Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Formulering og akustisk modulering af optisk fordampede perfluorcarbon nanodråber

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62814
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

Optisk aktiverede perfluorcarbon nanodråber viser løfte i billeddannelsesapplikationer uden for det vaskulære system. Denne artikel vil demonstrere, hvordan man syntetiserer disse partikler, tværbinding polyacrylamidfantomer og modulerer dråberne akustisk for at forbedre deres signal.

Abstract

Mikrobobler er det mest almindeligt anvendte billeddannelseskontrastmiddel i ultralyd. På grund af deres størrelse er de imidlertid begrænset til vaskulære rum. Disse mikrobobler kan kondenseres eller formuleres som perfluorcarbon nanodråber (PFCnD'er), der er små nok til at ekstravasere og derefter udløses akustisk på målstedet. Disse nanopartikler kan forbedres yderligere ved at inkludere en optisk absorber, såsom nær infrarødt organisk farvestof eller nanopartikler (f.eks. kobbersulfidnanopartikler eller guldnanopartikler / nanoroder). Optisk mærkede PFCnD'er kan fordampes gennem laserbestråling i en proces kendt som optisk dråbefordampning (ODV). Denne aktiveringsproces muliggør anvendelse af perfluorcarbonkerner med højt kogepunkt, som ikke kan fordampes akustisk under den maksimale mekaniske indekstærskel for diagnostisk billeddannelse. Kerner med højere kogepunkt resulterer i dråber, der vil rekondensere efter fordampning, hvilket resulterer i "blinkende" PFCnD'er, der kortvarigt producerer kontrast efter fordampning, før de kondenseres tilbage til nanodråbeform. Denne proces kan gentages for at producere kontrast efter behov, hvilket giver mulighed for baggrundsfri billeddannelse, multiplexing, superopløsning og kontrastforbedring gennem både optisk og akustisk modulering. Denne artikel vil demonstrere, hvordan man syntetiserer optisk triggerable, lipidskal PFCnD'er ved hjælp af sonde sonikering, skaber polyacrylamid fantomer til at karakterisere nanodråberne og akustisk modulere PFCnD'erne efter ODV for at forbedre kontrasten.

Introduction

Mikrobobler er det mest allestedsnærværende ultralydskontrastmiddel på grund af deres biokompatibilitet og fremragende ekkogenicitet sammenlignet med blødt væv. Dette gør dem til værdifulde værktøjer til visualisering af blodgennemstrømning, organafgrænsning og andre applikationer1. Imidlertid begrænser deres størrelse (1-10 μm), hvilket gør dem usædvanlige til billeddannelse baseret på deres resonansfrekvens, deres anvendelser til vaskulaturen2.

Denne begrænsning har ført til udviklingen af PFCnD'er, som er nanoemulsioner sammensat af et overfladeaktivt stof indkapslet omkring en flydende perfluorcarbonkerne. Disse nanopartikler kan syntetiseres i størrelser så små som 200 nm og er designet til at drage fordel af "utæt" vaskulatur eller porer og åbne fenestrationer, der findes i tumorvaskulatur. Mens disse forstyrrelser er tumorafhængige, giver denne permeabilitet mulighed for ekstravasation af nanopartikler fra ~ 200 nm - 1,2 μm afhængigt af tumoren 3,4. I deres oprindelige form producerer disse partikler ringe eller ingen ultralydskontrast. Ved fordampning - induceret akustisk eller optisk - ændres kernefasen fra væske til gas, hvilket inducerer en to og en halv til fem gange stigning i diameter 5,6,7 og genererer fotoakustisk og ultralydskontrast. Mens akustisk fordampning er den mest almindelige aktiveringsmetode, skaber denne tilgang akustiske artefakter, der begrænser billeddannelsen af fordampningen. Derudover kræver de fleste perfluorcarboner fokuseret ultralyd med et mekanisk indeks ud over sikkerhedstærsklen for at fordampe8. Dette har ført til udviklingen af PFCnD'er med lavere kogepunkt, som kan syntetiseres ved at kondensere mikrobobler til nanodråber9. Disse dråber er imidlertid mere flygtige og udsat for spontan fordampning10.

Optisk dråbefordampning (ODV) kræver på den anden side tilsætning af en optisk udløser såsom nanopartikler 11,12,13 eller farvestof 6,14,15 og kan fordampe perfluorcarboner med højere kogepunkt ved hjælp af fluencer inden for ANSI-sikkerhedsgrænsen 11. PFCnD'er syntetiseret med kerner med højere kogepunkt er mere stabile og vil rekondensere efter fordampning, hvilket giver mulighed for baggrundsfri billeddannelse16, multiplexing 17 og superopløsning18. En af de største begrænsninger ved disse teknikker er det faktum, at PFCnD'er med højt kogepunkt er ekkogene efter fordampning i kun en kort tidsramme på skalaen millisekunder19 og er relativt svage. Selvom dette problem kan afhjælpes gennem gentagne fordampninger og gennemsnit, er detektion og adskillelse af dråbesignal fortsat en udfordring.

Med inspiration fra pulsinversion kan varigheden og kontrasten forbedres ved at ændre fasen af ultralydsbilledpulsen19. Ved at starte ultralydsbilledpulsen med en sjælden fraktionsfase (n-puls) øges både varigheden og kontrasten af de fordampede PFCnD'er. I modsætning hertil resulterer start af ultralydsbilledpulsen med en kompressionsfase (p-puls) i reduceret kontrast og kortere varighed. Denne artikel vil beskrive, hvordan man syntetiserer optisk triggerable perfluorcarbon nanodroplets, polyacrylamidfantomer, der almindeligvis anvendes i billeddannelse, og demonstrerer kontrastforbedring og forbedret signallevetid gennem akustisk modulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Perfluorcarbon nanodråbe formulering

  1. Skyl en 10 ml rundbundet kolbe med chloroform ud, og vask en 10 μL og 1 ml gastæt glassprøjte med chloroform ved gentagne gange at opsuge hele sprøjtevolumen og udvise den i alt tre gange.
    FORSIGTIG: Chloroform er flygtig og kan være giftig ved indånding. Alt arbejde med dette opløsningsmiddel skal udføres i en røghætte.
  2. Ved hjælp af sprøjterne tilsættes 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC, 25 mg/ml) og 1 ml IR 1048 (1 mg/ml i chloroform) i den rundbundede kolbe. Husk at rense sprøjterne mellem lipider/farvestof for at forhindre forurening af bestanden.
    BEMÆRK: Infrarøde farvestoffer er lysfølsomme, og arbejdet skal udføres under svage forhold, eller kolber skal være dækket af aluminiumsfolie.
  3. Fjern opløsningsmidlet ved hjælp af en roterende fordamper. Sørg for, at vakuumet langsomt justeres til 332 mbar for at forhindre stød. Efter 5 minutter reduceres trykket til 42 mbar for at fjerne vand, der kan være kommet ind i opløsningen.
    BEMÆRK: Lipidkagen kan opbevares natten over i en rund bundkolbe dækket med parafilm ved 4 °C.
  4. Lipidkagen suspenderes i 1 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) og sonikat eller hvirvel ved stuetemperatur i 5 minutter, eller indtil hele lipidkagen er suspenderet og opløst i opløsningen. Sonicate i yderligere 2 minutter for at homogenisere opløsningen.
  5. Overfør opløsningen til et 7 ml glasflaske, og læg hætteglasset i et glasfad fyldt med is, så opløsningen kan køle af i 5 minutter, før der tilsættes 50 μL perfluorhexan ved hjælp af en gastæt glassprøjte. Husk at skylle sprøjten ud med perfluorhexan, inden du udleverer den i hætteglasset.
  6. Placer glashætteglasset indeholdende lipider og isbad i sondens sonikatorkabinet, og nedsænk sondespidsen under miniscus. Sørg for, at siderne af sonicatorsonden ikke berører læben på glashætteglasset.
  7. Sonde sonikerer blandingen med følgende indstillinger: Amplitude 1, Procestid: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Derefter sonikeres ved følgende indstillinger: Amplitude: 50, Procestid: 5 s, Puls-on: 1 s, Pulse-off: 10 s.
  8. Overfør nanodråbeopløsningen til et 1,5 ml centrifugerør og centrifuge ved 300 x g i 3 minutter for at adskille de større dråber (>1 μm) fra mindre dråber.
  9. Kassér pelleten og overfør supernatanten til et andet 1,5 ml centrifugerør. Supernatanten vaskes ved centrifugering ved 3000 x g i 5 minutter for at pelletere alle dråberne i opløsning. Resuspender PFCnD'erne i 1 ml PBS ved at pipettere pelleten op og ned og derefter sonikere i en badsonikator i 1 min.
  10. Mål størrelsen på dråberne ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS). Fortynd PFCnD'erne med 100 gange (10 μL PFCnD-bestand i 990 μL PBS) og bad sonikat for at sprede PFCnD'erne inden måling. Repræsentative resultater er vist i figur 1.
  11. Bestem koncentrationen af PFCnD'erne ved hjælp af nanopartikelsporingsanalysatoren (se Materialetabel). Fortynd PFCnD'erne med 100-1000 gange for at sikre nøjagtig måling af koncentrationen. Protokollen giver typisk dråber i en koncentration i størrelsesordenen 1010 partikler/ml.
  12. Forbered 10 ml ultralydskoblingsgel i et 50 ml centrifugerør og tilsæt 1% (v / v) eller 100 μL PFCnD'er for at fremstille opløsning af ~ 108 partikler / ml. Vortex opløsningen til blanding. Centrifuger blandingen ved 4000 x g i 3 minutter for at fjerne bobler.

2. Fremstilling af polyacrylamid fantom

  1. Afgass vand ved at fylde en 500 ml vakuumkolbe med 400 ml deioniseret vand, tætning med en gummikork, og tilslut kolben til vakuumledningen. Åbn vakuumledningen, og nedsænk bunden af kolben i badesonikatoren. Sonicate i 5 minutter eller indtil ingen dannelse af gasbobler er synlig.
  2. Der fremstilles 10% ammoniumpersulfatopløsning (APS) ved at opløse 500 mg i 5 ml afgasset vand. Hvirvl forsigtigt opløsningen, hvis ammoniumpersulfatet ikke opløses helt.
  3. I et 400 ml bægerglas med en rørestang på en omrøringsplade tilsættes 150 ml afgasset vand og 50 ml 40% (w/v) acrylamid opløsning af acrylamid til dannelse af 200 ml 10% acrylamid bisachyllamidopløsning. Rør blandingen ved 200 o / min for at muliggøre korrekt blanding uden at indføre bobler.
    FORSIGTIG: Akrylamid er kræftfremkaldende, og alt arbejde skal udføres i en røghætte med handsker, især hvis du arbejder med acrylamid i pulverform.
  4. Der afvejes 400 mg silica til og tilsættes 10 % acrylamid fra trin 2,3 til dannelse af 0,2 % (w/v) silica og acrylamid opløsning.
    FORSIGTIG: Silica ved indånding kan være kræftfremkaldende. Alt arbejde inklusive vejning skal udføres i en røghætte.
  5. Forbered en 58 mm x 58 mm x 78 mm firkantet form med en cylindrisk inklusion ved at afskære spidserne af fra en plastoverførselspipette og understøtte den i formen med laboratorietape. Se figur 2.
  6. Der tilsættes 2 ml 10 % APS-opløsning til bægerglasset for at opnå en slutkoncentration på 0,1 % APS, og der tilsættes 250 μL tetramethylethylendiamin (TEMED) til fantomopløsningen. Lad opløsningen røre kortvarigt (mindre end et minut).
  7. Hæld hurtigt opløsningen i formen, mens du er forsigtig med ikke at indføre luftbobler i opløsningen. Opløsningen skal polymeriseres inden for 10 min. Fjern fantomet ved at køre den flade ende af en laboratoriespatel rundt om kanten af formen og vende formen om.
    BEMÆRK: Disse fantomer kan genbruges flere gange og skal nedsænkes i vand og opbevares ved 4 ° C.

3. Perfluorcarbon nanodråbe billeddannelse

  1. Tænd og varm det pulserende lasersystem op i ~ 20 minutter ved at følge producentens anvisninger. Sørg for, at det fiberoptiske bundt er korrekt forbundet til laserudgangen, og at de to ben er korrekt placeret i fiberbundtholderen.
  2. Tænd ultralydsbilleddannelsessystemet, tilslut array imaging transducer (L11-4v) til systemet, og fastgør transduceren i holderen for at justere dens billeddannelsesplan med lasertværsnit.
  3. Indstil lasersystemets pulsgentagelsesfrekvens til 10Hz, og placer et effektmåler i slutningen af fiberbundtet for at måle energi. Indstil q-switchforsinkelsen, indtil den estimerede fluens er 70 mJ/cm2.
    FORSIGTIG: Der skal bæres passende briller, når laseren affyres, og lasergardiner skal omslutte rummet.
  4. Genopfyld en af kanalerne i polyacrylamid fantomet med ultralydsgelen / PFCnD-blandingen ved hjælp af en 1 ml plastspidssprøjte. Dæk liberalt toppen af kanalen med ultralydsgel og fjern eventuelle bobler med en 1 ml plastspidssprøjte. Placer polyacrylamid fantomet under transduceren og fiberbundtet som vist i figur 3.
  5. Brug den kombinerede laser ultralyd og elasticitet (CLUE) billeddannelsesplatform baseret på softwaren20 til at afbilde PFCnD synkroniseret med optisk aktivering. Skift de generelle brugerdefinerede parametre i Param-struktur til billeddannelse: indstil start/ slutdybde til 0/40 mm, centerfrekvens til 6,9 MHz og transducernavn til 'L11-4v'.
  6. Definer en ny RunCase , og design en modulsekvens til gentagen optisk aktivering/genkondensering og amerikansk billeddannelse af PFHnD'er. Dette gøres ved at angive foruddefinerede moduler såsom ultrahurtig billeddannelse (mUF), ekstern laser (mExtLaser) og inaktiv (mIdle).
    1. Gentag sekvenssættet mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF to gange for at indsamle både n-puls- og p-pulsbilleddata.
      BEMÆRK: Det første mExtLaser-modul i hver sekvens indstilles som en falsk laser ved at indstille ExtLaser.Enable til 0, og 'mIdle' er inkluderet for at minimere tiden mellem amerikanske baggrundsbilleder og de amerikanske billeder med n/p-puls efter laseraktivering.
  7. Indstil modulparametre for hvert modul, der er placeret i den aktuelle kørselssags modulsekvens. Få adgang til hver modulparameter efter indeks svarende til rækkefølgen i modulsekvensen. Moduler udfører foruddefinerede handlinger med modulparametre, som brugeren har angivet her.
    1. Indstil ExtLaser.QSdelay i eksterne lasermoduler til værdien af laser Q-switch delay indstillet i trin 3.3, i mikrosekunder. Dette modul venter på, at lasersystemets lommelygteudløser ud og genererer Q-switch-udløser efter den forsinkelse, der er angivet i QSdelay.
    2. I ultrahurtigt billeddannelsesmodul skal du indstille Resource.numFrame til 100, indstille SeqControl.PRI til 200 (μs) og indstille TW.polaritet til 1 for P-puls og -1 for N-puls (se figur 4 for tilsvarende pulsform). Dette modul transmitterer ultrahurtig 0-graders plan bølge med pulstype specificeret i TW.polaritet.
      1. Få billedbehandlingsvindue med fuld blænde på 38,8 mm bredt for antal rammer i Resource.numFrame, pulsgentagelsesinterval for SeqControl.PRI, og gem derefter data til offlinebehandling.
    3. Indstil SeqControl.lastPRI_Module i inaktivt modul til længden af tid mellem laserimpulser (100 ms) trukket af Q-switch-forsinkelse, billeddannelsesdataindsamlingstid (20 ms) og en margen på 20 μs for signalet at rejse. Dette modul holder systemet under 'ingen drift' tilstand for tiden i SeqControl.lastPRI_Module for at udfylde tidsgabet mellem slutningen af billeddataindsamling og næste laserpuls excitation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket formulering og centrifugalseparation af PFCnD'erne bør give dråber omkring størrelsen 200-300 nm i diameter (figur 1A). Forkert adskilte dråber kan vise små toppe omkring 1 μm. Disse løsninger kan yderligere bade sonikeres for at bryde de større dråber op. Dråbernes størrelse vil stige over tid på grund af sammensmeltning og / eller diffusion i en proces kendt som Ostwald modning21,22 (figur 1B).

Akustisk modulering af dråberne ved at manipulere billedpulsen forbedrede kontrasten mellem de fordampede PFCnD'er. Dette blev demonstreret i PFCnD-billeder rekonstrueret ved at trække tilstødende rammer af de stråleformede billeder, så kun signalet, der returneres fra fordampet PFCnD, er synligt, og stationært baggrundssignal undertrykkes. Kontrast kvantificeres ved forholdet mellem forskellen mellem gennemsnitlige signaler i det cirkulære inklusionsområde og gennemsnitligt baggrundssignal over gennemsnitligt baggrundssignal. Baggrundssignalet defineres af signalerne fra to rektangulære ROI'er i baggrunden, der har samme dybde og tilsvarende område som indeslutningerne. Kontrasten fra inklusionen for N-pulsen er ca. 3,2 gange større (dvs. 220 % forbedring) end P-pulsen (figur 5).

Den omvendte billeddannelsespuls øgede også signalets levetid fra PFCnD-fordampning. Dette blev kvantificeret ved at begrænse pixels i det cirkulære inklusionsområde, der overstiger baggrundssignalet. Procentdelen af pixels i inklusionen, der var over tærsklen, blev defineret som det hyperechoiske område (%). For at undersøge PFCnD'ernes hyperechogene opførsel over tid beregnes hyperechoisk område for hver ramme og normaliseres af det hyperechoiske område af den første ramme og monteres derefter på en eksponentiel henfaldsmodel. Denne funktion blev brugt til at bestemme den karakteristiske henfaldstid, defineret som det tidsrum, det tager for det hyperechoiske område efter PFCnD-aktivering at henfalde til kun 10% af det oprindelige areal (figur 6a). Den karakteristiske henfaldstid for normaliseret hyperechoisk område er op til 3,5 gange længere i N-pulsbilleddannelse sammenlignet med P-puls. Repræsentative B-mode differentielle billedrammer i tide for hver N-puls og P-puls billeddannelse er vist i figur 6b.

Figure 1
Figur 1: DLS-størrelsesmålinger af PFCnD'er og stabilitet. (A) Størrelsesintensitetsfordelingen af dråber i gennemsnit fra tre målinger af dråber efter syntese (gennemsnitlig PDI: 0,132± 0,016; gennemsnitligt Z-gennemsnit: 259,3 ± 0,7 nm). (B) Størrelsesintensitetsfordelingen af dråber i gennemsnit fra tre målinger foretaget 24 timer efter syntese (gennemsnitlig PDI: 0,252± 0,061; gennemsnitligt Z-gennemsnit: 322,5 ± 4,5 nm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Billede og skema af polyacrylamid skimmel. (A) Billede af formen lavet af laboratorietape og plastbeholderen. (B) Skematisk med målinger af polyacrylamid fantomet efter fjernelse fra skimmelsvamp. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Et skema over laserpulslevering og ultralydsbilleddannelse . (A) Komponenter i enheden er mærket, og laserstråle / ultralydsbilleddannelsesplanjustering i forhold til inklusionspositionen er illustreret. (B) Et billede, der viser den faktiske opsætning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Simuleret ultralydsbilledpuls. Bølgeformerne simuleres ved hjælp af ultralydsbilleddannelsessystemsoftware, samplet af 250 MHz. Bølgeformen af P-puls og N-puls genereres med samme centerfrekvens og pulsbredde, men har 180 ° faseforskel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Kontrastmåling. Gennemsnitlig kontrastværdi for inklusionsområde for N-puls og P-puls, fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Karakteristisk henfaldskurve for hyperechoisk område og repræsentative differentielle B-mode magikere . (A) Normaliseret hyperechoisk område induceret af PFCnD-aktivering over tid til N-puls- og P-pulsbilleddannelse i samme tværsnit. Den stiplede linje angiver 10% af det oprindelige hyperechoiske område. Det tidspunkt, hvor det monterede plot skærer med den stiplede linje, repræsenterer den karakteristiske henfaldstid. (B) Billeder viser et beskåret ROI-vindue centreret om inkluderingen, plottet på en dB-skala med et dynamisk område på 35. Den øverste række viser den rekondenserende funktion, der er afbildet af P-pulsen, og den nederste række viser N-pulsen. Den gulfarvede stiplede linje angiver inklusionsområdet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Samlet volumen af Phantom (ml) 50 100 250 500
DI vand (ml) 37.5 74.9 187.4 375
40% PA-opløsning (ml) 12.5 25.1 62.6 125
Silica (mg) 100 200 500 1000
10% APS-opløsning (μL) 500 1000 2500 5000
TEMED (μL) 62.5 125 312.5 625

Tabel 1: Oversigt over reagenser og mængder for polyacrylamid fantomkrydsbinding baseret på formvolumen. Denne tabel giver en kortfattet værdioversigt over de anvendte reagenser og mængder baseret på flere almindelige formvolumener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sonde sonikering er en relativt enkel og let at lære metode til at fremstille PFCnD'er. Der er et par trin, hvor der skal udvises forsigtighed. Ved håndtering af chloroform er det bydende nødvendigt, at der anvendes en positiv forskydningspipette eller glassprøjter, da den er flygtig og vil "lække" fra standard luftforskydningspipetter. Hvis du bruger en positiv forskydning, skal du desuden sikre dig, at der anvendes en passende spids, da chloroform opløser de fleste plastspidser, hvilket kan indføre forurenende stoffer i opløsningen. En positiv fortrængningspipette eller glassprøjte anbefales også til perfluorhexan, da den er både flygtig og tættere end vand. Typisk kan de individuelle virkninger af volatilitet og høj densitet reduceres ved forvædning i luftforskydningspipetter og ved hjælp af en skala til at justere volumenet på pipetten. Men i tilfælde af perfluorhexan, der besidder begge egenskaber, vil volatiliteten gøre det vanskeligt at opnå nøjagtige vægtmålinger, hvilket gør en positiv forskydningspipette / glassprøjte til den mest levedygtige mulighed.

Før sonde sonikering af opløsningen er det vigtigt at inkubere lipid- og perfluorcarbonopløsningen i et isbad for at lade det køle ned for at forhindre kogning af perfluorcarbonet under sonikering. Dette trin vil være særligt vigtigt for lavere kogende perfluorcarbon, såsom perfluoropentan. Desuden skal man være forsigtig, når sonden sonikerer opløsningen. Sonikeringssondespidsen skal nedsænkes, men den bør ikke komme i kontakt med bunden eller siderne af glashætteglasset, da det kan beskadige spidsen og knuse hætteglasset og tømme lipidopløsningen i isbadet.

PFCnD-fabrikationsprotokollen kan tilpasses på et par mindre måder. Hvis en roterende fordamper ikke er tilgængelig i trin 1.3, kan opløsningen tørres med en jævn strøm af nitrogengas eller anbringes i et vakuumkammer natten over for at danne lipidkagen. Med hensyn til lipiderne anvender denne formulering et 9: 1-forhold mellem DSPE-PEG: DSPC sammenlignet med standard 1: 9-forholdet mellem DSPE-PEG: DSPC, fordi det resulterer i mindre og mere størrelse stabile dråber23. Denne formulering kan tilpasses for at muliggøre overfladekonjugation ved at erstatte en lille brøkdel (~ 2 mol %) af DSPE-PEG med en funktionaliseret DSPE-PEG med den ønskede del (f.eks. Biotin, thiol, amin osv.).

Generelt er sondesonikator kommercielt tilgængelige, relativt enkle at bruge og kan let tilpasses andre perfluorcarboner med højere kogepunkt og overfladeaktive formuleringer, men det kan ikke bruges til at fremstille dråber med perfluorcarbonkerner, der er gasformige ved stuetemperatur uden væsentlige ændringer. En sådan modifikation er at udnytte sonde sondation til at skabe mikrobobler og derefter anvende tryk og reducere temperaturen for at kondensere mikroboblerne til dråber24. Selvom denne metode er en smart måde at generere akustisk fordampende dråber på, er det svært at indkapsle nok farvestof i mikroboblerne for at sikre ODV efter kondens. En alternativ tilgang er at konjugere farvestoffet (f.eks. Cy7.5) til lipiderne og danne mikrobobler, som kan kondenseres ned i ODV-kompatible PFCnD'er med lavt kogepunkt25.

Sonde sonikering producerer også en høj koncentration af nanodråber (~ 1010 dråber / ml) på relativt kort tid. Denne teknik resulterer imidlertid i en stor størrelsesfordeling, der reducerer mængden af nanodråber, der ekstravaserer. Mens dette kan forbedres gennem centrifugalfiltrering eller sprøjtefiltre for at fjerne større dråber, vil de resulterende PFCnD'er udvise større polydispersitet sammenlignet med dråber syntetiseret ved hjælp af mikrofluidik eller filtreret gennem ekstrudering26. En anden ulempe ved sondesonikering er, at sonikeringssondespidsen uundgåeligt vil blive udstenet fra kavitation under sonikering og skal udskiftes med jævne mellemrum.

En alternativ tilgang til oprettelse af dråber bruger mikrofluidiske enheder, som kan bruges til at skræddersy dråber til en bestemt størrelse med et lavt polydispersitetsindeks (PDI). Disse enheder producerer imidlertid dråber med en relativt langsom hastighed (~ 104-10 6 dråber / s)26 og mens der har været flere udviklinger såsom trinemulgering 27, tipstreaming i flowfokuseringsenheder28,29 og udnyttelse af ouzo-effekten med en forskudt sildebensmikromixer30 - Generering af nanosized dråber er stadig udfordrende. Desuden er denne teknik ikke kommercielt tilgængelig, og fremstillingen af disse enheder kræver specialiseret ekspertise.

Andre metoder, der er kommercielt tilgængelige, omfatter ekstrudering og homogenisering. Ekstrudering bruger membraner til at passere dråber igennem, hvilket resulterer i dråber i nanostørrelse med et smallere størrelsesområde sammenlignet med sonikering. Denne metode er imidlertid stærkt formuleringsafhængig og er udfordrende at inkorporere farvestof eller terapeutisk last i dråben26. Højtrykshomogenisering gør brug af kommercielt tilgængelige homogenisatorer, der bruger højtryks- og forskydningsspænding til at generere monodisperse, nanoskala lipidpartikler på en skalerbar måde31,32,33. Denne metode er blevet tilpasset til at skabe dråber med perfluorcarboner med højt og lavt kogepunkt32,34. En mere omfattende gennemgang af dråbeformuleringsmetoder og prøveprotokoller findes i den følgende gennemgang26.

Fantomer er et værdifuldt værktøj til at karakterisere udførelsen af nanodråber in vitro. I denne protokol anvendes polyacrylamidbaserede fantomer med silica. De hyppigste problemer med polyacrylamid fantomer er relateret til langsom eller ingen polymerisation. Langsom polymerisation, selvom den er mindre problematisk, kan føre til heterogen fordeling af indlejret spredning. Den mest almindelige synder for dette problem er brugen af gamle opløsninger af ammoniumpersulfat, der reducerer produktionen af frie radikaler, der initierer tværbindingen. Dette kan let løses ved at gøre opløsningen frisk eller ikke bruge tilberedte opløsninger, der er ældre end en uge. En anden mulighed er nedbrydningen af TEMED - dette vil være tydeligt i dannelsen af et gult bundfald. Et andet almindeligt problem er tilstedeværelsen af luftbobler i det polymeriserede fantom. Korrekt afgasning af vandet og omhyggelig håndtering for at undgå overskydende overfladeomrøring bør afbøde dette problem. En alternativ strategi ville være at afgasse hele løsningen efter trin 2.5. Dette skal dog udføres i en røghætte på grund af tilstedeværelsen af acrylamid.

Disse fantomer er også fremragende til at forestille sig adfærden af begrænsede dråber for at studere individuel dråbeadfærd; dette kan gøres ved at tilføje PFCnD'er i fantomet på trin 2.4. Da tværbindingen skyldes en kemisk reaktion, produceres der desuden relativt lidt varme sammenlignet med en fysisk tværbinding baseret på en øvre kritisk opløsningstemperatur som gelatine. Dette reducerer sandsynligheden for spontan fordampning af de indlejrede dråber.

Mens der er en række forskellige metoder til syntetisering af fantomer, producerer polyacrylamid et relativt holdbart og ikke-nedbrydeligt fantom, der har lav akustisk dæmpning35 og optisk absorptionskoefficient36. Disse egenskaber kan indstilles til nærmere at efterligne de akustiske og optiske egenskaber af humant væv ved at justere koncentrationen af den endelige polyacrylamid opløsning og gennem inkludering af partikler i fantomet, såsom silica, glasperler eller titandioxid36. Desuden kan fantomernes mekaniske egenskaber justeres ved at ændre procentdelen af polymerindholdet (dvs. procentdelen af acrylamid og bis(acrylamid)) og procentdelen af tværbindinger (dvs. procentdelen af bis(acrylamid) i det samlede polymerindhold)37. Alternative fantomer omfatter, men er ikke begrænset til, agar38, gelatine39, polyvinylalkohol (PVA)40 osv.

De kritiske trin for en vellykket billeddannelse af aktiveret PFCnD-distribution og hyperechogen dynamik er som følger. 1) Synkroniser lasersystemet (aktiveringskilde) og ultralydsbilleddannelsessystemet. 2) Juster lasertværsnittet både med målområdet af interesse og med ultralydsbilleddannelsesplan. 3) Juster ultralydsbilleddannelsesparametre, der er korrekte til PFCnD-billeddannelse (dvs. framerate, pulsbølgeform osv.).

Den optiske aktivering af PFCnD har en mærkbar fordel i forhold til akustisk aktiverede, at den kan undgå den akustiske interferens, som drastisk forringer kvaliteten af ultralydsbilledet, mens den observerer dens rekondenserende fase i tide. Det er imidlertid udfordrende at integrere og justere lasersystemet med ultralydsbilleddannelsessystemet både rumligt og tidsmæssigt. Brugen af en 3D-printet holder giver mulighed for gentagelig og kontrolleret lyslevering. Lysleveringen kan også fejlfindes ved at indsætte en metalstang i inkluderingen i polyacrylamid fantomet, da metalstangen skal producere fotoakustisk kontrast for at indikere lyslevering. Temporal synkronisering blev opnået ved at bygge ud fra en tidligere udviklet platform20, som giver mulighed for både synkronisering af lasing- og billedbehandlingssystemet, samtidig med at den fulde programmerbarhed af Verasonics billedbehandlingssystem med en brugervenlig grænseflade bevares. Derudover giver programmet konventionel B-tilstandsbilleddannelse i realtid og fotoakustisk billeddannelse for at hjælpe med fejlfinding og lokalisering af det interesseområde, hvor PFCnD'er distribueres. Denne opsætning kræver dog en ekstern nanosekund pulserende laser. I øjeblikket er der, så vidt vi ved, et par kommercielle systemer, der har integreret laser-ultralydsbilleddannelsessystemer, der kan give mulighed for PFCnD-billeddannelse, f.eks. Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 og iTheraMedical (indsigt 64, inVision 128, inVision 256-TF og inVision 512-echo).

Den ultrahurtige ultralydsbilleddannelse af PFCnD's fordampnings-rekondenserende opførsel lider hovedsageligt af lav følsomhed. Mens de mest almindelige løsninger til forbedring af billedfølsomhed inkluderer multi-frame-sammensætning, er disse teknikker begrænset af deres iboende egenskab ved at nedbryde billedhastigheden, da PFCnD-billeddannelsen er meget sårbar for bevægelsesartefakter, idet den inkluderer tidsdifferentiel proces. Pulspolaritetsmodulationen i vores protokol løser effektivt dette problem i PFCnD-billeddannelse ved at udnytte den akustiske dynamik i fordampede PFCnD'er til at have mere diskriminerende og langvarigt billede, mens det slet ikke påvirker den tidsmæssige opløsning.

Mens ODV giver mulighed for dråber med unikke muligheder såsom gentagen fordampning og fotoakustisk kontrast, har aktiveringsmetoden begrænset dybdeindtrængning i forhold til ultralyd. Da lyspenetration er begrænset, begrænser dette applikationerne til hovedsageligt overfladiske procedurer såsom en erstatning for sentinel lymfeknudebiopsi41. Denne begrænsning kan potentielt omgås gennem kateterbaserede lysleveringssystemer, hvilket giver mulighed for aktivering dybt i væv. Da kontrasten er akustisk, vil fordampning kunne afbildes i dybde, der kan sammenlignes med ADV. En alternativ aktiveringsteknik kan være magnetisk dråbefordampning, hvor magnetiske kontrastmidler såsom jernoxidnanopartikler er indkapslet i dråben42. Dette vil muliggøre fordampning på enhver dybde.

I fremtiden kan vores protokols evne til at afbilde og modulere det hyperechogene respons af PFCnD på samme tid bruges til flere applikationer, hvor overvågning og manipulation af PFCnD er påkrævet. For eksempel kan længere detekterbar tid forbedre billedkvaliteten af superopløsningsbilleddannelse ved at give et større antal billeder til gennemsnittet. Desuden har mere præcis kontrol af PFCnD potentiale til at øge effektiviteten og sikkerheden af boblemedierede terapier såsom BBB-åbning og lægemiddelafgivelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Arbejdet blev delvist støttet af Breast Cancer Research Foundation under bevilling BCRF-20-043.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics - ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research - Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics - research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd - Makes size measurements based on dynamic light scattering

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
  2. Lee, H., et al. Microbubbles used for contrast enhanced ultrasound and theragnosis: a review of principles to applications. Biomedical Engineering Letters. 7 (2), 59-69 (2017).
  3. Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (8), 4607-4612 (1998).
  4. Ishida, O., Maruyama, K., Sasaki, K., Iwatsuru, M. Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice. International Journal of Pharmaceutics. 190 (1), 49-56 (1999).
  5. Wong, Z. Z., Kripfgans, O. D., Qamar, A., Fowlkes, J. B., Bull, J. L. Bubble evolution in acoustic droplet vaporization at physiological temperature via ultra-high speed imaging. Soft Matter. 7 (8), 4009 (2011).
  6. Yu, J., Chen, X., Villanueva, F. S., Kim, K. Vaporization and recondensation dynamics of indocyanine green-loaded perfluoropentane droplets irradiated by a short pulse laser. Applied Physics Letters. 109 (24), 243701 (2016).
  7. Kripfgans, O. D., Fowlkes, J. B., Miller, D. L., Eldevik, O. P., Carson, P. L. Acoustic droplet vaporization for therapeutic and diagnostic applications. Ultrasound in Medicine & Biology. 26 (7), 1177-1189 (2000).
  8. Aliabouzar, M., Kumar, K. N., Sarkar, K. Acoustic vaporization threshold of lipid-coated perfluoropentane droplets. The Journal of the Acoustical Society of America. 143 (4), 2001-2012 (2018).
  9. Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir. 27 (17), 10412-10420 (2011).
  10. Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
  11. Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered nanodroplet vaporization for contrast-enhanced imaging. Nature Communications. 3 (1), 618 (2012).
  12. Strohm, E., Rui, M., Gorelikov, I., Matsuura, N., Kolios, M. Vaporization of perfluorocarbon droplets using optical irradiation. Biomedical Optics Express. 2 (6), 1432 (2011).
  13. Wei, C., et al. Laser-induced cavitation in nanoemulsion with gold nanospheres for blood clot disruption: in vitro results. Optics Letters. 39 (9), 2599 (2014).
  14. Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: Dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2014).
  15. Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 3671 (2014).
  16. Hannah, A. S., Luke, G. P., Emelianov, S. Y. Blinking phase-change nanocapsules enable background-free ultrasound imaging. Theranostics. 6 (11), 1866-1876 (2016).
  17. Santiesteban, D. Y., Hallam, K. A., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Color-coded perfluorocarbon nanodroplets for multiplexed ultrasound and photoacoustic imaging. Nano Research. 12 (4), 741-747 (2019).
  18. Luke, G. P., Hannah, A. S., Emelianov, S. Y. Super-resolution ultrasound imaging in vivo with transient laser-activated nanodroplets. Nano Letters. 16 (4), 2556-2559 (2016).
  19. Zhu, Y. I., Yoon, H., Zhao, A. X., Emelianov, S. Y. Leveraging the imaging transmit pulse to manipulate phase-change nanodroplets for contrast-enhanced ultrasound. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (4), 692-700 (2019).
  20. Yoon, H., Zhu, Y. I., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Design and demonstration of a configurable imaging platform for combined laser, ultrasound, and elasticity imaging. IEEE Transactions on Medical Imaging. 38 (7), 1622-1632 (2019).
  21. Taylor, P. Ostwald ripening in emulsions. Advances in Colloid and Interface Science. 75 (2), 107-163 (1998).
  22. Freire, M. G., Dias, A. M. A., Coelho, M. A. Z., Coutinho, J. A. P., Marrucho, I. M. Aging mechanisms of perfluorocarbon emulsions using image analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 224-232 (2005).
  23. Yarmoska, S. K., Yoon, H., Emelianov, S. Y. Lipid shell composition plays a critical role in the stable size reduction of perfluorocarbon nanodroplets. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (6), 1489-1499 (2019).
  24. Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
  25. Lin, S., et al. Optically and acoustically triggerable sub-micron phase-change contrast agents for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. Photoacoustics. 6, 26-36 (2017).
  26. Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
  27. Shui, L., vanden Berg, A., Eijkel, J. C. T. Scalable attoliter monodisperse droplet formation using multiphase nano-microfluidics. Microfluidics and Nanofluidics. 11 (1), 87-92 (2011).
  28. Jeong, W. -C., et al. Controlled generation of submicron emulsion droplets via highly stable tip-streaming mode in microfluidic devices. Lab on a Chip. 12 (8), 1446 (2012).
  29. Xu, X., et al. Microfluidic production of nanoscale perfluorocarbon droplets as liquid contrast agents for ultrasound imaging. Lab on a Chip. 17 (20), 3504-3513 (2017).
  30. Song, R., Peng, C., Xu, X., Zou, R., Yao, S. Facile fabrication of uniform nanoscale perfluorocarbon droplets as ultrasound contrast agents. Microfluidics and Nanofluidics. 23 (1), 12 (2019).
  31. Liedtke, S., Wissing, S., Müller, R. H., Mäder, K. Influence of high-pressure homogenisation equipment on nanodispersions characteristics. International Journal of Pharmaceutics. 196 (2), 183-185 (2000).
  32. Reznik, N., Williams, R., Burns, P. N. Investigation of vaporized submicron perfluorocarbon droplets as an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1271-1279 (2011).
  33. Grapentin, C., Barnert, S., Schubert, R. Monitoring the stability of perfluorocarbon nanoemulsions by cryo-TEM image analysis and dynamic light scattering. Plos One. 10 (6), 0130674 (2015).
  34. de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
  35. Zell, K., Sperl, J. I., Vogel, M. W., Niessner, R., Haisch, C. Acoustical properties of selected tissue phantom materials for ultrasound imaging. Physics in Medicine and Biology. 52 (20), 475-484 (2007).
  36. Hariri, A., et al. Polyacrylamide hydrogel phantoms for performance evaluation of multispectral photoacoustic imaging systems. Photoacoustics. 22, 100245 (2021).
  37. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the range of polyacrylamide gel stiffness for mechanobiology applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  38. Rajagopal, S., Sadhoo, N., Zeqiri, B. Reference characterisation of sound speed and attenuation of the iec agar-based tissue-mimicking material up to a frequency of 60 MHz. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (1), 317-333 (2015).
  39. Madsen, E. L., Zagzebski, J. A., Banjavie, R. A., Jutila, R. E. Tissue mimicking materials for ultrasound phantoms. Medical Physics. 5 (5), 391-394 (1978).
  40. Kharine, A., et al. Poly(vinyl alcohol) gels for use as tissue phantoms in photoacoustic mammography. Physics in Medicine and Biology. 48 (3), 357-370 (2003).
  41. Kim, H., Chang, J. H. Multimodal photoacoustic imaging as a tool for sentinel lymph node identification and biopsy guidance. Biomedical Engineering Letters. 8 (2), 183-191 (2018).
  42. Zhou, Y., et al. Magnetic nanoparticle-promoted droplet vaporization for in vivo stimuli-responsive cancer theranostics. NPG Asia Materials. 8 (9), 313 (2016).

Tags

Bioengineering udgave 173 ultralyd perfluorcarbon nanodråber nanodråber kontrastmidler emulsion nanopartikel fotoakustisk faseændring
Formulering og akustisk modulering af optisk fordampede perfluorcarbon nanodråber
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S.… More

Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter