di agitazione, aggiungere 150 mL di acqua degassata e 50 mL di soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 40% (p/v) per formare 200 ml di soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 10%. Mescolare il composto a 200 giri / min per consentire la corretta miscelazione senza introdurre bolle.
    ATTENZIONE: L'acrilammide è cancerogeno e tutto il lavoro deve essere svolto in una cappa aspirante con guanti, specialmente se si lavora con acrilammide in polvere.
  4. Pesare 400 mg di silice e aggiungerli alla soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 10% dal punto 2.3 per formare una soluzione allo 0,2 % (p/v) di silice e acrilammide.
    ATTENZIONE: La silice se inalata può essere cancerogena. Tutti i lavori, compresa la pesatura, devono essere eseguiti in una cappa aspirante.
  5. Preparare uno stampo quadrato da 58 mm x 58 mm x 78 mm con un'inclusione cilindrica tagliando le punte di una pipetta di trasferimento di plastica e sostenendola nello stampo con nastro da laboratorio. Vedere la Figura 2.
  6. Aggiungere 2 mL di soluzione di APS al 10 % nel becher per ottenere una concentrazione finale dello 0,1 % di APS e aggiungere 250 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione fantasma. Lasciare mescolare brevemente la soluzione (meno di un minuto).
  7. Versare rapidamente la soluzione nello stampo, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione. La soluzione dovrebbe polimerizzare entro 10 minuti. Rimuovere il fantasma facendo scorrere l'estremità piatta di una spatola da laboratorio attorno al bordo dello stampo e invertendo lo stampo.
    NOTA: Questi fantocci possono essere riutilizzati più volte e devono essere immersi in acqua e conservati a 4°C.

3. Imaging di nanogoccioline di perfluorocarburo

  1. Accendere e riscaldare il sistema laser pulsato per ~ 20 minuti seguendo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che il fascio in fibra ottica sia collegato correttamente all'uscita laser e che le due gambe siano posizionate correttamente all'interno del supporto del fascio di fibre.
  2. Accendere il sistema di imaging a ultrasuoni, collegare il trasduttore di imaging array (L11-4v) al sistema e fissare il trasduttore all'interno del supporto per allineare il suo piano di imaging con la sezione trasversale del laser.
  3. Impostare la frequenza di ripetizione dell'impulso del sistema laser su 10Hz e posizionare un misuratore di potenza all'estremità del fascio di fibre per misurare l'energia. Regolare il ritardo dell'interruttore q fino a quando la fluenza stimata è di 70 mJ/cm2.
    ATTENZIONE: Gli occhiali appropriati devono essere indossati quando si spara il laser e le tende laser devono racchiudere lo spazio.
  4. Riempire uno dei canali del fantasma di poliacrilammide con il gel ad ultrasuoni/miscela PFCnD utilizzando una siringa a punta di plastica da 1 ml. Coprire liberamente la parte superiore del canale con gel ad ultrasuoni e rimuovere eventuali bolle con una siringa di plastica da 1 ml. Posizionare il fantasma di poliacrilammide sotto il trasduttore e il fascio di fibre come mostrato nella Figura 3.
  5. Utilizzare la piattaforma di imaging combinata a ultrasuoni laser ed elasticità (CLUE) basata sul software20 per immagini PFCnD sincronizzate con l'attivazione ottica. Modificare i parametri generali definiti dall'utente nella struttura Param per l'imaging: impostare la profondità di inizio/fine su 0/40mm, la frequenza centrale su 6,9 MHz e il nome del trasduttore su "L11-4v".
  6. Definire un nuovo RunCase e progettare una sequenza di moduli per l'attivazione/ricondensazione ottica ripetuta e l'imaging US di PFHnD. Questo viene fatto elencando moduli predefiniti come imaging ultraveloce (mUF), laser esterno (mExtLaser) e idle (mIdle).
    1. Ripetere due volte il set di sequenze mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF per acquisire dati di imaging sia a impulso n che a impulso p.
      NOTA: il primo modulo mExtLaser in ogni sequenza viene impostato come laser fittizio impostando ExtLaser.Enable su 0 e il 'mIdle' è incluso per ridurre al minimo il tempo tra le immagini US di sfondo e le immagini US n/p-pulse dopo l'attivazione del laser.
  7. Impostare i parametri del modulo per ogni modulo inserito nella sequenza di moduli del caso di esecuzione corrente. Accedere a ciascun parametro del modulo per indice corrispondente al suo ordine nella sequenza del modulo. I moduli eseguiranno operazioni predefinite con i parametri del modulo impostati dall'utente qui.
    1. Impostare ExtLaser.QSdelay nei moduli laser esterni sul valore del ritardo del Q-switch laser sintonizzato nel passaggio 3.3, in microsecondi. Questo modulo attende l'attivazione della torcia del sistema laser e genera il trigger Q-switch dopo il ritardo specificato in QSdelay.
    2. Nel modulo di imaging ultraveloce, impostare Resource.numFrame su 100, impostare SeqControl.PRI su 200 (μs) e impostare TW.polarity su 1 per P-impulso e -1 per N-impulso (vedere la Figura 4 per la forma dell'impulso corrispondente). Questo modulo trasmetterà un'onda planare ultraveloce di 0 gradi con tipo di impulso specificato in TW.polarity.
      1. Acquisire una finestra di imaging con apertura completa di 38,8 mm di larghezza per il numero di fotogrammi in Resource.numFrame, intervallo di ripetizione dell'impulso di SeqControl.PRI, quindi salvare i dati per l'elaborazione off-line.
    3. Impostare SeqControl.lastPRI_Module modulo inattivo per il periodo di tempo tra gli impulsi laser (100 ms) sottratto dal ritardo dell'interruttore Q, dal tempo di acquisizione dei dati di imaging (20 ms) e da un margine di 20 μs per il segnale da percorrere. Questo modulo mantiene il sistema in stato di "nessuna operazione" per il tempo in SeqControl.lastPRI_Module per colmare il divario temporale tra la fine dell'acquisizione dei dati di imaging e la successiva eccitazione dell'impulso laser.

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Representative Results

La corretta formulazione e separazione centrifuga dei PFCnD dovrebbe produrre goccioline di circa 200-300 nm di diametro (Figura 1A). Le goccioline separate in modo improprio possono mostrare piccoli picchi intorno a 1 μm. Queste soluzioni possono essere ulteriormente sonicate per rompere le goccioline più grandi. La dimensione delle goccioline aumenterà nel tempo a causa della coalescenza e/o della diffusione in un processo noto come Ostwald maturando21,22 (Figura 1B).

La modulazione acustica delle goccioline manipolando l'impulso di imaging ha migliorato il contrasto dei PFCnD vaporizzati. Ciò è stato dimostrato nelle immagini PFCnD ricostruite sottraendo fotogrammi adiacenti delle immagini beamformed in modo che solo il segnale restituito dal PFCnD vaporizzato sia visibile e il segnale di fondo stazionario sia soppresso. Il contrasto è quantificato dal rapporto tra la differenza tra i segnali medi dell'area di inclusione circolare e il segnale di fondo medio rispetto al segnale medio di fondo. Il segnale di fondo è definito dai segnali provenienti da due ROI rettangolari dello sfondo che si trovano alla stessa profondità e area equivalente delle inclusioni. Il contrasto rispetto all'inclusione per l'impulso N è circa 3,2 volte maggiore (cioè un miglioramento del 220 %) rispetto all'impulso P (figura 5).

L'impulso di imaging inverso ha anche aumentato la longevità del segnale dalla vaporizzazione PFCnD. Questo è stato quantificato sospendendo i pixel nella regione di inclusione circolare che supera il segnale di sfondo. La percentuale di pixel nell'inclusione che era al di sopra della soglia è stata definita come l'area iperecogena (%). Per esaminare il comportamento iperecogenico dei PFCnD nel tempo, l'area iperecogena viene calcolata per ciascun frame e normalizzata dall'area iperecogena del primo frame, e quindi adattata a un modello di decadimento esponenziale. Questa funzione è stata utilizzata per determinare il tempo di decadimento caratteristico, definito come l'intervallo di tempo necessario affinché l'area iperecogena dopo l'attivazione di PFCnD decadimenti a solo il 10% dell'area iniziale (Figura 6a). Il tempo di decadimento caratteristico dell'area iperecogena normalizzata è fino a 3,5 volte più lungo nell'imaging a impulso N rispetto all'impulso P. I fotogrammi di immagine differenziali rappresentativi in modo B nel tempo per ogni imaging a impulso N e impulso P sono mostrati nella Figura 6b.

Figure 1
Figura 1: Misurazioni delle dimensioni DLS dei PFCnD e della stabilità. (A) La distribuzione dell'intensità dimensionale delle goccioline è calcolata in media da tre misurazioni delle goccioline dopo la sintesi (media PDI: 0,132± 0,016; media Z: 259,3 ± 0,7 nm). (B) La distribuzione dell'intensità dimensionale delle goccioline è la media di tre misurazioni effettuate 24 ore dopo la sintesi (media PDI: 0,252± 0,061; media Z media: 322,5 ± 4,5 nm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagine e schema dello stampo in poliacrilammide. (A) Immagine dello stampo realizzato con nastro da laboratorio e contenitore di plastica. (B) Schema con misure del fantasma di poliacrilammide dopo la rimozione dallo stampo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Uno schema dell'erogazione dell'impulso laser e dell'imaging ad ultrasuoni. (A) I componenti dell'assieme sono etichettati e viene illustrato l'allineamento del piano di imaging laser / ultrasuoni rispetto alla posizione di inclusione. (B) Un'immagine che mostri la configurazione effettiva. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Impulso di imaging ecografico simulato. Le forme d'onda sono simulate dal software del sistema di imaging ad ultrasuoni, campionate da 250 MHz. La forma d'onda dell'impulso P e dell'impulso N sono generati con la stessa frequenza centrale e larghezza dell'impulso ma hanno una differenza di fase di 180°. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Misurazione del contrasto. Valore di contrasto medio dell'area di inclusione per N-impulso e P-impulso, le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Curva di decadimento caratteristica dell'area iperecogena e dei maghi rappresentativi differenziali B-mode . (A) Area iperecogena normalizzata indotta dall'attivazione di PFCnD nel tempo per l'imaging a impulso N e impulso P nella stessa sezione trasversale. La linea tratteggiata indica il 10% dell'area iperecogena iniziale. Il momento in cui il grafico fittato si interseca con la linea tratteggiata rappresenta il tempo di decadimento caratteristico. (B) Le immagini mostrano una finestra ROI ritagliata centrata sull'inclusione, tracciata su una scala dB con una gamma dinamica di 35. La riga superiore mostra il comportamento di ricondensazione visualizzato dall'impulso P e la riga inferiore mostra l'impulso N. La linea tratteggiata di colore giallo indica l'area di inclusione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Volume totale di Phantom (mL) 50 100 250 500
DI acqua (ml) 37.5 74.9 187.4 375
Soluzione PA al 40% (ml) 12.5 25.1 62.6 125
Silice (mg) 100 200 500 1000
Soluzione APS al 10% (μL) 500 1000 2500 5000
TEMED (μL) 62.5 125 312.5 625

Tabella 1: Riepilogo dei reagenti e delle quantità per la reticolazione fantasma di poliacrilammide in base al volume dello stampo. Questa tabella fornisce un riepilogo conciso dei valori dei reagenti utilizzati e delle quantità in base a diversi volumi di stampi comuni.

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Discussion

La sonicazione della sonda è un metodo relativamente semplice e facile da imparare per fabbricare PFCnD. Ci sono alcuni passaggi in cui è necessario prestare attenzione. Quando si maneggia il cloroformio, è imperativo utilizzare una pipetta a spostamento positivo o siringhe di vetro, poiché è volatile e "perde" dalle pipette a spostamento d'aria standard. Inoltre, se si utilizza uno spostamento positivo, assicurarsi che venga utilizzata una punta appropriata poiché il cloroformio dissolverà la maggior parte delle punte di plastica, che possono introdurre contaminanti nella soluzione. Una pipetta a spostamento positivo o una siringa di vetro è raccomandata anche per il perfluoroesano, poiché è volatile e più densa dell'acqua. In genere, gli effetti individuali della volatilità e dell'alta densità possono essere ridotti pre-bagnatura nelle pipette a spostamento d'aria e utilizzando una scala per regolare il volume impostato sulla pipetta, rispettivamente. Ma nel caso del perfluoroesano che possiede entrambe le proprietà, la volatilità renderà difficile ottenere misurazioni accurate del peso, rendendo una pipetta a spostamento positivo / siringa di vetro l'opzione più praticabile.

Prima di sondare la sonicazione della soluzione, è importante incubare la soluzione lipidica e perfluorocarbonica in un bagno di ghiaccio per consentirne il raffreddamento per evitare l'ebollizione del perfluorocarburo durante la sonicazione. Questo passaggio sarà particolarmente importante per il perfluorocarburo bollente inferiore come il perfluoropentano. Inoltre, è necessario prestare attenzione quando si sonda sonicando la soluzione. La punta della sonda di sonicazione deve essere immersa, ma non deve entrare in contatto con il fondo o i lati della fiala di vetro in quanto potrebbe danneggiare la punta e frantumare la fiala, svuotando la soluzione lipidica nel bagno di ghiaccio.

Il protocollo di fabbricazione PFCnD può essere adattato in alcuni modi minori. Se un evaporatore rotante non è disponibile nella fase 1.3, la soluzione può essere essiccata con un flusso costante di azoto gassoso o essere posta in una camera a vuoto durante la notte per formare la torta lipidica. Per quanto riguarda i lipidi, questa formulazione utilizza un rapporto 9: 1 di DSPE-PEG: DSPC rispetto al rapporto standard 1: 9 di DSPE-PEG: DSPC, perché si traduce in goccioline più piccole e più stabili di dimensioni23. Questa formulazione può essere adattata per consentire la coniugazione superficiale sostituendo una piccola frazione (~ 2 mol %) del DSPE-PEG con un DSPE-PEG funzionalizzato con la porzione desiderata (ad esempio, biotina, tiolo, ammina, ecc.).

In generale, i sonicatori a sonda sono disponibili in commercio, relativamente semplici da usare e possono essere facilmente adattati ad altri perfluorocarburi e formulazioni tensioattive con punto di ebollizione più elevato, ma non possono essere utilizzati per produrre goccioline con nuclei di perfluorocarburi gassosi a temperatura ambiente senza modifiche significative. Una di queste modifiche è l'utilizzo della sonicazione della sonda per creare microbolle e quindi applicare pressione e ridurre la temperatura per condensare le microbolle in goccioline24. Mentre questo metodo è un modo intelligente per generare goccioline vaporizzabili acusticamente, è difficile incapsulare abbastanza colorante all'interno delle microbolle per garantire ODV dopo la condensazione. Un approccio alternativo è quello di coniugare il colorante (ad esempio, Cy7.5) ai lipidi e formare microbolle che possono essere condensate in PFCnDs25 con basso punto di ebollizione compatibile con ODV.

La sonicazione della sonda produce anche un'alta concentrazione di nanogoccioline (~ 1010 goccioline / ml) in un periodo di tempo relativamente breve. Tuttavia, questa tecnica si traduce in una distribuzione di grandi dimensioni che ridurrà la quantità di nanogoccioline che stravaseranno. Mentre questo può essere migliorato attraverso il filtraggio centrifugo o filtri a siringa per rimuovere goccioline più grandi, i PFCnD risultanti mostreranno una maggiore polidispersività rispetto alle goccioline sintetizzate utilizzando microfluidica o filtrate attraverso l'estrusione26. Un altro svantaggio della sonicazione della sonda è che la punta della sonda di sonicazione sarà inevitabilmente snocciolata dalla cavitazione durante la sonicazione e dovrà essere sostituita periodicamente.

Un approccio alternativo alla creazione di goccioline utilizza dispositivi microfluidici che possono essere utilizzati per adattare le goccioline a una dimensione specifica con un basso indice di polidispersità (PDI). Tuttavia, questi dispositivi producono goccioline a una velocità relativamente lenta (~10 4-106 goccioline/s)26 e, mentre ci sono stati diversi sviluppi come l'emulsificazione a gradini 27, lo streaming della punta nei dispositivi di focalizzazione del flusso28,29 e l'utilizzo dell'effetto ouzo con un micromixer a spina di pesce sfalsato30 - La generazione di goccioline di dimensioni nanometriche rimane ancora impegnativa. Inoltre, questa tecnica non è disponibile in commercio e la fabbricazione di questi dispositivi richiede competenze specializzate.

Altri metodi disponibili in commercio includono l'estrusione e l'omogeneizzazione. L'estrusione utilizza membrane per far passare le goccioline, risultando in goccioline di dimensioni nanometriche con una gamma di dimensioni più ristretta rispetto alla sonicazione. Tuttavia questo metodo è fortemente dipendente dalla formulazione ed è difficile incorporare colorante o carico terapeutico all'interno della goccia26. L'omogeneizzazione ad alta pressione utilizza omogeneizzatori disponibili in commercio che utilizzano l'alta pressione e lo sforzo di taglio per generare particelle lipidiche monodisperse su scala nanometrica in modo scalabile31,32,33. Questo metodo è stato adattato per creare goccioline con perfluorocarburi ad alto e basso punto di ebollizione32,34. Una revisione più sostanziale dei metodi di formulazione delle goccioline e dei protocolli campione può essere trovata nella seguente revisione26.

I fantocci sono uno strumento prezioso per caratterizzare le prestazioni delle nanogoccioline in vitro. In questo protocollo vengono utilizzati fantocci a base di poliacrilammide con silice. I problemi più frequenti con i fantocci di poliacrilammide sono legati alla polimerizzazione lenta o assente. La polimerizzazione lenta, sebbene meno problematica, può portare a una distribuzione eterogenea dello scatter incorporato. Il colpevole più comune per questo problema è l'uso di vecchie soluzioni di persolfato di ammonio che riducono la produzione di radicali liberi che avviano la reticolazione. Questo può essere facilmente risolto rendendo la soluzione fresca o non utilizzando soluzioni preparate che sono più vecchie di una settimana. Un'altra possibilità è la degradazione di TEMED - questo sarà evidente nella formazione di un precipitato giallo. Un altro problema comune è la presenza di bolle d'aria nel fantasma polimerizzato. Un corretto degasaggio dell'acqua e un'attenta manipolazione per evitare un'eccessiva agitazione superficiale dovrebbero mitigare questo problema. Una strategia alternativa sarebbe quella di degassare l'intera soluzione dopo il passaggio 2.5. Tuttavia, questo dovrebbe essere eseguito in una cappa aspirante a causa della presenza di acrilammide.

Questi fantasmi sono anche eccellenti per l'imaging del comportamento delle goccioline ristrette per studiare il comportamento delle singole goccioline; questo può essere fatto aggiungendo PFCnD nel fantasma al punto 2.4. Inoltre, poiché la reticolazione è dovuta a una reazione chimica, viene prodotto relativamente poco calore rispetto a una reticolazione fisica basata su una temperatura critica superiore della soluzione come la gelatina. Ciò riduce la probabilità di vaporizzazione spontanea delle goccioline incorporate.

Mentre ci sono una varietà di metodi per sintetizzare fantasmi, il poliacrilammide produce un fantoccio relativamente resistente e non degradabile che possiede una bassa attenuazione acustica35 e un coefficiente di assorbimento ottico36. Queste proprietà possono essere regolate per imitare più da vicino le proprietà acustiche e ottiche del tessuto umano regolando la concentrazione della soluzione finale di poliacrilammide e attraverso l'inclusione di particelle nel fantasma come silice, perle di vetro o biossido di titanio36. Inoltre le proprietà meccaniche dei fantocci possono essere regolate modificando la percentuale di contenuto di polimero (cioè percentuale di acrilammide e bis (acrilammide)) e percentuale di reticolante (cioè percentuale di bis (acrilammide) nel contenuto totale di polimeri)37. I fantasmi alternativi includono ma non sono limitati ad agar38, gelatina39, alcool polivinilico (PVA) 40, ecc.

I passaggi critici per un imaging di successo della distribuzione di PFCnD attivato e della dinamica iperecogenica sono i seguenti. 1) Sincronizzare il sistema laser (sorgente di attivazione) e il sistema di imaging ad ultrasuoni. 2) Allineare la sezione trasversale del laser sia con la regione target di interesse che con il piano di imaging ad ultrasuoni. 3) Regolare i parametri di imaging ecografico propri dell'imaging PFCnD (ad esempio, framerate, forma d'onda dell'impulso, ecc.).

L'attivazione ottica di PFCnD ha un notevole vantaggio rispetto a quelli attivati acusticamente che può eludere le interferenze acustiche che degradano drasticamente la qualità dell'immagine ecografica osservando la sua fase di ricondensazione nel tempo. Tuttavia, è difficile integrare e allineare il sistema laser con il sistema di imaging a ultrasuoni sia spazialmente che temporalmente. L'uso di un supporto stampato in 3D consente un'erogazione della luce ripetibile e controllata. L'erogazione della luce può anche essere risolta inserendo un'asta metallica nell'inclusione nel fantasma di poliacrilammide poiché l'asta metallica dovrebbe produrre un contrasto fotoacustico per indicare l'erogazione della luce. La sincronizzazione temporale è stata ottenuta costruendo una piattaforma20 precedentemente sviluppata, che consente sia la sincronizzazione del sistema di lasing che di imaging, mantenendo la piena programmabilità del sistema di imaging Verasonics con un'interfaccia user-friendly. Inoltre, il programma fornisce immagini convenzionali in modalità B e imaging fotoacustico in tempo reale per aiutare nella risoluzione dei problemi e individuare la regione di interesse in cui sono distribuiti i PFCnD. Tuttavia, questa configurazione richiede un laser pulsato esterno al nanosecondo. Attualmente, per quanto ne sappiamo, ci sono alcuni sistemi commerciali che hanno integrato sistemi di imaging laser-ultrasuoni che possono consentire l'imaging PFCnD, ad esempio Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 e iTheraMedical (insight 64, inVision 128, inVision 256-TF e inVision 512-echo).

L'imaging ecografico ultraveloce del comportamento di vaporizzazione-ricondensazione di PFCnD soffre principalmente di bassa sensibilità. Mentre le soluzioni più comuni per il miglioramento della sensibilità dell'immagine includono il multi-frame compounding, tali tecniche sono limitate dalla loro caratteristica intrinseca di degradare il framerate, poiché l'imaging PFCnD è altamente vulnerabile agli artefatti di movimento in quanto include il processo differenziale temporale. La modulazione della polarità dell'impulso nel nostro protocollo risolve efficacemente questo problema nell'imaging PFCnD sfruttando le dinamiche acustiche dei PFCnD vaporizzati per avere un'immagine più discriminabile e prolungata senza influire affatto sulla risoluzione temporale.

Mentre ODV consente goccioline con capacità uniche come la vaporizzazione ripetuta e il contrasto fotoacustico, il metodo di attivazione ha una penetrazione di profondità limitata rispetto agli ultrasuoni. Poiché la penetrazione della luce è limitata, ciò limita le applicazioni a procedure principalmente superficiali come la sostituzione della biopsia del linfonodo sentinella41. Questa limitazione può potenzialmente essere aggirata attraverso sistemi di erogazione della luce basati su catetere, consentendo l'attivazione in profondità nel tessuto. Poiché il contrasto è acustico, la vaporizzazione sarà in grado di essere ripresa a profondità paragonabili all'ADV. Una tecnica di attivazione alternativa può essere la vaporizzazione magnetica delle gocce, in cui agenti di contrasto magnetici come le nanoparticelle di ossido di ferro sono incapsulati all'interno della goccia42. Ciò consentirà la vaporizzazione a qualsiasi profondità.

In futuro, la capacità del nostro protocollo di visualizzare e modulare la risposta iperecogena di PFCnD allo stesso tempo può essere utilizzata per diverse applicazioni in cui sono richiesti il monitoraggio e la manipolazione di PFCnD. Ad esempio, un tempo rilevabile più lungo può migliorare la qualità dell'immagine dell'imaging a super-risoluzione dando un numero maggiore di fotogrammi alla media. Inoltre, un controllo più preciso del PFCnD ha il potenziale per elevare l'efficienza e la sicurezza delle terapie mediate da bolle come l'apertura della BBB e la somministrazione di farmaci.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il lavoro è stato sostenuto in parte dalla Breast Cancer Research Foundation con sovvenzione BCRF-20-043.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics - ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research - Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics - research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd - Makes size measurements based on dynamic light scattering

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Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).

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